EDS1-samverkande J Protein 1 är en väsentlig negativ regulator av växternas medfödda immunitet vid Arabidopsis

Abstrakt

Växter har utvecklat exakta mekanismer för att optimera immunsvar mot patogener. FÖRBÄTTRAD SJUKDOMSSUSEPTIBILITY 1 (EDS1) spelar en viktig roll i växternas medfödda immunitet genom att reglera basal resistens och effektorutlöst immunitet. Nukleocytoplasmatisk handel med EDS1 krävs för resistensförstärkning, men den molekylära mekanismen förblir svårfångad. Här visar vi att EDS1-INTERAKTAR J PROTEIN1 (EIJ1), som fungerar som en DnaJ-proteinliknande chaperon som svar på patogeninfektion, fungerar som en väsentlig negativ regulator av växtimmunitet genom att interagera med EDS1. Förlust-av-funktionsmutationen av EIJ1 påverkade inte växttillväxt men förbättrade signifikant patogenresistens. Efter patogeninfektion flyttade EIJ1 från kloroplasten till cytoplasman, där den interagerade med EDS1, och därigenom begränsade patogenutlöst handel med EDS1 till kärnan och äventyrade resistens i ett tidigt infektionsstadium. Under sjukdomsutvecklingen bröts EIJ1 ned gradvis, vilket möjliggjorde kärnackumulering av EDS1 för förstärkning av transkriptionell resistens. Den avirulenta stammen Pst DC3000 (AvrRps4) avskaffade den repressiva effekten av EIJ1 genom att snabbt inducera dess nedbrytning i det effektorutlösta immunitetssvaret. Sålunda visar våra resultat att EIJ1 är en väsentlig EDS1-beroende negativ regulator av medfödd växtimmunitet och ger en mekanistisk förståelse av hur den nukleära kontra cytoplasmatiska distributionen av EDS1 regleras under immunsvaret.

cistanche fördelar-stärker immunförsvaret

Introduktion

Växter har utvecklat ett komplicerat nätverk för att modulera deras immunsvar. För att försvara sig mot patogener använder växter två huvudsakliga regleringsstrategier: mönsterutlöst immunitet (PTI) och effektorutlöst immunitet (ETI). PTI styrs av mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) som känner igen patogen- eller mikrobassocierade molekylära mönster (Zipfel, 2008). För att underlätta infektion undertrycker virulenta patogener PTI genom att utsöndra patogeneffektorer, och de manipulerar värdceller för att underlätta näringsinsamling och slutligen reproduktion (Tsuda och Katagiri, 2010). Den lågnivåresistens som växten uppvisar mot dessa virulenta patogener kallas basalresistens (Jones och Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). Å andra sidan medieras ETI av växtkodade sjukdomsresistens (R) proteiner, som direkt eller indirekt kan känna igen närvaron av effektorer som utsöndras av patogener (Tsuda och Katagiri, 2010). De flesta R-proteiner innehåller ett nukleotidbindningsställe och en leucinrik upprepad domän (NB-LRR). NB-LRR-proteinerna som innehåller en N-terminal Toll/Interleukin-1-receptor (TIR) ​​protein-proteininteraktionsdomän är kända som TIR-NB-LRR (TNL)-proteiner, och de utgör den största gruppen av NB- LRR-proteiner (Caplan et al., 2008). Jämfört med basal resistens inducerar ETI ett starkare och snabbare försvarssvar mot patogener och åtföljs ofta av lokal celldöd, ett karakteristiskt kännetecken för det överkänsliga svaret (HR; Dodds och Rathjen, 2010). FÖRBÄTTRAD SJUKDOMSMÄTTSLIGHET 1 (EDS1), en central regulator av växtimmunitet, hjälper till att kontrollera basal resistens genom att begränsa invasionen av biotrofa och hemibiotrofa patogener (Wiermer et al., 2005). EDS1 spelar också en viktig roll i ETI, som huvudsakligen förmedlas av TNL-klassen av R-proteiner (Heidrich et al., 2012). EDS1 arbetar nära med sina samregulatorer PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 och SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101 i cytoplasman och/eller kärnan för att reglera produktionen av intracellulära reaktiva syrearter (ROS), ackumulering av salicylsyra (SA) och andra processer, vilket förstärker patogenresistens (rost) 'rucci et al., 2001; Rietz et al., 2011; Wagner et al., 2013). Följaktligen är Arabidopsis eds1-mutanten mycket känslig för Pseudomonas syringae pv. tomat (Pst) stam DC3000 och visar en komprometterad TNL-medierad ETI, i vilken uttryck av ISOCHORISMATE SYNTHASE1 (ICS1; en SA biosyntetisk gen) och SA biosyntes hämmas (Parker et al., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et al., 2001; Bartsch et al. al., 2006). Dessutom uppvisar EDS1 proteintrafik mellan cytoplasman och kärnan förmedlad av nukleära transportreceptorer (Garcı´a et al., 2010). Även om de nukleära funktionerna hos EDS1 involverar basal resistens och ROS-produktion, kräver programmerad celldöd och resistensförstärkning koordinering av den nukleära kontra cytoplasmatiska lokaliseringen av EDS1 (Heidrich et al., 2011). En balans mellan mängden EDS1 i cytosolen och mängden i kärnan är viktig för effektiv basal resistens och TNL-utlöst immunitet (Garcı´a et al., 2010). Men hur EDS1 upprätthåller det nukleocytoplasmatiska distributionsmönstret under växtens medfödda immunsvar är fortfarande oklart. DnaJ-proteiner (eller J-proteiner) är chaperoneproteiner (Pulido och Leister, 2018) som tillhör den cystein- (Cys)-rika domänsuperfamiljen och deltar i veckningen och sammansättningen av nystartade proteiner, transport av proteiner över membran med efterföljande återveckning, och bortskaffande av oveckade eller defekta proteiner (Bukau et al., 2006). Dessa processer krävs för normal funktion av de flesta cellulära proteiner i olika utvecklingsstadier (Pulido och Leister, 2018). Forskning i olika organismer visar att DnaJ-proteiner också spelar olika roller i biotiska och abiotiska stressreaktioner, särskilt i immunsvar. I Nicotiana benthamiana fungerar DnaJ-protein Nb-MIP1 som en cochaperon i svaret på virala patogener (Du et al., 2013). Soybean (Glycine max L.) Gm-heat shock protein 40 (HSP40.1), ett kärnlokaliserat DnaJ-protein, är en positiv regulator av resistens mot sojabönmosaikvirus (Liu och Whitham, 2013). I tomater (Solanum lycopersicum) rapporterades det kloroplastlokaliserade DnaJ-proteinet, Le-CDJ2, förbättra resistens mot bakteriepatogenen Pseudomonas solanacearum (Wang et al., 2014). Dessutom rapporterades Tsi1- interagerande protein1 (Tsip1), ett tobaks (Nicotiana tabacum) DnaJ-protein, reglera Tsi1-förmedlad transkriptionell aktivering som svar på stress (Ham et al., 2006). Dessa resultat indikerar tydligt att DnaJ-proteiner spelar en viktig roll i växtimmunitet, även om de underliggande mekanismerna kräver ytterligare undersökning. I den här studien isolerade vi Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1 (EIJ1), ett HSP 40-liknande DnaJ-protein, och visade att EIJ1 interagerade med EDS1 i planta. Förlust-av-funktion eij1 mutantväxter visade normal tillväxt, starkare patogenresistens och högre uttryck av resistensrelaterade gener vid infektion av patogener jämfört med vildtypsväxter. Emellertid räddade förlust-av-funktionsmutationen av EIJ1 inte den mottagliga fenotypen av eds1-mutanten vid utmaning med Pst DC3000. Dessutom frigjordes EIJ1-proteinet, som normalt lokaliseras till kloroplasten, från kloroplasten till cytoplasman vid patogenympning, där det interagerade med EDS1, vilket förhindrade dess patogenutlösta trafik till kärnan och därmed äventyrade resistenssvaret vid ett tidigt stadium. infektionsstadiet. Dessa fynd belyser viktiga detaljer om den regleringsmekanism som ligger bakom det nukleocytoplasmatiska distributionsmönstret för EDS1 och ger ett potentiellt effektivt mål för sjukdomsresistensuppfödning i grödor.

cistanche fördelar-stärker immunförsvaret

Resultat

EIJ1 interagerar med EDS1 in vitro och in vivo

Som en viktig komponent i växtförsvarssvar är EDS1 placerad vid en nyckelnod i växtens medfödda immunitetssignaleringsnätverk. För att identifiera potentiella interagerande proteinpartners av EDS1 utförde vi en tvåhybridscreening av jäst. EDS1 visade stark interaktion med ett Arabidopsis HSP40--liknande chaperonprotein (AT2G24860) med en okänd funktion (Figur 1, A och B), som tillhör DnaJ-superfamiljen (Supplemental Figur 1A); detta protein benämns härefter EIJ1. Sekvensanalys visade att EIJ1 innehåller 144 aminosyrarester, inklusive fyra Cys-rika Zn-fingermotiv (CXXCXGXG; tilläggsfigur 1A). Även om andra angiosperm-arter har homologer av EIJ1, verkar de närmaste homologerna vara begränsade till Brassicaceae (tilläggsfigur 1B och fil S1). Noterbart visade EIJ1 sekvenslikhet med N. tabacum Tsip1-proteinet, som är involverat i patogenresistens (kompletterande figur 1B; Ham et al., 2006). För att identifiera de funktionella domänerna som är ansvariga för interaktionen mellan EDS1 och EIJ1 användes två trunkerade versioner av dessa proteiner i tvåhybridanalyser av jäst (Figur 1A; Kompletterande Figur 1A). N-terminalen av EIJ1 visade stark interaktion med fullängds EDS1 såväl som EDS1 N-terminal men en svag interaktion med EDS1 C-terminal (Figur 1B). Detta tyder på att N-terminalen av EDS1, som innehåller en lipasliknande domän, och N-terminalen av EIJ1 är nödvändiga och tillräckliga för deras interaktion. Även om C-terminalen av EIJ1 innehåller en konserverad Cys-rik Zn-fingerdomän som kan underlätta dess bindning till DNA eller andra proteiner, bidrar den inte till interaktionen med EDS1. Pull-down-analyser verifierade ytterligare interaktionen mellan EDS1 och EIJ1 in vitro (Figur 1C), medan co-immunoprecipitation (Co-IP) analyser med 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG transgena växter bekräftade deras interaktion i planta (Figur 1D). Sammantaget visar dessa resultat att EDS1 interagerar med EIJ1 både in vitro och in vivo. Karakterisering av EIJ1 För att bestämma den subcellulära lokaliseringen av EIJ1 fusionerade vi den öppna läsramen EIJ1 med mCherry-reportergenen under kontroll av blomkålsmosaikvirus 35S-promotorn för att generera 35Spro: EIJ1-mCherry-konstruktionen. Denna konstruktion transformerades tillfälligt till N. benthamiana-löv genom agroinfiltration. Fluorescensmikroskopi visade att EIJ1-mCherry var lokaliserad till både kloroplasten och kärnan (Figur 2A). Detta lokaliseringsmönster bekräftades genom immunoblotanalys av transgena 35Spro: EIJ1-6HA-växter (tilläggsfigur 2). För att undersöka uttrycksmönstret för EIJ1, fusionerades den genomiska sekvensen av EIJ1 med ß-glukuronidas (GUS) reportergenen för att generera EIJ1pro: EIJ1-GUS transgena Arabidopsis-linjer. Stark GUS-aktivitet detekterades i rosettblad och rötter; GUS-aktiviteten var dock svag i siliques och odetekterbar i stjälkar och blommor (Figur 2B). Dessa resultat överensstämde med uttrycksresultaten för EIJ1, som undersöktes med kvantitativ omvänd transkription-PCR (RT-PCR) i olika vävnader (Figur 2C). Med tanke på att EDS1 är en central regulator av växtimmunitet (Saikat et al., 2011), undersökte vi om EIJ1, en förmodad kofaktor för EDS1, också är engagerad i svaret på patogeninfektion. Transkriptionsnivån av EIJ1 inducerades genom behandling med antingen hemibiotrofa bakterier Pst DC3000 eller SA (Figur 2D). GUS-färgning avslöjade att EIJ1 inducerades och markant koncentrerades runt trikomerna i Pst DC 3000-ympade löv (Figur 2E–G), vilket antyder en möjlig biologisk relevans av EIJ1 i försvarssvar (Xin och He, 2013). Därefter undersökte vi nivån av EIJ1 i 35Spro: EIJ1-HA-växter behandlade med Pst DC3000 eller SA. Intressant nog, vid Pst DC3000- eller SA-behandling, bröts EIJ1 ned gradvis efter en snabb induktion (Figur 2, H och I). Detta resultat överensstämde inte med det stabila uttrycksmönstret av EIJ1-HA som observerats i 35Spro: EIJ1-HA-växter under patogeninfektion (kompletterande figur 3), vilket indikerar posttranskriptionell reglering av EIJ1. Tillsammans tyder dessa resultat på att EIJ1 är involverad i växtimmunsvaret.

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

En mutation med förlorad funktion av EIJ1 ökar resistensen mot Pst DC3000 via SA-vägen

För att undersöka rollen av EIJ1 i växtimmunitet identifierade vi en Arabidopsis-mutant (SALK_142975) innehållande en T-DNA-insättning i den tredje exonen av EIJ1 (Figur 3, A och B). Kvantitativ RT-PCR-analys visade att EIJ1 uttrycktes dåligt i denna eij1 T-DNA-insättningsmutant; därför döpte vi denna EIJ1-allel eij{{10}} (Figur 3C). Därefter utvärderade vi sjukdomsresistensfenotypen för 3-veckogamla eij1-1 muterade växter och Arabidopsis (A. thaliana) ekotyp Columbia (Col-0; vildtyp) växter genom inokulering med Pst DC3000. Bedömning av de infekterade bladen 5 dagar efter ympning (dpi) visade färre nekrotiska lesioner på eij1-1-blad än på Col-0-blad (Figur 3D). Konsekvent visade eij1-1-bladen en signifikant lägre bakterietiter än Col-0-bladen vid 5 dpi, även om bakterietitern inte visade någon skillnad mellan Col-0 och eij1-1-bladen vid 0 dpi (Figur 3E). Därefter genererade vi eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA-komplementeringslinjer genom att transformera ett EIJ1-genomiskt fragment sammansmält med en 6xHA-taggsekvens till eij1-1-bakgrunden. Komplementeringslinjerna räddade fullständigt patogenresistensfenotypen av eij1-1 (Figur 3E), vilket stöder att eij1-1 är en mutant med förlorad funktion. För att bestämma effekten av EIJ1 på apoplastisk immunitet, utvärderades sjukdomsresistensfenotypen för dessa komplementeringslinjer också genom tryckinfiltration av Pst DC3000, och liknande resultat erhölls (kompletterande figur 4A). För att bekräfta funktionen av EIJ1 identifierade vi sedan en annan Arabidopsis-mutant eij1-2 (WiscDsLox343G09), som innehöll en T-DNA-insättning i promotorregionen av EIJ1 (kompletterande figur 5, A och B). EIJ1-transkripten var knappt detekterbara i eij1-2-mutanten, vilket indikerar att eij1-2 är en nollallel av EIJ1. I likhet med eij1-1 visade bakterietillväxtanalyser att eij1-2 var närvarande vid en signifikant lägre bakterietiter än Col-0 (kompletterande figur 5, D och E). Sammanfattningsvis indikerar dessa resultat att EIJ1 spelar en viktig repressiv roll i växtens immunsvar.

Figur 1 EIJ1 interagerar med EDS1 in vitro och i planta. (A) Schematiskt diagram som visar domänerna som finns i EIJ1, EDS1 och deras trunkerade versioner. (B) Jäst två-hybridanalyser visar interaktionerna mellan EIJ1, EDS1 och deras trunkerade versioner. Transformerade jästceller odlades på SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade och SD/-Trp/-Leu-medium. Tomma kontroller endast vektor; AD, aktiveringsdomän; BD, DNA-bindande domän. (C) Pull-down analys som visar den direkta interaktionen mellan His-EIJ1 och GST-EDS1 fusionsproteiner in vitro. His-EIJ1-proteiner inkuberades med immobiliserat GST- eller GST-EDS1-protein. Immunutfällda fraktioner detekterades av anti-His- respektive anti-GST-antikroppar. (D) Co-IP som visar interaktionen mellan EIJ1 och EDS1 i blad av Arabidopsis. Totalt antal proteiner extraherat från 3-veckogamla 35Spro: EIJ1-6HA (som genotypkontroll) och 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG-blad immunutfälldes av antingen en anti-FLAG-antikropp eller ett preimmunserum (IgG). De samimmunutfällda proteinerna detekterades med användning av anti-FLAG- respektive anti-HA-antikroppar. De representativa resultaten som presenteras i (B–D) upprepades oberoende tre gånger.

Produktionen av väteperoxid (H2O2), en typ av reaktiva syrearter, är ett kännetecken för framgångsrikt igenkännande av patogener och efterföljande aktivering av växtförsvarssvar, inklusive HR-relaterad programmerad celldöd (Lam et al., 2001; Torres et al. al., 2006; Nanda et al., 2010). Därför övervakade vi nivån av H2O2 i 3-veckogamla patogen-inokulerade Col-0, eij1-1 och eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA växter som använder 3,3-diaminobensidin (DAB)-färgningsmetoden. Resultaten visade att H2O2 ackumulerades till höga nivåer i de infekterade växterna men detekterades inte i de oinokulerade (sken) växterna (Figur 3F). En högre nivå av H2O2 detekterades i eij1-1-löven än i bladen på Col- 0 och komplementeringslinjer inokulerade med Pst DC3000 (Figur 3F). Dessutom, medan trypanblå färgning avslöjade att celldöd (microHR, Alvarez et al., 1998) inträffade i eij1-1-löven vid 24-h efter inokulering (HPI) med Pst DC3000, men ingen microHR observerades i Col-0 och eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA-växter (Figur 3G). Inokulering med avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) resulterade i en högre ackumulering av H2O2 och mer microHR, även om ingen synlig skillnad observerades mellan dessa tre genotyper (Figur 3, F och G). Dessa resultat antydde en viktig roll för EIJ1 i basal resistens mot patogener.

Figur 2 Uttrycksmönster för EIJ1 mRNA och protein. (A) Kloroplast och kärnlokalisering av EIJ1. Ett EIJ1-mCherry-fusionsprotein uttrycktes övergående i N. benthamiana-blad och analyserades med konfokalmikroskopi. DAPI-fluorescens indikerar kärnan. Klorofyllfluorescens indikeras som grön färg. Bar=10 lm. (B) GUS-färgning som visar uttrycket av EIJ1 i rötter, stjälkar, rosettblad, blommor, siliques och 10-daggamla plantor (från vänster till höger). Stapel=1 mm. (C) Uttrycksmönster av EIJ1 i olika vävnader av Col-växter inklusive rötter, stjälkar, rosettblad, blommor och siliques, som detekterats av qRT-PCR. Det relativa uttrycket beräknades genom att normalisera transkriptionsnivån för den undersökta genen mot den för ACTIN2 (samma som nedan). Data är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat. Små bokstäver indikerar signifikanta skillnader (envägs ANOVA, P 5 0.01; Kompletterande datamängd 1). (D) Expressionsanalys av EIJ1 med användning av 3-veckogamla Col-plantor dopp-inokulerade med Pst DC3000 (OD600=0.1) eller besprutade med 0,05 mM SA. Uppgifterna är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat (Supplemental Data Set 1). (EG) GUS-färgning visar induktionen av EIJ1-uttryck av patogener. Tre veckor gamla pEIJ1:EIJ1-GUS-växter sken-ympades (10 mM MgCl2; E) eller dopp-inokulerades med Pst DC3000 (OD600=0.1; F). Stapel=1 mm. Den förstorade bilden indikerar att EIJ1-GUS koncentreras till trikomregionen i (G). Bar=100 lm. Blad vid 4 hpi skördades och inkuberades med en GUS-färgningslösning. (H) och (I) Expressionsmönster för EIJ1 efter Pst DC3000- eller SA-behandling. Totalt antal proteiner extraherades från 3-veckogamla 35Spro: EIJ1-6HA-växter som doppats med Pst DC3000 (OD600=0.1; H) eller besprutats med 0,05 mM SA (I), och detekteras med användning av en anti-HA-antikropp. De nedre panelerna visar färgning med Coomassie Brilliant Blue (CBB) som laddningskontroll. Immunoblotanalyserna presenterade i (H) och (I) upprepades oberoende tre gånger.

Figur 3 Identifiering av den muterade Arabidopsis EIJ1-allelen eij1-1. (A) Schematiskt diagram som visar T-DNA-insättningsstället i eij1-1 (SALK_142975). Exoner representeras av rutor och introner av linjer mellan rutorna. Svarta rutor presenterar EIJ1-kodningsregionerna och vita rutor representerar den oöversatta regionen. Triangeln indikerar insättningsstället för T-DNA. (B) PCR-amplifiering av genomiskt DNA bekräftar att eij1-1 är en homozygot insättningsmutant. De använda primrarna (P1, P2) visas i (A). LB indikerar T-DNA:s vänstra gränsprimer och M indikerar DNA-molekylmarkörerna. (C) QRT-PCR-analys av EIJ1-uttryck. Totalt RNA extraherades från 3-veckogamla eij1- och Col-blad. Det relativa uttrycket av EIJ1 i eij1-1 sattes till 1. Data är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat (kompletterande datamängd 1). (D) Sjukdomsresistensfenotypen av Col, eij1-1 och två representativa EIJ1-komplementerande transgena linjer eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA. Tre veckor gamla plantor dopp-ympades med Pst DC3000 (OD600=0.05). De visade bladen fotograferades vid 5 dpi. Staplar=5 mm. (E) Bakterietillväxt av Pst DC3000 på växter som beskrivs i (D) vid 0 och 5 dpi. cfu/g, kolonibildande enheter per g färskvikt. Data är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat. Små bokstäver indikerar signifikanta skillnader (envägs ANOVA, P 5 0.01, tilläggsdatauppsättning 1). (F) Undersökning av H2O2-nivåer i blad av Col,

EIJ1 förmedlar växtimmunitet genom att undertrycka EDS1-aktivitet

För att förstå det genetiska sambandet mellan EDS1 och EIJ1 genererade vi eij1-1 eds1-22 dubbla mutantlinjer genom att korsa eij1-1-mutanten med eds1-22, en förlust av- funktionsmutant allel av EDS1-90 (AT3G48090; Col-0 bakgrund), som uppvisar försämrad patogenresistens (Yang och Hua, 2004). Ingen morfologisk skillnad observerades mellan eij1-1, eds1-22 och eij1-1 eds1-22 muterade växter under normala tillväxtförhållanden (Figur 4, A och B). Efter inokulering med Pst DC3000 visade eij1-1-mutantväxterna starkare resistens än Col-0-växter vid 5 dpi (Figur 4, A och B). Emellertid uppvisade eij1-1 eds1-22 dubbelmutanten anmärkningsvärda nekrotiska lesioner och hög bakterietiter, jämförbar med eds1-22 enkelmutanten, vilket indikerar att eij1-1-allelen inte kunde för att rädda den sjukdomskänsliga fenotypen av eds1-22 (Figur 4, A och B). Sjukdomsresistens utvärderades också efter tryckinfiltration av Pst DC3000, och liknande resultat erhölls (kompletterande figur 4B). Dessutom använde vi EDS1-nullallelen, eds1-2; Col-0 bakgrund; Bartsch et al., 2006), för att generera eij1-1 eds1-2 dubbelmuterade växter för genetisk analys. I likhet med eij1-1 eds1-22, visade eij1-1 eds1-2 dubbelmuterade växter också anmärkningsvärda nekrotiska lesioner och högre bakterietiter än eij1-1, vilket var jämförbar med eds1-2 singelmutanten (tilläggsbild 6). Dessa genetiska bevis tyder på att EDS1 är epistatisk mot EIJ1. I enlighet med ovanstående observationer ackumulerades H2O2 till höga nivåer i eij1-1 blad men till låga nivåer i eds1- 22 och eij1-1 eds1-22 blad, jämfört med Col{{ 53}} lämnar, efter Pst DC3000-ympning (Figur 4C). Dessutom undertrycktes microHR i eij1-1 tydligt av funktionsförlusten av EDS1 vid 24 hpi med Pst DC3000 eller avirulent Pst DC3000 (AvrRps4; Figur 4D). I enlighet med detta resultat var uttrycksnivåerna för ICS1 och PR1 i eij1-1 eds1-22 och eds1-22-växter jämförbara men betydligt lägre än de i eij1-1 och Col{ {71}} växter (Figur 4E). Dessa resultat stöder att EIJ1-förmedlad medfödd immunrespons är beroende av EDS1. För att undersöka rollen av EIJ1–EDS1-interaktion i växtimmunsvaret utförde vi RNA-seq-analys av eij1-1, eds1-22 och Col-0-blad vid 24 hpi med Pst DC3000 ; med oinokulerade Col-0-blad användes som en skenbehandling. Totalt 2762, 923 och 622 differentiellt uttryckta gener (DEG) identifierades i Col_Pst DC3000 kontra Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 kontra Col_ Pst DC3000 och eds1-22_Pst DC3000 kontra Col_Pst DC3000 jämförelser. Dessa gener hänvisas härefter till som patogenresponsiva, EIJ1-reglerade respektive EDS{100}}reglerade gener (tilläggsfigur 7A och datauppsättning 2). Bland dessa gener reglerades 471 av EIJ1; 396 reglerades av EDS1 (Figur 4F; Kompletterande datauppsättning 2); och 124 samreglerades av EIJ1 och EDS1 (Figur 4F). Klusteranalys visade att 93,5 % (116) av de samreglerade generna (124) uppreglerades av EDS1 och nedreglerades av EIJ1 (Figur 4F; Kompletterande figur 7B och Dataset 2), vilket stöder EIJ1:s repressiva roll på EDS1 funktion. Analys av genontologi (GO) visade vidare att de flesta av generna som regleras antagonistiskt av EIJ1 och EDS1 huvudsakligen är involverade i stresssvar och medfödda immunsvar (Figur 4G; Kompletterande tabell S1). Dessa analyser tyder på att EIJ1 och EDS1 reglerar resistensrelaterade gener på ett kontrasterande sätt under patogeninfektion. En avsevärd del av de EDS1-reglerade generna (272/396) reglerades inte av EIJ1, förmodligen på grund av den lägre veckförändringen (52) eller EIJ1-oberoende funktion hos EDS1.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1 interagerar med EDS1 i cytoplasman och hämmar den nukleära handeln med EDS1

EIJ1 är lokaliserat till kloroplasten och kärnan i bladceller (Figur 2A), medan EDS1-protein uppvisar ett nukleocytoplasmatiskt distributionsmönster, som förekommer på båda ställena (Garcı´a et al., 2010). För att undersöka var och hur EIJ1 interagerar med EDS1 i planta, utförde vi transienta expressionsanalyser med Arabidopsis-protoplaster. Intressant nog, även om EIJ1 bibehöll sitt ursprungliga subcellulära lokaliseringsmönster i kloroplasten och kärnan i närvaro av det gröna fluorescerande proteinet (GFP; kontroll), diffunderades den kloroplastlokaliserade EIJ1-mCherry i cytoplasman när den uttrycktes samtidigt med EDS{ {9}}GFP i protoplaster (Figur 5A, se replikat i tilläggsfil 2). Detta fenomen bekräftades i N. benthamiana epidermala celler, i vilka EIJ1-mCherry tillfälligt uttrycktes samtidigt med antingen EDS1-GFP eller GFP-kontrollen (tilläggsbild 8, se replikat i tilläggsfil 2) . Dessa observationer indikerar att EDS1-överuttryck kan leda till subcellulär omlokalisering av EIJ1. Därefter, för att bestämma den subcellulära platsen där EDS1 och EIJ1 interagerar, utförde vi en neddragningsanalys med det rekombinanta Glutation S-Transferase (GST) -EDS1 fusionsproteinet (bete) och totalt proteinextrakt, kärnutarmade fraktioner och kärnor. berikade fraktioner av 35Spro: EIJ1-HA transgena linjer (bytesproteiner). Våra resultat visade att EDS1 immunutfälldes med EIJ1-HA när man använde det totala proteinextraktet och kärnutarmade fraktioner av 35Spro: EIJ1-HA-blad, men det gjorde det inte när man använde de kärnanrikade fraktionerna (Figur 5B), vilket tyder på att interaktionen mellan EIJ1 och EDS1 sker i cytoplasman.

Figur 4 EIJ1 och EDS1 reglerar motsatt växtresistens mot patogener. (A) Sjukdomsresistensfenotypen av Col, eij1-1, eds1-22 och eij1-1 eds1-22. Tre veckor gamla plantor dopp-inokulerades med Pst DC3000 (OD600=0.05). De visade bladen fotograferades vid 5 dpi. Stapel=5 mm. (B) Bakterietillväxt av Pst DC3000 på växter som beskrivs i (A) vid 0 och 5 dpi. Data är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat. Små bokstäver indikerar signifikanta skillnader (envägs ANOVA, P 5 0.01, tilläggsdatauppsättning 1). (C) Undersökning av H2O2-nivåer i Col, eij1-1, eds1-22 och eij1-1 eds1-22 växter. Tre veckor gamla plantor doppades med Pst DC3000 eller Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) och färgades sedan med DAB vid 24 hpi. Bar=500 lm. (D) Celldödsanalys av Col, eij1-1, eds1-22 och eij1-1 eds1-22 växter. Tre veckor gamla plantor diinokulerades med Pst DC3000 eller Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1), och färgades sedan med trypanblått vid 24 hpi. Bar=500 lm.

Med tanke på att EIJ1 negativt reglerar växternas immunsvar på ett EDS1-beroende sätt (Figur 4), undersökte vi nästa effekt av patogener på interaktionen mellan EIJ1 och EDS1. Överraskande nog förbättrade Pst DC3000-infektion EDS1–EIJ1-interaktionen i cytoplasman snarare än i både kloroplasten och kärnan (Figur 5C, se replikat i tilläggsfil 2). Detta fynd, tillsammans med det nukleo-cytoplasmatiska distributionsmönstret för EDS1 och rollen av EDS1 nukleär lokalisering i förstärkningen av patogenresistens på transkriptionsnivå (Garcı´a et al., 2010), tvingade oss att undersöka rollen av EIJ1 i den subcellulära handeln med EDS1 under patogeninfektion. När vi tillfälligt uttryckte EDS1-3FLAG i Arabidopsis-protoplaster isolerade från eij1-1-, EIJ1-överuttryck och Col-0-växter, undertryckte EIJ1 särskilt handeln med EDS1 in i kärnan (tilläggsbild 9) . Dessutom avslöjade immunoblotanalys liten skillnad i mängden av totalt EDS1-protein mellan eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG och eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} }FLAG transgena växter (Figur 5D, se replikat i tilläggsfil 2). Jämfört med utg i nivån av kärnanrikat EDS1-protein och en minskning av nivån av cytoplasma-lokaliserad EDS1 (Figur 5D, se replikat i tilläggsfil 2), vilket bekräftar den repressiva rollen av EIJ1 i cytoplasma-till-kärna-trafiken av EDS1. Därefter testade vi om denna omfördelningsprocess förmedlad av EIJ1-EDS1-interaktionen påverkade transkriptionsregleringen av resistensrelaterade gener i växter. Effektorkonstruktionerna 35Spro: EIJ1-mCherry och 35Spro: EDS1-3FLAG transformerades individuellt eller tillsammans med reporterkonstruktionerna till N. benthamiana bladepidermala celler (Figur 5E). Vid 24 hpi med Pst DC3000 aktiverade EDS1 uttrycket av PR1 och ICS1 (Figur 5F), medan EIJ1 markant hämmade EDS1--inducerat genuttryck (Figur 5F). Till skillnad från EIJ1 i full längd kunde den N-terminala änden av EIJ1-proteinet, som är opåverkad i eij1-1, inte hämma det EDS1--inducerade PR1-uttrycket (kompletterande figur 10, A och B) ), vilket indikerar att den intakta proteinstrukturen hos EIJ1 är nödvändig för dess repressiva funktion. Tillsammans stöder dessa resultat att EIJ1 fungerar som en viktig repressor i EDS1-förmedlad resistensrespons genom att reglera nukleocytoplasmatisk trafik av EDS1. Eftersom EIJ1-proteinet gradvis bröts ned i Pst DC3000-ympade eller SA-behandlade växter efter en snabb initial induktion (Figur 2, H och I), undersökte vi om EDS1 i sin tur utlöser nedbrytningen av EIJ1 via en interaktion mellan protein och protein. Cellfria nedbrytningsanalyser och in vivo proteindetektionsanalyser med eds1-22 35Spro: EIJ1-HA transgena växter visade att varken frånvaron eller närvaron av EDS1 påverkade EIJ1-nedbrytningen (kompletterande figur 11), vilket tyder på att EDS1 är inte involverad i den patogenutlösta nedbrytningen av EIJ1.

Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret

Patogeninfektion förändrar den subcellulära lokaliseringen av EIJ1

Den förbättrade interaktionen mellan EIJ1 och EDS1 i cytoplasman vid patogeninokulering (Figur 5, B och C) antydde en möjlig patogenutlöst omlokalisering av EIJ1 i växtceller. För att testa denna möjlighet undersökte vi den subcellulära lokaliseringen av EIJ1 i N. benthamiana-löven inokulerade med Pst DC3000. Under oinfekterade förhållanden var EIJ1-mCherry lokaliserad till kloroplasten och kärnan. Vid 24 dpi minskade emellertid fluorescenssignalerna kraftigt i kloroplasterna och förstärktes i cytoplasman (Figur 6A). För att ytterligare bestämma om patogener utlöser disassociationen av EIJ1 från kloroplasten till cytoplasman i bladen, utfördes immunoblotanalys av EIJ1-protein med 35Spro: EIJ1-6HA transgena växter. Totala proteiner, kloroplastproteiner och cytoplasmatiska proteiner isolerades från 35Spro: EIJ1-6HA transgena växter vid 0 och 4 hpi med Pst DC3000. Förekomsten av EIJ1 ökade anmärkningsvärt i den cytoplasmatiska fraktionen men minskade i kloroplastfraktionen vid 24 dpi (Figur 6B, se replikat i tilläggsfil 2), vilket indikerar en negativ korrelation mellan EIJ1-proteinnivåerna i kloroplasten och cytoplasman.

Figur 5 EIJ1 interagerar med EDS1 i cytoplasman för att förmedla nukleär handel med EDS1. (A) Transient expressionsanalys som visar lokaliseringen av EDS1 och EIJ1 i Arabidopsis-protoplaster. Bar=10 lm. (B) Pull-down analys av interaktion mellan EIJ1 och EDS1. Totala proteiner, kärnutarmade fraktioner och kärnanrikade fraktioner extraherade från 3-veckogamla eij1-1 35Spro: EIJ1-6HA transgena växter inkuberades med immobiliserade GST-EDS1- eller GST-proteiner , respektive. IP:er detekterades med anti-HA- eller anti-GST-antikroppar. PEPC och histon H3 användes som cytoplasmatiska respektive nukleära markörer. Asterisker indikerar banden av GST-EDS1-proteiner. (C) Pst DC3000-infektion förbättrar proteininteraktionen mellan EDS1 och EIJ1 i cytoplasman. Totala proteiner, kärnutarmade fraktioner, kärnanrikade fraktioner och kloroplastproteiner extraherades från 3-veckogamla EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG-växter som doppats med Pst DC3000 (OD600=0.1) eller skeninokulerad vid 4 hpi och immunutfälld med antingen en anti-FLAG-antikropp eller ett preimmunserum (IgG). De samimmunoutfällda proteinerna detekterades med användning av anti-HA- och anti-FLAG-antikroppar. N-utarmade, kärnutarmade fraktioner; N-berikade, kärnanrikade fraktioner. PEPC och histon H3 användes som cytoplasmatiska respektive nukleära markörer. (D) Immunoblotanalys visar att EIJ1 förmedlar den cytoplasmatiska kontra nukleära distributionen av EDS1. Totala proteiner, kärnutarmade fraktioner och kärnanrikade fraktioner extraherades från 3-veckogamla eds1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG och eij1-1 eds{{59 }} EDS1pro: EDS1-3FLAG-transgena växter dopp-inokulerade med Pst DC3000 (OD600=0.1) eller skeninokulerade vid 4 hpi och detekterade med en anti-FLAG-antikropp. Den relativa intensiteten av proteiner från eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG med skeninokuleringsbehandlingen inställd på 1. M, mock; P, Pst DC3000. PEPC och histon H3 användes som cytoplasmatiska respektive nukleära markörer. Resultaten som presenteras i (A), (C) och (D) upprepades oberoende tre gånger (tilläggsfil 2). (E) och (F) Övergående analys av PR1- och ICS1-promotoraktivitet reglerad av EIJ1 och EDS1. Olika konstruktioner som används i transienta expressionsanalyser visas i (E). Antingen PR1pro: GUS eller ICS1pro: GUS samtransformerades med effektorer eller den tomma vektorn (Kontroll) till N. benthamiana-blad spayerade med Pst DC3000 (OD600=0.1) i 24 timmar. Relativ GUS-aktivitet (GUS/Luciferas) som indikerar uttrycksnivån för PR1 och ICS1 som regleras av olika effektorer visas i (F). Uppgifterna är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat (Supplemental Data Set 1). Små bokstäver indikerar signifikanta skillnader (envägs ANOVA, P 5 0.01).

Patogenutlöst EIJ1-dissociation från kloroplasten antyder en potentiell funktion av EIJ1 i cytoplasman. För att testa denna möjlighet immobiliserade vi EIJ1-proteinet på kloroplasterna genom att fästa den kloroplastinriktade sekvensen (CTS; Lee et al., 2008) till den N-terminala änden av EIJ1-mCherry-reportergenen. CTS-EIJ1-mCherry-fusionen uttrycktes sedan i N. benthamiana-blad under kontroll av den naturliga promotorn. Fluorescens detekterades endast i kloroplasterna, men inte i cytosolen och kärnan av Pst DC3000-ympade N. benthamiana-blad (kompletterande figur 12A). Denna observation bekräftade att den CTStaggade EIJ1 hölls kvar i kloroplasten och inte tvingades in i cytoplasman av patogeninfektion. Vi genererade sedan EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA transgena Arabidopsis-linjer för att utvärdera den biologiska funktionen av CTS-EIJ1 i växtimmunsvaret. Som förväntat, till skillnad från eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA, visade eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA-linjerna ingen signifikant skillnad i resistens mot patogener jämfört med eij1-1, vilket indikerar att EIJ1 immobiliserad i kloroplasten inte kan rädda sjukdomsresistensfenotypen av eij1-1 (Figur 6C). I enlighet med denna observation bibehölls uttrycket av PR1 på en hög nivå i eij1-1 EIJ1pro: CTSEIJ1-6HA transgena växter, liknande eij1-1 (tilläggsbild 12B). Dessutom uppvisade CTS-EIJ1 mindre förmåga att undertrycka EDS1-transkriptionsaktivitet än EIJ1 (Figur 6, D och E). Dessa resultat fick oss att dra slutsatsen att tidig värdrespons på patogeninfektion utlöser den subcellulära omlokaliseringen av EIJ1, vilket i sin tur modulerar immunsvaret genom att undertrycka handeln med EDS1 in i kärnan.

EIJ1 reglerar det virulenseffektorutlösta svaret

AvrRps4-effektorproteinet från P. syringae som utsöndras av typ III-sekretionssystemet känns igen av TIR-NB-LRR-receptorn RPS4 för att initiera ETI, som är beroende av EDS1 (Gassmann et al., 1999; Wirthmueller et al., 2007; Heidrich et al., 2012). Vi inokulerade eij1-1 blad med den avirulenta Pst DC3000 (AvrRps4) eller virulenta Pst DC3000 för att bedöma om EIJ1 är involverad i ETI. eij1-1-löven visade större resistens mot virulent Pst DC3000 än Col-0-löven (Figur 7A). Ingen signifikant skillnad observerades dock mellan Col-0 och eij1-1 blad i resistens mot avirulent Pst DC3000 (AvrRps4), även om båda genotyperna visade större resistens mot avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) än mot Pst DC3000 ( Figur 3, F och G; Figur 7, A), vilket indikerar att EIJ1 kanske inte är nödvändig för RPS4-inducerad ETI. Vi bestämde också resistensen hos växter mot Pst DC3000 hrcC, som har ett defekt typ III-sekretionssystem och misslyckas med att injicera effektorer i värdceller för att undertrycka PTI (Gassmann et al., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Både eij1-1-mutanten och Col-0-löven visade liknande resistens mot Pst DC3000 hrcC (tilläggsfigur 13), vilket tyder på att EIJ1 inte är involverad i PTI.

Med tanke på att kärnackumuleringen av EDS1 är oumbärlig för den TIR-NB-LRR-inducerade omprogrammeringen av försvarsgenuttryck och resistens (Garcı´a et al., 2010), undersökte vi om EIJ1 reglerar den subcellulära distributionen av EDS1 som svar på ETI. Blad av 3-veckogamla eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG och eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-växter inokulerades med antingen Pst DC3000 eller Pst DC3000 (AvrRps4), och de kärnutarmade och kärnanrikade fraktionerna extraherades vid 0 och 4 hk. I enlighet med den tidigare studien (Garcı´a et al., 2010), observerades en ökning av kärnkraftslokalisering av EDS1 i eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-växter inokulerade med Pst DC3000 (AvrRps4), men inte i de som inokulerats med Pst DC3000. Förlusten av EIJ1-funktionen påverkade dock inte den ETI-inducerade kärnackumuleringen av EDS1 (Figur 7B; se replikat i tilläggsfil 2). Detta tyder på att den avirulenta Pst DC3000 (AvrRps4) antingen utlöser trafficking av EDS1 in i kärnan genom att kringgå EIJ1 eller avskaffar funktionen av EIJ1 på ett okänt sätt. För att testa dessa möjligheter undersökte vi effekten av avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) på ​​nivån av EIJ1. I likhet med resultaten som erhölls med EIJ1-överuttryckslinjer (Figur 2H), visade eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA-växterna inokulerade med Pst DC3000 ökad EIJ1-ackumulering i ett tidigt skede av infektion, även om EIJ1 gradvis skedde degraderas efter 8 hpi (Figur 7C; se replikat i tilläggsfil 2). Ackumuleringen av EIJ1 är tillräcklig för att förhindra Pst DC3000-utlöst trafik av EDS1 in i kärnan i ett tidigt infektionsstadium (figur 5, D och 7, B). I överensstämmelse med detta resultat accelererade förlusten av EIJ1-funktion kärntranslokationen av EDS1 i infekterade växter (kompletterande figur 14). Däremot avskaffade Pst DC3000 (AvrRps4) EIJ1-funktionen genom att snabbt inducera EIJ1-proteinnedbrytning, men inte genom att undertrycka EIJ1-gentranskription (Figur 7C; Kompletterande Figur 15), vilket främjade mer nukleär translokation av EDS1 i det tidiga infektionsstadiet (Figur 7B) ). Observationen att eij1-1-växter ympade med Pst DC3000 uppvisade resistens som var jämförbar med den hos Col-0- och eij1-1-växter inokulerade med den avirulenta Pst DC3000 (AvrRps4) stöder denna hypotes. Detta kan förklara, åtminstone till viss del, varför den avirulenta stammen, men inte den virulenta stammen, kan öka det förstärkta motståndet för att utlösa ETI-svar. Därför antyder dessa observationer att EIJ1 är involverad i virulenseffektorutlöst svar i värdceller.

Figur 6 Omlokalisering av EIJ1 till cytoplasman är nödvändig för EDS1-beroende resistens. (A) Pst DC3000-infektion förändrar den subcellulära lokaliseringen av EIJ1. EIJ1-mCherry uttrycktes övergående i N. benthamiana-blad spayerade med Pst DC3000 (OD600=0.1) eller skeninokulerade i 24 timmar. Bar=10 lm. (B) Pst DC3000-infektion utlöser disassociationen av EIJ1 från kloroplasten. Totalt antal proteiner, cytoplasmatiska proteiner och kloroplastiska proteiner extraherades från 3-veckogamla EIJ1pro: EIJ1-6HA-växter dopp-inokulerade med Pst DC3000 (OD600=0.1) eller skeninokulerade vid 4 hpi och detekteras av anti-HA-antikroppen. PEPC, histon H3 och RbcL användes som cytoplasmatiska, nukleära respektive kloroplastiska markörer. Den relativa intensiteten av proteiner med skenbehandling är satt till 1. Resultaten som presenteras i (A) och (B) upprepades oberoende tre gånger (tilläggsfil 2). (C) Immobiliserad EIJ1 i kloroplaster kan inte återställa resistensen hos eij1-1. Tre veckor gamla plantor dopp-inokulerades med Pst DC3000 (OD600=0.05). Bakteriell titer av Pst DC3000 vid 0 och 5 dpi bestämdes. CTS, kloroplastlokaliseringssignaler. Uppgifterna är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat (Supplemental Data Set 1). (D) och (E) Övergående analys av PR-promotoraktivitet reglerad av EIJ1, CTS-EIJ1 och EDS1. Olika konstruktioner som används i transienta expressionsanalyser visas i (D). PR1pro: GUS samtransformerades med effektorer eller den tomma vektorn (Kontroll) till N. benthamiana-blad spayerade med Pst DC3000 (OD600=0.1) i 24 timmar. Relativ GUS-aktivitet (GUS/Luciferas) som indikerar uttrycksnivån av PR1 som regleras av olika effektorer visas i (E). Felstaplar representerar standardavvikelsen för tredubbla oberoende prover. Data är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat. Små bokstäver indikerar signifikanta skillnader (envägs ANOVA, P 5 0.01, tilläggsdatauppsättning 1).

Figur 7 EIJ1 och EDS1 modulerar växtbasal resistens. (A) Bakterietillväxt av Col och eij1-1 mutant. Tre veckor gamla plantor dopp-ympades med Pst DC3000 eller Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.05). Bakteriell titer av Pst DC3000 vid 0 och 5 dpi bestämdes. Data är medelvärdet ± SD för tre biologiska replikat. Små bokstäver indikerar signifikanta skillnader (envägs ANOVA, P 5 0.01, tilläggsdatauppsättning 1). (B) EIJ1 påverkar knappast Pst DC3000 (AvrRps4)-utlöst ackumulering av EDS1 i kärnor. Kärnutarmade fraktioner och kärnanrikade fraktioner extraherades från 3-veckogamla eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG och eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-transgena växter doppas inokulerade med Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1), eller skeninokulerade vid 4 hpi, och detekterade med hjälp av en anti-FLAG-antikropp. PEPC och histon H3 användes som cytoplasmatiska respektive nukleära markörer. Den relativa intensiteten av proteiner från växter med skenbehandling sattes till 1. M, mock; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Pst DC3000 (AvrRps4)-infektion främjar nedbrytningen av EIJ1-proteinet. Totalt antal proteiner extraherades från 3-veckogamla eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA-växter dopp-inokulerade med Pst DC3000 eller Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) och detekteras med användning av en anti-HA-antikropp. Den nedre panelen visar färgning med Coomassie Brilliant Blue (CBB) som laddningskontroll. De representativa resultaten som presenteras i (B) och (C) upprepades oberoende två gånger till och undersöktes med en anti-ACTIN-antikropp som laddningskontroll (tilläggsfil 2). (D) Hypotetisk modell av EIJ1 som reglerar EDS1-beroende växtbasal resistens. När växter invaderas av patogener frigörs EIJ1 snabbt från kloroplasten till cytoplasman där den interagerar med EDS1. Interaktionen EIJ1–EDS1 förhindrar överföring av EDS1 från cytoplasman in i kärnan och begränsar därmed kärnresistensen hos EDS1, vilket möjliggör modulering av EDS1-förmedlade immunsvar. Pilade och trubbiga linjer indikerar aktivering respektive förtryck.

Diskussion

För att maximera överlevnaden har växter utvecklat en exakt mekanism för att optimera tillväxt och för försvar mot invaderande patogener, även om många detaljer om dessa mekanismer fortfarande är oklara. EDS1 intar en nyckelposition i växtens medfödda immunitetssignaleringsnätverk, eftersom den reglerar resistens mot biotrofa och hemibiotrofa patogener (Wiermer et al., 2005). I denna studie identifierade vi en gen, EIJ1, som kodar för ett chaperone DnaJ-protein, och visade att EIJ1 är känsligt för tidig patogeninfektion och spelar en roll i växtens medfödda immunitet genom att interagera direkt med EDS1. Baserat på dessa fynd föreslår vi en regulatorisk modell för EIJ1 (Figur 7D). När växter invaderas av patogener frigörs EIJ1 snabbt från kloroplasten till cytoplasman, där den interagerar med EDS1. Denna EIJ1–EDS1-interaktion förhindrar överföring av EDS1 från cytoplasman in i kärnan, och detta begränsar kärnresistensen hos EDS1, vilket möjliggör modulering av EDS1-medierade immunsvar såsom induktion av SA-biosyntes och uttryck av resistens -relaterade gener. När växter utsätts för kontinuerliga stimuli från invaderande patogener, bryts EIJ1 gradvis ned, vilket leder till en ökad nukleär ackumulering av EDS1 för motståndsförstärkning. Dessa fynd illustrerar en väsentlig repressiv roll för EIJ1 under det tidiga värdsvaret på patogeninvasion, vilket fyller gapet i vår förståelse av hur den subcellulära lokaliseringen av EDS1 regleras för att ge resistens.

Sekvensanalys visade att EIJ1 är ett DnaJ-protein. Arabidopsis-genomet kodar för sju olika klassiska typer av DnaJ-proteiner (Pulido och Leister, 2018). Tidigare studier visar att DnaJ-proteiner spelar viktiga och distinkta roller i växtimmunitet. Till exempel reglerar sojabönor (Glycine max) GmHSP40 positivt celldöd och sjukdomsresistens (Liu och Whitham, 2013). Däremot reglerar Os-DjA6-proteinet av ris (Oryza sativa L.) negativt växtens medfödda immunitet genom den ubiquitination-medierade proteasomnedbrytningsvägen (Zhong et al., 2018). Den P. syringae-specifika Hopl1 virulenseffektorn, som innehåller en J-domän, är riktad mot kloroplasten, där den interagerar med växternas stress-responsmaskineri (Jelenska et al., 2007). Dessa studier visar att DnaJ-proteiner spelar olika roller i växtförsvarssvar. Tsip1, ett N. tabacum DnaJ-protein som är homologt med EIJ1, reglerar den Tsi1-förmedlade transkriptionsaktiveringen av gener som svar på stress (Ham et al., 2006). Tsi1 kodar för en APETALA2 (AP2)-typ transkriptionsfaktor som fungerar som en viktig regulator i både biotiska och abiotiska stressresponser i N. tabacum (Park et al., 2001). SA utlöser omlokaliseringen av Tsip1 från kloroplasten till cytoplasman, vilket underlättar interaktionen mellan Tsip1 och Tsi1 och det efterföljande inträdet av Tsip1–Tsi1-komplexet i kärnan för transkriptionell aktivering av stressrelaterade gener (Ham et al., 2006) . Till skillnad från Tsip1 var EIJ1 lokaliserad till kloroplasten och kärnan under normala förhållanden i denna studie. Vi visade att patogeninfektion utlöser omlokaliseringen av EIJ1 från kloroplasten till cytoplasman och att interaktionen mellan EIJ1 och EDS1 i cytoplasman hämmar EDS1-förmedlad nukleär resistens. I enlighet med detta fynd uppvisade eij1-mutanten med förlust av funktion starkare motståndskraft mot patogener än vildtypen (Col-0). Detta bekräftar att EIJ1 spelar en negativ roll i växtens medfödda immunitet. Enligt tidigare studier är koordinerade nukleära och cytoplasmatiska aktiviteter av EDS1 väsentliga för att växter ska fullborda det medfödda immunsvaret mot patogener (Garcı´a et al., 2010; Heidrich et al., 2011). Den nukleära lokaliseringen av EDS1 krävs för TNL-inducerad resistenstranskriptionell omprogrammering för att inducera SA-relaterade och andra växtförsvarssvar (Wirthmueller et al., 2007). Den cytoplasmatiska EDS1-poolen upprätthålls också under infektionsprocessen för fullständig resistens mot patogener (Garcı´a et al., 2010). Dessa observationer ger upphov till en betydande oro angående hur växter exakt reglerar allokeringen av EDS1 mellan cytoplasman och kärnan för korrekta försvarssvar när de utmanas av patogeninfektion. Här visar vi att den exakta tilldelningen av EDS1 till olika subcellulära fack regleras delvis av EIJ1 via protein-protein-interaktion. Förlusten av funktionsmutationen av EIJ1 främjade särskilt handeln med EDS1 till kärnan (figur 5, D och 7, B), vilket ledde till ökad sjukdomsresistens.

Eftersom EIJ1 snabbt inducerades i ett tidigt skede av patogeninfektion och därefter bröts ned under sjukdomsutveckling, spekulerar vi att EIJ1 är en viktig negativ regulator av immunitet som tillåter växter att förfina sitt optimala försvar. Den EIJ1-medierade repressionen av EDS1-aktivitet kan förhindra framkallandet av onödiga immunsvar på kortvarig stimulering, såsom en enstaka attack av patogena bakterier. Alternativt kan patogena bakterier manipulera värdimmunitet genom att utlösa disassociationen av EIJ1 från kloroplasten, förmodligen genom att utsöndra virulenta effektorer. Vi kunde inte utesluta möjligheten att EIJ1 utför en okänd funktion i kloroplasten. Som vi vet biosyntetiseras SA, ett växthormon och signalmolekyl som är inblandad i resistens mot biotrofa patogener, främst i kloroplasten och exporteras sedan ut i cytoplasman av EDS5, en multidrog- och toxintransportör (Serrano et al., 2013). EIJ1 är sannolikt en negativ regulator av SA-ackumulering, eftersom den nedreglerade uttrycket av den biosyntetiska SA-genen ICS1 vid patogeninokulering (Figur 4E). Förutom EIJ1-förmedlad transkriptionell repression via dess interaktion med EDS1, är det möjligt att EIJ1 också spelar en direkt roll i SA-biosyntes eller SA-transport från kloroplasten på ett oidentifierat sätt. Det skulle inte vara förvånande om EIJ1 och SA-biosyntesprocessen visade sig vara kopplade i en framtida studie. Intressant nog var EIJ1 också lokaliserad till kärnan. Även om EIJ1 inte interagerade med EDS1 i kärnan, förmodligen på grund av bristen på väsentliga kofaktorer eller modifieringar, är funktionen hos kärnlokaliserad EIJ1 värd att undersökas ytterligare.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Patogena bakterier producerar intracellulära effektorer för att undergräva värdens PTI genom att rikta in sig mot patogenresistensproteiner som PRR, medan växtcytoplasmatiska NOD-liknande receptorer känner av dessa effektorer för att initiera ETI (Dou och Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Tidigare studier och våra resultat visade att avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) främjar handeln med den cytoplasmatiska EDS1 in i kärnan (Garcı´a et al., 2010). Dessutom visade våra resultat ingen signifikant skillnad i Pst DC3000 (AvrRps4)-utlöst kärnackumulering av EDS1 och efterföljande patogenresistens mellan Col-0 och eij1-1 muterade växter (Figur 7, A och B) . Dessutom var resistensen som uppvisades av eij1-1-mutanten jämförbar med den som uppvisades av Col-0-växter inokulerade med den typ III-sekretionssystemdefekta Pst DC3000 hrcC-stammen (tilläggsfigur 12). Dessutom var ackumuleringen av EIJ1 markant lägre i växter inokulerade med avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) än i växter inokulerade med virulent Pst DC3000 (Figur 7C), vilket indikerar att EIJ1 är en väsentlig regulator av virulenseffektorutlöst cellimmunsvar. Eftersom Pst DC3000-ympade eij1-1-växter härmade resistensfenotypen hos Pst DC3000 (AvrRps4)-ympade Col-0-växter (figur 3, F, G, 4, C, D och 7, A), kan EIJ1 fungera som en barriär för att förhindra induktion av ETI av virulenta stammar. Sammanfattningsvis har vi identifierat EIJ1, ett chaperone DnaJ-protein, och visat att det är involverat i ett tidigt immunsvar mot växtpatogener. Interaktionen mellan EIJ1 och EDS1 undertrycker den nukleära handeln med EDS1, förmodligen antingen för att förhindra kortvarig stimulering av onödiga växtimmunsvar, för att underlätta den patogena invasionen med en manipulerande mekanism, eller båda. Oavsett den underliggande mekanismen kan EIJ1-allelen användas som ett effektivt potentiellt mål för modifiering av växtens medfödda immunitet i sjukdomsresistensuppfödning. Eftersom EIJ1 inte påverkar den normala tillväxten av växter, kan dämpning av EIJ1-funktionen via genomredigering framträdande höja nivån av sjukdomsresistens hos grödor med liten effekt på tillväxten.

Referenser

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Reaktiva syreintermediärer förmedlar ett systemiskt signalnätverk i etableringen av växtimmunitet. Cell 92: 773–784

An, C, Mou, Z (2011) Salicylsyra och dess funktion i växtimmunitet. J Integr Plant Biol 53: 412-428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) Jonantiport accelererar fotosyntetisk acklimatisering i fluktuerande ljus miljöer. Nat Commun 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE. och Nudix hydrolas NUDT7. Plant Cell 18: 1038-1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure´, A (2015) Väteperoxid producerad av NADPH-oxidaser ökar prolinackumuleringen under salt- eller mannitolstress i Arabidopsis thaliana. New Phytol 208: 1138–1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Molecular chaperones and protein quality control. Cell 125: 443–451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Plant NB-LRR immunreceptorer: från igenkänning till transkriptionell omprogrammering. Cell Host Microbe 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Plant immunitet: mot en integrerad syn på växt-patogen interaktioner. Nat Rev Genet 11: 539–548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Fytopatogeneffektorer som undergräver värdimmunitet: olika fiender, liknande slagfält. Cell Host Microbe 12: 484–495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) Typ I J-domän NbMIP1-proteiner är krävs för både tobaksmosaikvirusinfektion och växtens medfödda immunitet. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) Specifika interaktioner mellan K-domänerna av AG och AGL, medlemmar av MADS-domänfamiljen av DNA-bindande proteiner. Anläggning J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Direkt interaktion mellan signalproteinerna för motstånd mot Arabidopsis sjukdom, EDS1 och PAD4. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı´a, AV, Blanvillain-Baufume´, S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) Balanserade nukleära och cytoplasmatiska aktiviteter av EDS1 krävs för en komplett växtens medfödda immunsvar. PLoS Pathog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Arabidopsis RPS4-bakterieresistensgenen är en medlem av TIR-NBS-LRR-familjen av sjukdomsresistensgener. Plant J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime´nez-Go´mez, JM (2014) Nonsens- medierat mRNA-sönderfall modulerar immunreceptornivåer för att reglera växternas antibakteriella försvar. Cell Host Microbe 16: 376–390

Ham, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) Tobacco Tsip1, ett Zn-fingerprotein av DnaJ-typ, rekryteras till och förstärker Tsi1-förmedlad transkriptionsaktivering. Plant Cell 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume', S, Parker, JE (2012) Molekylära och rumsliga begränsningar på NB-LRR-receptorsignalering. Curr Opin Plant Biol 15: 385–391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1 kopplar patogeneffektorigenkänning till cellkompartmentspecifika immunsvar. Science 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Gibberelliner spelar en viktig roll i den sena embryogenesen av Arabidopsis. Nat Plants 4: 289–298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 förmedlar postembryonal utveckling genom att interagera med FYTOKROM-INTERAKTANDE FAKTOR4. Plant Cell 27: 3099-3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) AJ-domänvirulenseffektor av Pseudomonas syringae remodellerar värdkloroplaster och undertrycker försvar. Curr Biol 17: 499-508

Jones, J, Dangl, J (2006) Växtens immunförsvar. Nature 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) Av vakter, lockbeten, beten och fällor: patogenuppfattning i växter med effektorsensorer av typ III. Curr Opin Microbiol 29: 49–55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) Nukleär lokalisering av NPR1 krävs för aktivering av PR-genuttryck. Plant Cell 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis är mottaglig för infektion av en dunmögelsvamp. Plant Cell 2: 437–445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Programmerad celldöd, mitokondrier och växtens överkänsliga respons. Nature 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Arabidopsis nukleärt kodade plastidtransitpeptider innehåller flera sekvensundergrupper med distinkta kloroplastinriktade sekvensmotiv. Plant Cell 20: 1603–1622