Echinacoside undertrycker dexametason-inducerad tillväxthämning och apoptos i osteoblastiska MC3T3-E1-celler

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt.

Glukokortikoider (GC) används i stor utsträckning för att behandla kroniska sjukdomar. Långvarig och/eller överdosadministrering av GC har många biverkningar på människors hälsa, inklusive GC-inducerad osteoporos (GIOP). I den här utredningen var syftet att bedöma vilken påverkan somechinacoside från cistanche(ECH) utövar på dexametasonbehandlade murina osteoblastiska MC3T3-E1-celler. Vi hittade att ECH(echinacoside från cistanche) (5, 10, 20, and 40 mg/l) inhibited dexamethasone (1,000 nM)-suppressed cell viability as demonstrated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The dose of 10 mg/l was selected for the following experiments because this dose had a better effect than the dose of 5 mg/l, and the doses >10 mg/l hade en liknande effekt som denna dos. ECH(echinacoside från cistanche)(10 mg/l) eller pifitrin-(PFT-) (en p53-hämmare, 20 µM) dämpade dexametason-inducerad MC3T3-E1-apoptos som illustreras av Annexin V/propidiumjodid (PI) dubbelmärkningsflödescytometrianalys . ECH(echinacoside från cistanche)eller PFT-behandling lindrade också dexametasons verkan att hämma Bcl-2-uttryck samt dexametasons verkan att stimulera uttrycket av p53 och Bax. Dessutom vände lentivirusmedierat-p53-överuttryck effekterna av ECH(echinacoside från cistanche)i dexametasonbehandlade MC3T3-E1-celler, vilket tyder på att ECH(echinacoside från cistanche)inducerade anti-apoptotiska effekter i dexametasonbehandlade osteoblaster via ap53-beroende väg. Sammanfattningsvis ECH(echinacoside från cistanche)har en skyddande effekt mot osteoblastisk cellapoptos inducerad av dexametason, vilket tyder på att ECH(echinacoside från cistanche)kan ha potential för klinisk tillämpning vid behandling av GIOP.

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Introduktion

Glukokortikoider(GC) används ofta för att behandla ett brett spektrum av kroniska sjukdomar, inklusive inflammation, cancer och autoimmuna sjukdomar (1). Men långvarig och/eller överdosadministrering av GC har många biverkningar, såsom högt blodtryck, hyperglykemi, glaukom, osteonekros och osteoporos (2-4). Det är tydligt att användning av GC ökar benförlust och frakturrisken (3-6). GC kan inducera apoptos av osteoblaster och försämra funktionen hos dessa celler. Till exempel kan dexametason, ett GC-hormon, uppreglera uttrycket av p53 i osteoblastiska MC3T3-E1-celler, vilket orsakar cellapoptos (7,8). Osteoblastapoptos leder till minskad benbildning. Oral användning av bisfosfonater (alendronat och risedronat) (9,10) har introducerats för behandling av GC-inducerad osteoporos (GIOP). Låga vidhäftningshastigheter begränsar dock effektiviteten av orala bisfosfonater. Andra mediciner har också begränsningar såsom obekväm administrering [zoledronsyra (11)] och hög kostnad [PTH 1-34 (teriparatid) (12,13)]. Det finns därför ett behov av utveckling av nya behandlingsalternativ för GIOP.

Echinacoside från cistanche (ECH)är en fenyletanoidglykosid isolerad från den traditionella kinesiska medicinenHerbaCistancher(14). ECH(echinacoside från cistanche)har skyddande effekter på neuronsystemet (15-20), levern (21,22) och lungan (23) genom att främja cellproliferation och hämma inflammatorisk respons, produktion av reaktiva syrearter (ROS) och cellapoptos. Även om ECH(echinacoside från cistanche)kan också främja osteoblastisk benregenerering och har extraordinär antiosteoporotisk aktivitet i råttmodellerna (24,25), det finns inga befintliga register som beskriver effekterna av ECH(echinacoside från cistanche)på GC-inducerad osteoblastisk cellapoptos. Därför undersökte vi den påverkan som ECH(echinacoside från cistanche)utövar på dexametason-inducerad osteoblastisk cellapoptos och klargjorde den preliminära mekanismen i MC3T3-E1-celler.

Material och metoder

Odling av celler. Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) tillhandahöll de murina osteoblastiska MC3T3-E1-cellerna. Tillväxt av celler skedde i -minimal essentiellt medium (-MEM) (Hyclone; GE Healthcare, Logan, UT, USA) innehållande 10 procent fetalt bovint serum (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, USA ) och penicillin/streptomycin (Beijing Solar Science and Technology Co., Ltd., Peking, Kina). Underhåll av celler utfördes i en miljö med 95 procent luft och 5 procent koldioxid vid en temperatur på 37˚C.

Deproduktionavlentivirusöveruttrycker p53. För att skapa p53-expressionskonstruktionen syntetiserades den proteinkodande sekvensen (CDS)-regionen av den murina p53-genen och infogades iEcoRI/BamHI-restriktionsställen för den lentivirala expressionsvektorn pLVX-puro (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA) av Genewiz, Inc. (Peking, Kina). Konstruktionen verifierades genom DNA-sekvensering. 293T-celler (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kina) transfekterades med en blandning av plasmider, inklusive virala förpackningsplasmider och p53-expressionsplasmid (pLVX-p53) eller kontrollplasmid (pLVX) via Lipofectamine 2000 (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA, USA) baserat på tillverkarens instruktioner. Den virala supernatanten uppsamlades 48 timmar efter transfektion och användes för att infektera MC3T3-E1-celler. Utvärdering av p53-uttryck utfördes 48 timmar efter virusinfektion.

Kvantitativpolymeraskedjareaktion(qPCR). Vi använde TRIzol-reagens (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc.) för att separera totalt RNA och MC3T3-E1-celler, och RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis-kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) enligt tillverkarens instruktioner för omvänd transkribering av totalt RNA. p53-mRNA-nivån detekterades via qPCR på ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems: Thermo Fisher Scientific, Inc., Foster City, CA, USA). Primrarna var enligt följande: 5'-CCC CTGTCATCTTTTGTCCCT-3' och 5'-AGCTGGCAGAAT AGCTTATTGAG-3' för p53, 5'-CTGCCCAGAACATCA TCC-3' och 5'-CTCAGATGCCTGCTTCAC{-3 18}}' för GAPDH.

Sedan bedömde vi p53 mRNA-nivåer via 2^-ΔΔCT-metod (26) med GAPDH som intern kontroll.

Western blotting. Lysering av MC3T3-E1-celler ägde rum i radioimmunoutfällningsanalysbuffert med proteashämmare (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), och centrifugeringen av lysaten fortsatte i 15 minuter vid en temperatur av 4˚C vid 9 600 xg så att nederbörd kan avlägsnas. Därefter utvärderade vi mängden protein med BCA-analyskitet (Thermo Fisher Scientific, Inc.). En lika stor mängd protein sattes till en 10 eller 15 procent SDS-PAGE och överfördes till ett nitrocellulosamembran (EMD Millipore, Bradford, MA, USA). Membranen blockerades med 5 procent skummjölk och undersöktes med primära antikroppar. Efter tvättning 3 gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) genomfördes inkubation av membran med pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp (1:1,000; katnr A0208; Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina) . Vi genomförde western blotting-tester via ett förstärkt kemiluminescens (ECL) kit (EMD Millipore). GAPDH användes som intern standard. Källorna för primära antikroppar var följande: Bax (Sc-493) och Bcl-2 (Sc-492) båda från Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA); p53 (nr 2524) och GAPDH (nr 5174) båda från Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Experimentell gruppering. För att bestämma lämplig dos av dexametason utfördes behandling av MC3T3-E1-celler med en serie mängder dexametason (0, 1, 10, 100 och 1,000 nM; Sigma -Aldrich; Merck KGaA, St. Louis, MO, USA). 48 timmar efter inkubering av celler utfördes Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-analyser för att detektera cellproliferation.

För att välja lämplig dos av ECH(echinacoside från cistanche), utfördes behandling av MC3T3-E1-celler med 1,000 nM dexametason och olika doser av ECH (0, 2,5, 5, 10, 20 och 40 mg/l; Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Kina). Celler som odlats under normala förhållanden (mock) användes som kontroll. CCK-8-analys utfördes efter 48 timmars odling.

För alla andra experiment delades MC3T3-E1-cellerna upp i fem grupper: grupp 1 (mock), celler odlades under normalt tillstånd; grupp 2, celler transducerades med pLVX lentivirus; grupp 3, celler odlade med 10 mg/l ECH(echinacoside från cistanche); grupp 4, celler med 20 µM pifitrin- (PFT-; Selleck Chemicals, Houston, TX, USA); grupp 5, celler transducerade med pLVX-p53 lentivirus och behandlade med 10 mg/l ECH(echinacoside från cistanche). Celler i grupperna 2-5 behandlades med 1,000 nM dexametason. Cellapoptos och proteinuttryck mättes efter 48 timmars odling.

Cellspridningsanalys.Vi sådde MC3T3-E1-celler i 96-brunnsplattor vid 3x10³celler/brunn och odlade dem vid normala förhållanden över natten. Celler behandlades såsom anges. Efter 48 timmars odling utfördes sedan CCK8 (Signalway Antibody LLC, College Park, MD, USA) analys enligt tillverkarens instruktioner. I korthet ersattes odlingsmediet i varje brunn med 100 µl 10 procent CCK-8-lösning i mediet. Efter att ha inkuberat cellerna under en varaktighet av 1 timme vid en temperatur av 37˚C, bedömde vi absorbansen vid en våglängd av 450 nm med en mikroplattläsare. Den relativa cellviabiliteten (procent) med anslutningar till kontrollbrunnar beräknades.

Cellapoptosutvärdering. Vi använde Annexin V-FITC cell apoptos kit (Beyotime Institute of Biotechnology) för att kvantifiera celler som genomgår tidig apoptos enligt tillverkarens instruktioner. I korthet utfördes insamlingen av behandlade celler via trypsinisering. Cellerna tvättades via PBS och återsuspenderades med Annexinbindande buffert. Inkubation av celler utfördes via Annexin V-FITC under en varaktighet av 15 minuter vid en temperatur av 4˚C följt av inkubation med propidiumjodid (PI) under 5 minuter vid 4˚C. Celler i den nedre högra kvadranten (Annexin V-FITC positiv och PI negativ) ansågs aktivt genomgå tidig apoptos.

Statistiskanalys. Data är medelvärdet ± SD för alla tre oberoende experiment. Tukeys multipla jämförelsetest och envägsvariansanalys utfördes för att analysera skillnaderna mellan grupper via GraphPad Prism-programvaran (version 6.0; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultat

Etableringava lämplig dosavdexametason.För att bestämma den lämpliga dosen av dexametason, exponerades MC3T3-E1-cellerna för ökande mängder dexametason (0, 1, 10, 100 och 1,000 nM) under 48 timmar . Som visas i Fig. 1 bestämdes relativ cellviabilitet med CCK-8-analys ökades i celler behandlade med låga koncentrationer av dexametason (1 och 10 nM), och minskade signifikant i celler exponerade för höga koncentrationer av dexametason (100 och 1,000 nM).

Den mest signifikanta minskningen observerades i celler med 1,000 nM dexametason. Således valdes 1,000 nM dexametason ut i de efterföljande analyserna.

Effekt av ECH(echinacoside från cistanche)på dexametasoninducerad celltillväxthämning. Vi undersökte sedan effekten av ECH(echinacoside från cistanche)på dexametasoninducerad celltillväxthämning. Behandling av MC3T3-E1-celler utfördes med 1,000 nM dexametason och olika doser av ECH(echinacoside från cistanche)(0, 2,5, 5, 10, 20 och 40 mg/l; Fig. 2). Vid 48 timmar efter behandling, tillägg av ECH(echinacoside från cistanche)vid doser på 5, 10, 20 och 40 mg/l minskade dexametason-inducerad cellskada avsevärt. ECH(echinacoside från cistanche)vid en dos på 10 mg/l har en tydligare effekt än den vid en dos på 5 mg/l. Cellviabiliteten var liknande i celler behandlade med 10, 20 och 40 mg/l ECH(echinacoside från cistanche). Därför 10 mg/l ECH(echinacoside från cistanche)användes i följande experiment.

Överuttryck av p53 genom att konstruera lentivirus. Dexamethason kan uppreglera p53 och därigenom inducera osteoblastapoptos (8). Att studera effekterna av ECH(echinacoside från cistanche) on dexamethasone-induced p53 expression, we constructed a lentivirus encoding p53 (pLVX-p53) and transduced the virus into MC3T3-E1 cells. The expression of p53 was analyzed at 48 h after transduction. Fig. 3 shows that p53 mRNA and protein levels were increased to >2 gånger i pLVX-p53-transducerade celler jämfört med celler med kontrollvirus (pLVX). p53 var involverad i effekten av ECH(echinacoside från cistanche) på dexametason-inducerad apoptos. MC3T3-E1-cellerna behandlades med Plavix eller pLVX-p53, 10 mg/l ECH(echinacoside från cistanche), 20 µM PFT- (en p53-hämmare) och 1,000 nM dexametason, och sedan mättes cellapoptos via Annexin V-FITC apoptoskit. Såsom visas i Fig. 4A inducerade dexametasonbehandling anmärkningsvärt cellapoptos i jämförelse med cellerna som odlats under normala förhållanden (mock). ECH(echinacoside från cistanche) och PFT-behandling skyddade MC3T3-E1-cellerna avsevärt mot dexametason-inducerad apoptos. Dessutom vände p53-överuttryck de skyddande effekterna av ECH(echinacoside från cistanche).

Bcl-2 och Bax, som viktiga apoptosregulatorer, är kända för att regleras av p53 (27). Western blotting indikerade att förändringarna av p53- och Bax-proteinuttryck var förenliga med förändringarna av cellapoptos, medan Bcl-2-uttryck förändrades i motsatt riktning (Fig. 4B och C). Noterbart undertrycktes proteinnivåerna av p53 signifikant av ECH(echinacoside från cistanche)och PFT-behandling i celler som överuttrycker p53 och behandlade med dexametason (Fig. 4C). Dessa uppgifter tyder på att ECH(echinacoside från cistanche)kan utöva skyddande effekter på dexametason-inducerad apoptos genom att hämma p53-uttryck.

Effekter av cistanche echinacoside

Diskussion

Anti-apoptosfunktionen hos ECH(echinacoside från cistanche)har beskrivits i den akuta leverskadamodellen inducerad av D-galaktosamin (D-GalN) och lipopolysackarid (LPS) och i humana neuroblastomceller (SH-SY5Y) inducerade av tumörnekrosfaktor- eller 1-metyl{{6 }}fenylpyridiniumjon (MPP plus) (17,22,28). Det har rapporterats att dexametasonbehandling kan hämma proliferation och inducera MC3T3-E1-cellapoptos (8,29). I den aktuella studien reducerades den relativa cellviabiliteten avsevärt i celler exponerade för höga koncentrationer av dexametason (100 och 1, 000 nM), vilket överensstämde med en tidigare studie (8). Ytterligare ECH-behandling (5-40 mg/l) hämmade anmärkningsvärt dexametasonundertryckt cellviabilitet. Dessutom stimulerade dexametasonexponering (1,000 nM) MC3T3-E1-cellsapoptos, vilket ECH-behandlingen begränsade i betydande utsträckning. Rapporten gav en första skildring av hur ECH skyddas mot dexametason-inducerad osteoblastcellapoptos och föreslog att ECH kan ha potential för klinisk tillämpning i GIOP.

Dessutom försökte vi utforska den preliminära mekanismen för skyddseffekterna av ECH(echinacoside från cistanche). Dexametason kan förbättra p53-transkriptionen och därigenom inducera osteoblasters apoptos och cellcykelstopp (8). p53 nedregleras av ECH i SH-SY5Y-celler (28). Här hade PFT- (en p53-hämmare) liknande skyddande effekter som ECH, medan p53-överuttryck vände de skyddande effekterna av ECH. Förändringarna av p53-proteinuttryck under olika betingelser överensstämde med förändringarna av cellapoptos. Dessa resultat indikerar att ECH kan utöva skyddande effekter på dexametasoninducerad osteoblastisk cellapoptos via inhibering av p53-uttryck. Bcl-2 familjeproteiner, såsom Bcl-2 och Bax, kan förändra permeabiliteten hos mitokondriella membranet, aktivera effektorkaspaser och orsaka cellapoptos (30). Det är välkänt att p53 kan reglera Bcl-2 och Bax (27). Här behandlas med PFT- eller ECH(echinacoside från cistanche) dämpade de inhiberande effekterna av dexametason på anti-apoptosprotein Bcl-2-nivåer såväl som de stimulerande effekterna dexametason har på pro-apoptosprotein Bax-nivåer, medan p53-överuttryck vände effekterna av ECH. Dessa resultat visade vidare involveringen av p53 i skyddsfunktionen hos ECH.

Sammanfattningsvis visade vi att ECH(echinacoside från cistanche)har en lovande skyddande effekt på osteoblastisk cellapoptos inducerad av dexametason, vilket tyder på att ECH kan ha potential för klinisk tillämpning vid behandling av GIOP.

Effekter av echinacoside från cistanche

Referenser

1. Buttgereit F, Burmester GR och Lipworth BJ: Optimerad glukokortikoidterapi: Slipningen av ett gammalt spjut. Lancet 365: 801-803, 2005.

2. Schäcke H, Döcke WD och Asadullah K: Mekanismer involverade i biverkningar av glukokortikoider. Pharmacol Ther 96: 23-43, 2002.

3. Fukushima W, Fujioka M, Kubo T, Tamakoshi A, Nagai M och Hirota Y: Nationell epidemiologisk undersökning av idiopatisk osteonekros i lårbenshuvudet. Clin Orthop Relat Res 468: 2715-2724, 2010.

4. Civitelli R och Ziambaras K: Epidemiologi av glukokorti-förkylningsinducerad osteoporos. J Endocrinol Invest 31 (Suppl): 2-6, 2008.

5. Gudbjörnsson B, Juliusson UI och Gudjonsson FV: Prevalens av långvarig steroidbehandling och frekvensen av beslutsfattande för att förhindra steroidinducerad osteoporos i daglig klinisk praxis. Ann Rheum Dis 61: 32-36, 2002.

6. van Staa TP, Geusens P, Pols HA, de Laet C, Leufkens HG och Cooper C: En enkel poäng för att uppskatta den långsiktiga risken för fraktur hos patienter som använder orala glukokortikoider. QJM 98: 191-198, 2005.

7. Rickard DJ, Sullivan TA, Shenker BJ, Leboy PS och Kazhdan I: Induktion av snabb osteoblastdifferentiering i råttas benmärgsstromacellkulturer genom dexametason och BMP-2. Dev Biol 161: 218-228, 1994.

8. Li H, Qian W, Weng X, Wu Z, Li H, Zhuang Q, Feng B och Bian Y: Glukokortikoidreceptor och sekventiell P53-aktivering genom dexametason medierar apoptos och cellcykelstopp av osteoblastiska MC3T3-E1-celler. PLoS One 7: e37030, 2012.

9. Stoch SA, Saag KG, Greenwald M, Sebba AI, Cohen S, Verbruggen N, Giezek H, West J och Schnitzer TJ: En gång i veckan oralt alendronat 70 mg hos patienter med glukokortikoid-inducerad benförlust: A 12- månads randomiserad, placebokontrollerad klinisk prövning. J Rheumatol 36: 1705-1714, 2009.

10. Wallach S, Cohen S, Reid DM, Hughes RA, Hosking DJ, Laan RF, Doherty SM, Maricic M, Rosen C, Brown J, et al: Effekter av risedronatbehandling på bentäthet och vertebral fraktur hos patienter på kortikosteroidbehandling. Calcif Tissue Int 67: 277-285, 2000.

11. Reid DM, Devogelaer JP, Saag K, Roux C, Lau CS, Reginster JY, Papanastasiou P, Ferreira A, Hartl F, Fashola T, et al; HORIZON-utredare: Zoledronsyra och risedronat vid förebyggande och behandling av glukokortikoidinducerad osteoporos (HORIZON): En multicenter, dubbelblind, dubbeldummy, randomiserad kontrollerad studie. Lancet 373: 1253-1263, 2009.

12. Langdale BL, Rajzbaum G, Jakob F, Karras D, Ljunggren O, Lems WF, Fahrleitner-Pammer A, Walsh JB, Barker C, Kutahov A, et al. behandlad med teriparatid: 18-Månadsdata från European Forster Observational Study (EFOS). Calcif Tissue Int 85: 484-493, 2009.

13. Saag KG, Zanchetta JR, Devogelaer JP, Adler RA, Eastell R, See K, Krege JH, Krohn K och Warner MR: Effekter av teriparatid kontra alendronat för behandling av glukokortikoid-inducerad osteoporos: Trettiosex månaders resultat av en randomiserad, dubbelblind, kontrollerad studie. Arthritis Rheum 60: 3346-3355, 2009.

14. Jia Y, Guan Q, Guo Y och Du C: Echinakosid stimulerar cellproliferation och förhindrar cellapoptos i intestinala epitelial MODE-K-celler genom uppreglering av transformerande tillväxtfaktor- 1 uttryck. J Pharmacol Sci 118: 99-108, 2012.

15. Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L och Zheng X: Skyddseffekter av echinakosid, en av fenyletanoidglykosiderna, på H(2)O(2)-inducerad cytotoxicitet i PC12-celler. Planta Med 75: 1499-1504, 2009.

16. Kuang R, Sun Y och Zheng X: Undertryckande av kväveoxid inblandad i den skyddande effekten av echinacoside på H2O2-inducerad PC12-cellskada. Nat Prod Commun 5: 571-574, 2010.

17. Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB och Wang YH: Echinacoside räddar SHSY5Y neuronala celler från TNFalfa-inducerad apoptos. Eur J Pharmacol 505: 11-18, 2004.

18. Geng X, Tian X, Tu P och Pu X: Neuroprotektiva effekter av echinakosid i mus-MPTP-modellen av Parkinsons sjukdom. Eur J Pharmacol 564: 66-74, 2007.

19. Zhao Q, Gao J, Li W och Cai D: Neurotrofiska och neuroräddningseffekter av echinakosid i den subakuta MPTP-musmodellen av Parkinsons sjukdom. Brain Res 1346: 224-236, 2010.

20. Zhu M, Lu C och Li W: Övergående exponering för echinakosid är tillräcklig för att aktivera Trk-signalering och skydda neuronala celler från rotenon. J Neurochem 124: 571-580, 2013.

21. Wu Y, Li L, Wen T och Li YQ: Skyddseffekter av echinakosid på koltetrakloridinducerad levertoxicitet hos råttor. Toxicology 232: 50-56, 2007.

22. Li X, Gou C, Yang H, Qiu J, Gu T och Wen T: Echinacoside förbättrar D-galaktosamin plus lipopolysackarid-inducerad akut leverskada hos möss via hämning av apoptos och inflammation. Scand J Gastroenterol 49: 993-1000, 2014.

23. Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L och Zhao J: Skydd av echinakosid mot akut lungskada orsakad av oljesyra hos råttor. Free Radic Res 41: 798-805, 2007.

    ---