Echinakosid stimulerar cellproliferation och förhindrar cellapoptos i intestinala epitelial MODE-K-celler genom uppreglering av transformerande tillväxtfaktor- 1 uttryck

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo och Caigan Du

Abstrakt

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) har använts i stor utsträckning som ett laxermedel i örtmedicin för behandling av colon irritabile eller förstoppning, ochechinacoside från cistanche(ECH) är en av de viktigaste bioaktiva ingredienserna i denna ört. Vårt mål var att undersöka effekten av ECH på intestinal epitelcelltillväxt och död. MODE-K, en intestinal epitelcellinje, användes som en in vitro-modell av tarmen. Cellproliferation mättes med metyltiazoltetrazolium (MTT) analys. Cellapoptos bestämdes med Annexin-V-färgning. Här visade vi att i odlade MODE-K-celler stimulerade ECH signifikant cellproliferation och förbättrade cellöverlevnad genom att minska cellapoptos i närvaro av H2O2 eller blandningen av pro-inflammatoriska cytokiner, samtidigt som tillväxtfaktorn (TGF) transformerades- 1 uttrycket uppreglerades på ett dosberoende sätt. Nedbrytning av TGF- 1-uttryck störde både de proliferativa och cytoprotektiva aktiviteterna hos ECH, vilket ytterligare bekräftades genom neutralisering av TGF- 1-aktivitet med hjälp av anti-TGF- 1-antikropp. Dessa data tyder på att ECH som en av de bioaktiva ingredienserna i växtbaserade C. deserticola och andra kan förbättra slemhinnevävnadsreparation genom att stimulera tarmepitelcellsproliferation och förhindra celldöd via uppreglering av TGF-.

Nyckelord: Cistanche deserticola, tarmepitel, cellproliferation, cellapoptos, transformerande tillväxtfaktor (TGF)-

Introduktion

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) är allmänt känd som Rou Cong Rong i kinesisk örtmedicin, och den har blivit en ny gröda i Kina på grund av dess medicinska användning (1). Dess kliniska fördelar har rapporterats vid behandling av många hälsoproblem inklusive kronisk förstoppning (2, 3) och dess fördelaktiga effekter är förknippade med dess laxerande aktivitet i tarmen; det förbättrar fukten av avföringen, främjar tarmrörelsen hos patienter (4, 5), såväl som i djurmodeller (6, 7). Vår färska studie visar att oral administrering av ett vattenextrakt av C. deserticola signifikant minskar antalet inflammatoriska hyperplasi i tarmen hos möss med benägna kolorektal cancer (8).

Echinacoside från cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50 procent av det totala PhG) isolerat från C. deserticola (9) och har använts som en biomarkör för kvalitetskontroll av C. deserticola-innehållande laxermedel Ronggui Tongbian Capsule (10) eller för produktionskvalitetskontroll av odlad C. deserticola (11). ECH har visats vara cytoskyddande både i en djurmodell av Parkinsons sjukdom (12, 13) och en modell av lungskada (14) och i odlade feokromocytomceller (PC12) (15, 16); och det har visat sig förbättra celldelningen av humana fibroblastiska celler (MRC-5) (17). I denna studie undersöktes effekten av ECH som en viktig bioaktiv ingrediens i C. deserticola på cellproliferation och överlevnad i odlade tarmepitelceller för att förstå den farmakologiska effekten av C. deserticola-innehållande örtmedicin vid behandling av tarmsjukdomar .

Material och metoder

Cell kultur

MODE-K är en intestinal epitelcellinje härledd från C3H/HeJ-möss (18) som vänligen tillhandahållits av Dr Theodore Steiner (Vancouver Coastal Health Research Institute, Vancouver, Kanada). MODE-K-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS) vid 37 grader under 5 procent CO2 i luftatmosfär.

echinacoside från cistanche (ECH) förberedelse

ECH (echinacoside från cistanche) renades ytterligare från kommersiellt C. tubulosa-extrakt (innehållande mer än eller lika med 70 procent ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina) genom upprepad etanolextraktion, följt av luft- torkning i en kemisk dragskåp. Den återstående substansen torkades ytterligare genom lyofilisering. ECH i slutprodukten bekräftades genom högpresterande vätskekromatografi (fig. 1).

Nedbrytning av uttryck för transformerande tillväxtfaktor (TGF)- 1

TGF- 1-uttryck i MODE-K-celler slogs ned genom stabilt uttryck av shRNA specifikt mot TGF- 1-transkript (19). I korthet, oligonukleotidsekvenser för generering av shRNA-inriktad mus-TGF- 1-mRNA (5'-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3') och icke-specifik kontroll (förvrängd) (5'-AAT CGC ATA GCG TAT GCC GTT-3′) har beskrivits tidigare (19, 20), och de syntetiserades av Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA). Varje sekvens ligerades in i en pHEX-siRNA-vektor (21). Vektorerna transfekterades in i MODE-K-celler med användning av Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Både anti-TGF- 1 shRNA-transfekterade (MODE-Ktgfb) och förvrängda shRNA-transfekterade (MODE-Kscr) celler odlades i närvaro av Zeocin (upp till 500 ug/ml) (Invitrogen-Gibco) och selekterades genom cellsortering med flödescytometri för grönt fluorescensprotein (GFP). Mer än 95 procent av de transfekterade cellerna visade stark grön fluorescens i flödescytometri eller mikroskopi.

Metyltiazoltetrazolium (MTT) analys

MTT-analysen användes för att mäta cellproliferation eller livsduglighet i kulturer. Celler såddes vid 25 00 per brunn i 96-brunnsmikroplattor, och varje tillstånd testades åtminstone i fyrdubbla exemplar. I korthet, 10 μL av 0,5 mg/ml av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Kanada) sattes till varje brunn och inkuberades vid 37 grader i 4 timmar. Formazankristallerna i livskraftiga celler löstes sedan i 100 μL/brunn av dimetylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich Kanada). Absorbansen av färgen i varje brunn kvantifierades som absorbansenheter (AU) vid 560 nm våglängd med användning av en ELx808 Ultra Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT, USA). Procentandelen cellproliferationsförändring i läkemedelsbehandlade kulturer mot icke-läkemedelsbehandlad kontroll beräknades enligt följande: procent=(läkemedelsbehandlad − Kontroll) / Kontroll × 100 procent. Tillväxthastigheten beräknades enligt följande: Tillväxthastighet (AU/dag)=(AUend − AUbegin) / tid (dag), där tiden representerade undersökningsperioden, AUend representerade absorbansenheterna i slutet av undersökningen och AU börjar representerade absorbansenheterna i början av undersökningen.

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys av apoptos

FACS-analys med Annexin-V-phycoerytrin (Annexin-V-PE) och 7-amino-actinomycin D (7-AAD)-färgning användes för bestämning av cellapoptos (Annexin-V-positiv: tidig apoptos ; 7-AAD: sen apoptos/nekrotisk) enligt tillverkarens protokoll (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). I FACS-grafen fanns alltså livsdugliga celler i den nedre vänstra kvadranten, sena apoptotiska celler i den övre vänstra kvadranten (7-endast AAD-positiva), apoptotiska celler i den övre högra kvadranten (Både Annexin-V och {{ 10}}AAD-positiva) och tidiga apoptotiska celler i den nedre högra kvadranten (endast Annexin-V-positiv). Kort sagt, efter behandling frigjordes cellerna genom kort inkubation med trypsin-EDTA-lösning (Sigma Aldrich Canada) och inkuberades sedan med Annexin-V-PE i 1 x bindningsbuffert i 15 minuter. Efter att de tvättats med PBS färgades cellerna med 7-AAD. Intensiteten av fluorescens av apoptotiska celler mättes med flödescytometri och analyserades jämfört med bakgrundskontroller med CELLQUEST (BD Biosciences) eller FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Semikvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR)

mRNA-nivåerna av TGF {{0}} bestämdes semikvantitativt jämfört med de för glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenas (GAPDH) som en intern kontroll med användning av RT-PCR-kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) såsom beskrivits tidigare (19). Både TGF- 1- och GAPDH-transkript i samma cDNA-preparat amplifierades med PCR med 35 cykler av 94 grader i 1 min, 57 grader i 1 min och 15 s och 72 grader i 1 min och 30 s efter den initiala denatureringssteg vid 94 grader i 1 min. Ett sista förlängningssteg vid 72 grader under 10 minuter tillsattes. De specifika primerparen för TGF- 1 och GAPDH härleddes från en tidigare rapport (19) (mTGF- 1: sense, 5'-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC och antisense, 5 ′-CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: sense, 5'-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G, och antisense, 5'-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Den resulterande PCR-produkten (25 μL) utsattes för elektrofores på en 1 procent agarosgel i Tris-acetat-EDTA (TAE)-buffert innehållande 0,5 ug/ml etidiumbromid och visualiserades under UV-ljus. Expressionsnivåerna för TGF- 1 jämfördes semikvantitativt med de för GAPDH.

Western blot

Cellulära nivåer av TGF- 1 undersöktes med western blotting som beskrivits tidigare (19). TGF- 1-proteinband i blotten identifierades med monoklonal anti-TGF- 1 (A75-3) (BD Biosciences). Samma blöt undersöktes igen med anti-aktin IgG (Sigma-Aldrich Canada) för bekräftelse av laddat protein i varje prov.

Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) Nivåerna av utsöndrad TGF- 1 i kultursupernatanter bestämdes med ELISA. MODE-K-celler (1,8 × 105 celler/brunn i 0,5 mL DMEM-medium) i 24-brunnsplattor i triplikat odlades över natten, följt av inkubation i frånvaro eller närvaro av ECH(echinacoside från cistanche). Odlingssupernatanterna samlades in efter 24 timmars behandling och mängden TGF- 1-frisättning bestämdes med användning av TGF 1 Emax® ImmunoAssay System enligt tillverkarens protokoll (Promega, Madison, WI, USA).

Statistiska analyser

Envägs- eller tvåvägsvariansanalys (ANOVA) användes som lämpligt för jämförelser mellan grupper. Data samlades in från 3 till 4 individuella experiment i varje studie för statistisk analys. Ett P-värde på mindre än eller lika med 0.05 ansågs signifikant.

Resultat

Stimulering av cellproliferation i MODE-K cellkulturer

Cellproliferation är avgörande för vävnadsreparation. Effekten av ECH(echinacoside från cistanche)på cellproliferation undersöktes i odlade MODE-K-celler. Såsom visas i Fig. 2A stimulerade tillsatsen av ECH cellproliferation, mätt genom ökningen av cellviabilitet med användning av MTT-analys, på ett dosberoende sätt. Jämfört med cellantalet i icke läkemedelsbehandlade kulturer, ökade cellantalet i ECH-behandlade odlade 25,6 procent ± 14,82 procent i kulturer med 6,26 ug/mL ECH, 33,6 procent ± 14,0 procent med 25 ug/mL ECH, 64,4 procent ± 9,0 procent med 50 ug/mL ECH, och 99,4 procent ± 11,7 procent med 100 ug/ ml ECH efter 48-h inkubation (P < 0.0{{50}}01).="" för="" att="" ytterligare="" bekräfta="" denna="" observation="" undersöktes="" effekten="" av="" ech="" på="" mode-k-celltillväxtkurvan="" under="" en="" tidsperiod="" på="" {{30}}dagar.="" som="" visas="" i="" fig.="" 2b="" ökade="" tillsatsen="" av="" optimerad="" 10="" ug/ml="" ech="" signifikant="" antalet="" viabla="" celler="" efter="" inkubationstiden="" jämfört="" med="" de="" i="" icke-läkemedelsbehandlade="" kulturer="" (en="" basal="" kontroll),="" indikerat="" av="" ökningen="" av="" au="" för="" kulturer="" med="" ech="" från="" 0.3{{70}}="" ±="" 0.02="" i="" början="" av="" ech-behandling="" (0-tidpunkt)="" till="" 1,49="" ±="" 0,08="" efter="" 2="" dagars="" inkubation="" och="" 2,20="" ±="" 0,11="" efter="" 4="" dagars="" inkubation,="" medan="" ökningen="" för="" de="" icke-läkemedelsbehandlade="" kulturerna="" (endast="" medium)="" var="" från="" 0,24="" ±="" 0,01="" i="" början="" till="" 1,22="" ±="" 0,12="" efter="" 2="" dagar="" och="" ±1.68="" dagar.="" efter="" 4="" dagar="" (medium="" vs.="" ech,="" p="">< 0,0001).="" tillväxthastigheterna="" i="" dessa="" två="" kulturer,="" beräknade="" baserat="" på="" tillväxtkurvan="" (fig.="" 2b),="" indikerade="" att="" ech="" signifikant="" ökade="" tillväxthastigheterna="" i="" kulturer="" vid="" både="" dag="" 2="" (0,56="" i="" ech-behandlade="" kulturer="" mot="" 0,35="" i="" icke-läkemedelsbehandlade="" kontroller)="" och="" dag="" 3="" (0,43="" i="" ech-behandlade="" kulturer="" mot="" 0,22="" i="" icke-läkemedelsbehandlade="" kontroller)="" (fig.="" 2c).="" sammantaget="" indikerar="" dessa="" data="" att="" ech="" stimulerar="" cellproliferation="" i="" odlade="">

Fig. 2. Stimulering av celltillväxt i odlade tarmepitelceller med ECH. MODE-K-celler (2,500 celler/brunn) såddes i 96-brunnsplattor över natten, följt av inkubation i närvaro eller frånvaro av ECH. Antalet viabla celler i kulturer mättes med MTT-analys. A) Kulturer behandlades med olika koncentrationer av ECH i 48 timmar. Ökningen (procent) i cellantal i ECH-behandlade kulturer beräknades baserat på de icke-läkemedelsbehandlade kulturerna som basreferens. P < 0,0001="" (envägs="" anova).="" b)="" kulturer="" behandlades="" med="" 10="" ug/ml="" ech="" under="" 4="" dagar.="" tillväxtkurvor="" för="" ech-behandlade="" kontra="" icke-läkemedelsbehandlade="" kulturer="" (endast="" medium)="" bestämdes="" av="" absorbansenheterna="" (au)="" vid="" 560="" nm="" i="" mtt-analysen.="" p="">< 0,0001="" (medium="" vs.="" ech,="" tvåvägs="" anova).="" data="" presenteras="" som="" medelvärdet="" ±="" standardavledning="" (sd)="" av="" oberoende="" experiment.="" c)="" tillväxthastighet="" (au="" förändring/dag)="" beräknades="" baserat="" på="" tillväxten="">e, medeltalet för varje dag.

Skydd av MODE-K-celler från apoptos

Att skydda celler från apoptos är en mekanism för att förhindra ytterligare vävnadsskada. Den cytoprotektiva aktiviteten av ECH(echinacoside från cistanche)undersöktes i odlade MODE-K-celler stimulerade med väteperoxid (H2O2) eller pro-inflammatorisk cytokinblandning (TNF- och IFN-). H2O2 är en reaktiv syreart som genereras av oxidativ metabolism och representerar ett scenario av oxidativ stress, medan TNF- och IFN- är framträdande cytokiner som produceras av aktiverade immunceller som återspeglade situationen under den immunmedierade inflammationen. Som visas i Fig. 3 reducerade tillsatsen av ECH (50 ug/ml) signifikant apoptos inklusive dess basala nivå i kulturer behandlade med H2O2, vilket bevisades av en minskning av apoptos från basalnivåerna på 5,3{{47 }} procent ± 1,24 procent i icke-läkemedelsbehandlade kulturer till 3,76 procent ± 1.01 procent i ECH-behandlade kulturer, från 26,93 procent ± 1,86 procent i icke-läkemedelsbehandlade kulturer till 14,08 procent ± 1,30 procent i ECH-behandlade kulturer i närvaro av 0,3 μM H2O2 och från 38,90 procent ± 1,76 procent i icke-läkemedelsbehandlade kulturer till 19,88 procent ± 1,02 procent i ECH-behandlade kulturer i närvaro av 0,6 μM H2O.0 (P <020. ,="" medium/icke-läkemedelsbehandlad="" vs.="" ech-behandlad).="" en="" liknande="" cytoprotektiv="" effekt="" av="" ech="" sågs="" i="" kulturerna="" stimulerade="" med="" cytokinblandning="" (fig.="" 4);="" apoptos="" (51,5="" procent="" ±="" 6,30="" procent)="" i="" kulturer="" utan="" tillsats="" av="" ech="" (medel/icke-läkemedelsbehandlade="" kontroller)="" var="" signifikant="" högre="" än="" den="" (38,50="" procent="" ±="" 5,60="" procent)="" i="" ech-behandlade="" kulturer="" (p="0.0204," medium/icke-läkemedelsbehandlade="" kontra="" ech-behandlade),="" vilket="" tyder="" på="" att="" ech="" skyddade="" mode-k-celler="" från="" pro-inflammatorisk="" cytokininducerad="" apoptos.="" sammantaget="" har="" ech="" cytoskyddande="" aktivitet="" mot="" cellapoptos="" inducerad="" av="" h2o2-oxidation="" såväl="" som="" cytotoxiciteten="" hos="" pro-inflammatoriska="">

Uppreglering av TGF-uttryck i odlade MODE-K-celler

Bevis i litteraturen tyder på att TGF- 1 spelar en viktig roll vid vävnadsskada och reparation (22, 23) och vid återhämtning av mag-tarmkanalen från kolit eller inflammatorisk tarmsjukdom (24). För att undersöka om TGF- 1 spelar en roll i ECH-inducerad cellproliferation och cytoprotektion i odlade tarmepitelceller som visats ovan, kan effekten av ECH(echinacoside från cistanche)på TGF-{0}}-uttryck i odlade MODE-K-celler undersöktes. Transkriptnivåerna av TGF- 1 undersöktes med semikvantitativ RT-PCR, medan dess proteinnivåer bestämdes genom western blotting (totala cellulära nivåer) eller genom ELISA (utsöndrade proteinnivåer). Som visas i Fig. 5A sågs den dosberoende uppregleringen av TGF- 1-mRNA-nivåer i kulturer behandlade med ECH både 24 och 48 timmar efter tillsatsen av ECH. En liknande trend av ökning av TGF{{10}}-proteinnivåer inuti cellerna visades genom western blotting-analys (Fig. 5B). Efter 24-h inkubation i 0,5 ml odlingsmedium innehållande olika koncentrationer av ECH, ökades också de utsöndrade nivåerna av TGF- 1 på ett dosoberoende sätt; från 186,4 ± 18,39 pg/ml i icke-läkemedelsbehandlade kulturer (basala nivåer) till 186,4 ± 18,39 pg/ml i kulturer med 25 ug/ml ECH, 263,4 ± 14,14 pg/ml med 20 ug/mL av ECH.4 och ± 6 ug/mL 15,56 pg/ml med 100 ug/ml ECH (P < 0,0001).="" alla="" dessa="" data="" indikerar="" tydligt="" att="" ech="" ökar="" tgf-="" 1-produktionen="" i="" tarmepitelceller="" i="">

Förlust av tillväxtstimulering och cytoskydd av Echinacoside genom genetisk nedbrytning av TGF- 1-uttryck

För att klargöra om TGF- 1 bidrog till tillväxtstimulering och apoptosminskning i ECH(echinacoside från cistanche)-behandlade celler, TGF- 1-uttryck i MODE-K-celler knockades genom att stabilt uttrycka anti-TGF- 1-shRNA, genom vilket en ny cellinje MODE-Ktgfb genererades. TGF- 1-proteinuttryck reducerades till stor del i MODE-Ktgfb-celler jämfört med det i MODE-Kscr-celler som stabilt uttryckte kodat shRNA (Fig. 6A). Såsom visas i fig. 6B var den proliferativa stimuleringen av ECH signifikant försämrad i MODE-Ktgfb-celler; liknande det proliferativa svaret på ECH i modermode-K-celler (fig. 2), ökades antalet viabla celler i MODE-Kscr-celler efter ECH-stimulering, 28,3 procent ± 12,4 procent ökning i kulturer med 25 ug/ml ECH, 54,2 procent ± 6,8 procent ökning med 5{{30}} ug/mL ECH och 122,7 procent ± 20,8 procent ökning i kulturer med 100 ug/mL ECH. Däremot minskade cellantalet i närvaro av ECH i MODE Ktgfb-cellkulturer, 12,0 procent ± 5,0 procents minskning i kulturer med 25 ug/mL ECH, 18,3 procent ± 4,1 procent minskning med 50 ug/ml ECH, och 30,4 procent ± 3,3 procent minskade med 100 ug/mL ECH. Statistisk analys med tvåvägs ANOVA indikerade den signifikanta skillnaden i proliferativ respons på ECH mellan dessa två grupper (P < 0,0001).="" dessa="" data="" tyder="" på="" att="" förlust="" av="" tgf-="" 1-uttryck="" i="" tarmepitelceller="" försämrar="" tillväxtstimulering="" av="">

För att ytterligare undersöka om det uppreglerade TGF- 1-uttrycket i ECH(echinacoside från cistanche)-behandlade celler resulterade i apoptosreduktion, den anti-apoptotiska aktiviteten av ECH undersöktes i MODE-Ktgfb-celler kontra MODE-Kscr-celler. Som visas i Fig. 6C, jämfört med MODE-Kscr-cellkulturer, var nivåerna av apoptos högre i MODE-Ktgfb-cellkulturer i frånvaro av cytokiner (11,2 procent ± 0,42 procent i MODE-Ktgfb vs. 9,6 procent ± 0,99 procent i MODE-Kscr) och i närvaro av cytokiner (20,95 procent ± 0.07 procent i MODE- Ktgfb mot 15,4 procent ± 1,56 procent i MODE-Kscr) (P=0.0{{60}}13), vilket tyder på att TGF- 1 är en anti -apoptotisk faktor i MODE K-celler. Tillsatsen av ECH (50 ug/mL) till MODE-Kscr-cellkulturer minskade signifikant de basala nivåerna av apoptos (9,6 procent ± 0,99 procent i icke-läkemedelsbehandlade kontra 8,3 procent ± 0,43 procent i ECH-behandlade) och 30,2 procent av apoptosreduktionen hittades i cytokinstimulerade kulturer (15,4 procent ± 1,56 procent i icke-läkemedelsbehandlade kontra 10,75 procent ± 1,05 procent i ECH-behandlade). I MODE-Ktgfb-cellkulturer minskade dock inte ECH de basala nivåerna av apoptos (11,2 procent ± 0,42 procent i icke-läkemedelsbehandlade kontra 12,0 procent ± 0,43 procent i ECH-behandlade), och endast 16,71 procent av apoptosreduktion, jämfört med 30,2 procent i MODE-Kscr-cellkulturer sågs i cytokinstimulerade kulturer (20,95 procent ± 0,07 procent i icke-läkemedelsbehandlade mot 17,45 procent ± 0,35 procent i ECH-behandlade). Dessa data indikerar att nedbrytning av TGF- 1-uttryck i tarmepitelceller förvärrar apoptos och minskar den cytoprotektiva aktiviteten hos ECH.

Förlust av tillväxtstimulering och cytoskydd av ECH(echinacoside från cistanche)genom neutralisering av TGF- 1-aktivitet med hjälp av antikropp

För att ytterligare bekräfta att TGF- 1 kan krävas för tillväxtstimulering och cytoskydd av ECH(echinacoside från cistanche)i tarmepitelceller enligt beskrivningen ovan (Fig. 6), effekten av neutraliserande anti-TGF- 1-antikropp (Clone 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) på ECH-medierad cellproliferation och överlevnad undersöktes i MODE-K cellkulturer. Som visas i Fig. 7A stimulerade tillsatsen av ECH (25 ug/ml) en ökning på 44,3 procent ± 8,2 procent i cellantal i icke-antikroppsbehandlade kontroller, men i närvaro av anti-TGF- 1-antikropp , 11,3 procent ± 9,10 procents förlust av cellantalet sågs i samma ECH-behandlade kulturer, vilket tyder på att neutraliserande TGF- 1-aktivitet minskade tillväxtstimuleringen av ECH i tarmepitelceller. De ytterligare experimenten visade att anti-TGF- 1-antikroppen också neutraliserade den cytoprotektiva aktiviteten hos ECH i MODE-K-cellkulturer; tillsatsen av ECH minskade apoptosen från 4,37 procent ± 1,19 procent i icke-läkemedelsbehandlade kulturer till 1,72 procent ± {{50}},01 procent i ECH-behandlade kulturer efter 24 timmars inkubation och från 11,13 procent ± 1,12 procent i icke-läkemedelsbehandlade kulturer till 9,13 procent ± 0,02 procent i ECH-behandlade kulturer efter 48 timmars inkubation (icke-läkemedel/medium vs. ECH, tvåvägs ANOVA, P=0.0001). Men i närvaro av anti-TGF- 1-antikroppar apoptos i ECH-behandlade kulturer (2,88 procent ± 0,01 procent efter 24-h inkubation; 12,58 procent ± 0,02 procent efter 48-h inkubation ) skilde sig inte signifikant från de i kontrollkulturer (icke läkemedelsbehandlade) (tvåvägs ANOVA, P=0.9427), vilket antyder att anti-TGF- 1 antikropp interfererar med ECH-medierad överlevnad i tarmarna epiteliala celler.

Diskussion

ECH(echinacoside från cistanche)är inte bara en viktig PhG i extraktet av växtbaserade Cistanche spp. men finns också i många andra medicinalväxter som Echinacea spp. (25, 26). Denna naturliga förening har rapporterats ha antioxidantaktivitet in vitro och in vivo (13, 27, 28). Mekanismen/mekanismerna för dess verkan är dock fortfarande okänd. Våra resultat från den aktuella studien visar för första gången i en in vitro-modell att ECH stimulerar intestinal epitelcellsproliferation och överlevnad, vilket är beroende av TGF- 1.

Tillägget av ECH(echinacoside från cistanche)minskar cellapoptos i H2O2- eller pro-inflammatoriska cytokinblandningar (TNF- och IFN- )-behandlade MODE-K-celler (fig. 3 och 4) och även i andra celltyper (16, 29), och nedbrytning av TGF- 1-uttryck eller blockering av dess aktivitet resulterar i att dess anti-apoptotiska aktivitet avskaffas (fig. 6 och 7), vilket indikerar att cytoskyddet av ECH beror på TGF- 1-produktion (fig. 5). Vår tidigare studie har visat att TGF- 1 inducerar anti-apoptotiskt Bcl-2-uttryck och förhindrar TNF-medierad apoptos i tubulära njurepitelceller (19). Liknande fynd har rapporterats i andra celltyper; tillsats av TGF- 1 i odlade lungartärendotelceller uppreglerar baslinjenivån av Bcl-2 och förhindrar apoptos inducerad av serumbrist och vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)-receptorblockad (30); och i odlade neurala progenitorceller (NPC) ökar den (med cirka 76 procent) cellöverlevnad mot H2O2-behandling, vilket är korrelerat med uppreglering av Bcl-2-uttryck (31). Även om effekten av ECH på Bcl-2-uttryck i MODE-K-celler inte undersöks i denna studie, har korrelationen av Bcl-2-uppreglering med den anti-apoptotiska aktiviteten av ECH rapporterats i TNF - –behandlade SHSY5Y neuronala celler (29) eller H2O2-behandlade PC12-celler (15). Sammantaget tyder dessa data på att den anti-apoptotiska aktiviteten av ECH kan förmedlas av TGF- 1 via en Bcl-2-väg.

Det är möjligt att cytoprotektion av ECH(echinacoside från cistanche)skulle kunna bidra till en liten ökning av antalet viabla celler genom att minska spontan celldöd i slutet av inkubationen, men tillsatsen av ECH (100 ug/mL) fördubblar nästan de livsdugliga cellerna efter 48-h behandling (Fig. 2A) , vilket tyder på att ECH verkligen stimulerar cellproliferation, vilket ytterligare bekräftas av data i Fig. 2, B och C. En liknande effekt av ECH har rapporterats i humana fibroblastiska celler, MRC-5 (17): i MRC{ {6}} cellkulturer, skulle ECH kunna fördröja cellulär senescens genom att inducera cellcykeln från G1-fasen till S-fasen och G2-fasen. Liksom den anti-apoptotiska aktiviteten av ECH, är den proliferativa aktiviteten av ECH beroende av TGF - 1 (fig. 6 och 7) som har dokumenterats väl vara ett multifunktionellt cytokin (32, 33). TGF- kan stimulera cellproliferation eller inducera tillväxtstopp beroende på celltyp eller extracellulär mikromiljö; det aktiverar flera signalvägar inklusive Smads och icke-Smads (t.ex. de mitogenaktiverade proteinkinaserna) (34, 35), men vilken väg som förmedlar ECH/TGF-stimulerad cellproliferation i MODE-K-celler behöver undersökas ytterligare.

Hittills är lite känt om målproteinet/målproteinerna för ECH(echinacoside från cistanche)eller den eller de signalvägar som den reglerar. En studie visar att ECH-behandling ökar cellnivåerna av cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP) i endotelceller (36), och tillägget av 8-Bromo-cGMP ökar måttligt TGF- 1-uttrycket i hjärtfibroblaster (37) ). Huruvida ECH-behandling höjer cGMP och genom vilken ECH stimulerar TGF- 1-uttryck i odlade tarmepitelceller behöver dock ytterligare undersökning.

Sammanfattningsvis visar vår studie att ECH(echinacoside från cistanche)inducerar TGF- 1-produktion som förmedlar cellproliferation och cellöverlevnad i odlade tarmepitelceller. TGF-signalering i tarmepitel krävs för reparation eller läkning av slemhinneskada hos möss med dextransulfat-natrium-inducerad kolit (38), vilket tyder på att ECH, kanske ECH-innehållande ört C. deserticola eller andra, kan ha terapeutisk potential för att främja slemhinneskada reparation hos patienter.

Bekräftelse

YJ fick stöd av ett doktorandstipendium från China Scholarship Council, Kina.

Referenser

1 Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Zhu WC, Xu J. Cistanche deserticola Ma odlas som en ny gröda i Kina. Genet Resour Crop Evol. 2009;56:137–142.

2 Jiang Y, Tu PF. Analys av kemiska beståndsdelar i Cistanche-arter. J Chromatogr A. 2009;1216:1970–1979.

3 Tu PF, Wang B, Deyama T, Zhang ZG, Lou ZC. [Analyse av fenyletanoidglykosider av Herba Cistanchis med RP-HPLC]. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997;32:294–300. (text på kinesiska med engelska abstrakt)

4 Huang X, Li Z. [Klinisk effekt av Cistanche-innehållande lösning vid behandling av förstoppning efter stroke]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integrated Trad West Med). 2002;22:622–623. (på kinesiska)

5 Zhang B, Lu X, Zhang R, Li L, Li C. [Studie om den laxerande effekten av Cistanche deserticola]. Zhong Yao Cai (J Chin Med Mater). 1992;15:33–35. (på kinesiska)

6 Tu P, Li S, Li Z, Wang C, Lou Z. [Jämförelse om fuktning av tarmarna och laxering av herba Cistanches]. Nat Prod Res Dev. 1997;11:48–51. (text på kinesiska med engelska abstrakt)

7 Zhang B, Zhao X, Chen S, Liu L, Cheng H. [Laxerande verkan av separerade delar från herba Cistanche]. Zhongguo Zhongyiyao Xinxi Zazhi (Chin J Inform Trad Chin Med). 2003;10:31–32. (text på kinesiska med engelska abstrakt)

8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. Minskning av inflammatorisk hyperplasi i tarmen hos möss med tjocktarmscancer genom vattenextrakt av Cistanche deserticola. Phytother Res. I pressen.

9 Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. Antifatigue-aktivitet av fenyletanoidrikt extrakt från Cistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313–315.

10 Jing M, Song S, Li J. [Studie om Ronggui Tongbian kapselextraktion och reningsprocess]. Modern Chin Med. 2009;11: 18–20. (text på kinesiska med engelska abstrakt)

11 Wu Y, Shi HM, Bao Z, Wang MY, Tu PF, Li XB. Tillämpning av molekylära markörer för att förutsäga produktionskvalitet för odlade Cistanche deserticola. Biol Pharm Bull. 2010;33:334–339.

12 Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektiva effekter av echinakosid i mus-MPTP-modellen av Parkinsons sjukdom. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13 Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Neurotrofiska och neuroräddande effekter av Echinacoside i den subakuta MPTP-musmodellen av Parkinsons sjukdom. Brain Res. 2010;1346:224–236.

14 Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L, Zhao J. Skydd av echinakosid mot akut lungskada orsakad av oljesyra hos råttor. Free Radic Res. 2007;41:798–805.

15 Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L, Zheng X. Skyddseffekter av echinakosid, en av fenyletanoidglykosiderna, på H2O2--inducerad cytotoxicitet i PC12-celler. Planta Med. 2009;75: 1499–1504.

16 Kuang R, Sun Y, Zheng X. Dämpning av kväveoxid som är inblandad i den skyddande effekten av echinakosid på H2O2-inducerad PC12-cellskada. Nat Prod Commun. 2010;5:571–574.

17 Xie H, Zhu H, Cheng C, Liang Y, Wang Z. Echinacoside fördröjer cellulär senescens av humana fibroblastiska celler MRC-5. Pharmazie. 2009;64:752–754.

18 Vidal K, Grosjean I, Evillard JP, Gespach C, Kaiserlian D. Immortalization of mus intestinal epitelial cells by the SV40- large T-gen. Fenotypisk och immun karakterisering av MODE-K-cellinjen. J Immunol Methods. 1993;166:63–73.

19 Guan Q, Nguan CY, Du C. Uttryck av transformerande tillväxtfaktor-beta1 begränsar njurischemi-reperfusionsskada. Transplantation. 2010;89:1320–1327.

20 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH, et al. TGF-beta1 siRNA undertrycker tubulointerstitiell fibros i njuren av ureteral obstruktion. Exp Mol Pathol. 2006;81: 48–54.

21 Du C, Wang S, Diao H, Guan Q, Zhong R, Jevnikar AM. Ökad motståndskraft hos tubulära epitelceller mot apoptos genom shRNA-terapi lindrar njurischemi-reperfusionsskada. Am J Transplantation. 2006;6:2256–2267.

22 Douglas HE. TGF-ss i sårläkning: en recension. J Sårvård. 2010;19:403–406.

23 Grande JP. Roll av transformerande tillväxtfaktor-beta vid vävnadsskada och reparation. Proc Soc Exp Biol Med. 1997;214:27–40.

24 Monteleone G, Boirivant M, Pallone F, MacDonald TT. TGF beta1 och Smad7 i regleringen av IBD. Mucosal Immunol. 2008;1 Suppl 1:S50–S53.

25 Bauer R, Foster S. Analys av alkamider och koffeinsyraderivat från Echinacea simulate och E. paradoxa root. Planta Med. 1991;57:447-449.

26 Perry NB, Burgess EJ, Glennie VL. Echinacea standardisering: analytiska metoder för fenolföreningar och typiska nivåer i medicinska arter. J Agric Food Chem. 2001;53:849–857.

27 Pellati F, Benvenuti S, Magro L, Melegari M, Soragni F. Analys av fenolföreningar och radikalfångande aktivitet hos Echinacea spp. J Pharm Biomed Anal. 2004;35:289–301.

28 Wu Y, Li L, Wen T, Li YQ. Skyddseffekter av echinakosid på koltetrakloridinducerad levertoxicitet hos råttor. Toxikologi. 2007;232:50–56.

29 Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB, Wang YH. Echinacoside räddar SHSY5Y neuronala celler från TNFalfa-inducerad apoptos. Eur J Pharmacol. 2004;505:11–18.

30 Lu Q. Transforming growth factor-beta1 skyddar mot lungartärendotelcellapoptos via ALK5. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008;295:L123–L133.

31 Park SM, Jung JS, Jang MS, Kang KS, Kang SK. Transformerande tillväxtfaktor-beta1 reglerar ödet för odlade ryggmärgshärledda neurala stamceller. Cell Prolif. 2008;41:248–264.

32 Massage J. Hur celler läser TGF-beta-signaler. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1:169–178.

33 Rahimi RA, Leof EB. TGF-beta-signalering: en berättelse om två svar. J Cell Biochem. 2007;102:593–608.

34 Moustakas A, Heldin CH. Icke-Smad TGF-beta-signaler. J Cell Sci. 2005;118:3573–3584.

35 Schmierer B, Hill CS. TGF beta-SMAD signaltransduktion: molekylär specificitet och funktionell flexibilitet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8:970–982.

36 He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ, Tu PF. Echinakosid framkallar endotelberoende avslappning i aortaringar hos råtta via en NO-cGMP-väg. Planta Med. 2009;75:1400–1404.

37 Abdelaziz N, Colombo F, Mercier I, Calderone A. Kväveoxid dämpar uttrycket av transformerande tillväxtfaktor-beta3-mRNA i hjärtfibroblaster från råtta via destabilisering. Hypertoni. 2001;38:261–266.

38 Beck PL, Rosenberg IM, Xavier RJ, Koh T, Wong JF, Podolsky DK. Transformerande tillväxtfaktor-beta förmedlar tarmläkning och känslighet för skada in vitro och in vivo genom epitelceller. Am J Pathol. 2003;162:597–608.