Effekt av Cistanche Tubulosa-extrakt på manlig reproduktionsfunktion hos streptozotocin-nikotinamid-inducerade diabetesråttor

Nyckelord:diabetes; infertilitet;Cistanche tubulosaextrahera(CTE);echinakosid(ECH);antiinflammatoriskaktivitet;antioxidantaktivitet;steroidogeneseffekter

För mer information om fördelarna med cistancheextraktpulver

1. Introduktion

Diabetes mellitus (DM) är ett tillstånd där det finns förhöjda glukosnivåer i blodet pgatill bukspottkörtelns ineffektivitet när det gäller att producera tillräckligt med insulin, eller kroppens oförmåga att använda deteffektivt. Enligt WHO ökade antalet personer med diabetes från 108 miljoner 1980till 422 miljoner 2014 [1]. Det finns fyra huvudkategorier: pre-diabetes (ett stadium före diabetes), typ 1(där bukspottkörteln inte producerar insulin), typ 2 (kroppen misslyckas med att använda insulin) och graviditetdiabetes (som uppstår under graviditeten). Oxidativ stress uppstår på grund av obalansen mellanproduktion av reaktiva syrearter (ROS) och antioxidanter [2] slutligen leder till det diabetiska tillståndet.Komplikationerna av diabetes inkluderar njursvikt, nervskador, blindhet, stroke, hjärtaattack, fosterdöd och infertilitet. [1]. Studier visar att spermiekärnor, deoxiribonukleinsyra (DNA),och mitokondrier var signifikant skadade hos manliga diabetespatienter [3]. Oxidativ stress undertransporten av spermier kommer att förändra processen i det manliga reproduktionssystemet [4,5]. 

Spermatogenesen styrs av hypotalamus-hypofysen-gonadal (HPG)axel. Det gonadotropinfrisättande hormonet (GnRH) som produceras av hypotalamus stimulerarproduktion av luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). Leydig-celler hittasangränsande till seminiferous tubuli och producerar testosteron under kontroll av LH. FSH triggersproduktionen av antigenbindande protein (ABP) som hjälper till att passera det manliga hormonet. Alltså infertilitetoch andra problem uppstår främst på grund av de störningar som uppstår i HPG-axeln. Administration avkombinationen av streptozotocin-nikotinamid inducerar diabetes hos försöksråttor. Streptozotocinär en kemisk förening som är giftig för insulinproducerande celler i bukspottkörteln och nikotinamid är envattenlösligt vitamin som skyddar celler från fullständig skada [6]. Cistanche tubulosaär en ökenväxtart även känd som "Rou Cong-Rong" [7]. Det är enicke-klorofyll parasitisk växt som växer huvudsakligen på roten avCalotropis proceraträd och ärspridda i det torra landet Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongoliet, Iran och Indien. Den gemensammanamnCistanche tubulosaär "Desert Hyacinth". Det är allmänt accepterat inom traditionell kinesisk medicinoch har fått namnet "Ginseng of the Desert". Det används ofta inom det medicinska området för attbehandla sjuklig leukorré, riklig metrorragi, kroniska njursjukdomar, förstoppning, impotens ochinfertilitet. Kemiska beståndsdelar avCistanche tubulosabestår av icke-flyktiga fenyletanoidglykosider(PHG), iridoider, lignaner, flyktiga oljor, alditoler, oligosackarider och polysackarider [8]. Studiervisa att echinakosid från denna ört skyddar de skadade fibroblasterna genom att reglera ROS-nivåer [9]. Denna förening producerar antioxidanter, vasorelaxation och antiinflammatoriska aktiviteter tillsammans medneuroprotection och osteoporosprevention [10,11]. Denna studie syftade till att undersöka effekten avCistanche tubulosaextraherasom innehåller ECH påreproduktiv dysfunktion hos streptozotocin-nikotinamid-inducerad diabetisk råtta.

2. Material och metoder

2.1. Material

ECH och CTE köptes från Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Avanceradglycation slutprodukter (AGEs) köptes från Biovision (San Francisco, CA, USA). LC-540och TM3-cellinjer köptes från Food Industry Research and Development Institute(Hsinchu, Taiwan). Fem veckor gamla Sprague-Dawley (SD) hanråttor köptes frånNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® köptes från PMINutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) erhöllsfrån Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol och 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyrasyra (HEPES) köptes också från Sigma. Dulbeccos modifierade Eagle medium/F12 ochtrypsin-EDTA erhölls från GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), diklor-dihydro-flfluoresceindiacetat (DCFH-DA), dimetylsulfoxid (DMSO) och nitroblått tetrazolium (NBT) köptes från Sigma. Enzymatisk glukoskit erhölls från Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan. Insulin ELISA-kit köptesfrån Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Sverige). T-PER vävnadsproteinextraktionReagens förvärvades från Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Kärnvapen mot människa/mus/råttafaktor-kappa B NF-κB polyklonala antikroppar köptes från Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA. Anti-mus/råtta-receptor för avancerade glykeringsslutprodukter (RAGE) polyklonalantikroppar, anti-human/mus/råtta StAR polyklonala antikroppar och anti-human/mus/råttaCytokrom P450 17A1 monoklonala antikroppar köptes från Gene Tex (Irvine, CA, USA).Anti-humana/mus/råtta CYP11A1 polyklonala antikroppar erhölls från Cell SignalingTeknik (Beverly, PA, USA). Easy-Blue-reagenset köptes från Invitrogen, Thermo FisherScientific (Carlsbad, CA, USA). Agaros och DNA-markör 100 bp erhölls från Promega,Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit köptes från QIAGEN,Hilden, Tyskland.

en 5 procent CO2 inkubator (CO2 inkubator, Napco 5410, Taiwan). TM3-cellinjen odlades i Dulbecco'smodifierat Eagle-medium (DMEM) kompletterat med glukos (4,5 g/L), natriumpyruvat (0,5 mM),L-glutamin (2,5 mM), natriumbikarbonat (1,2 g/L), 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyrasyra (HEPES, 15 mM), och fetalt kalvserum (FCS, 10 procent) eller hästserum (5 procent) vid 37◦C i en 5 procentCO2 inkubator.

Bestämning av cellviabiliteten för Echinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) reagens användes för cellviabilitetsanalys. Cellkoncentrationenjusterades till 2× 105celler/ml i en 96-brunnsplatta. Sedan, 20µL av ECH (utspädd i 2 procent av medium)tillsattes och inkuberades i 24 timmar vid 37◦C i en 5 procent CO2 inkubator. Senare 100µL av MTT-reagens vartillsattes och inkuberades i 4 timmar vid 37◦C under mörka förhållanden. Absorbansen mättes vid 570 nm(ELISA-läsare, Dynatech MR5000, Kloten, Schweiz).Relativ cellviabilitet ( procent )=[(Aprov vid 570 nm− Ablank vid 570 nm)]/[(Akontroll på 570− Ablank vid 570)] × 100.

Innehållsanalys av reaktiva syrearter (ROS):

Cellnumret justerades till2 × 105celler/mli en 12-brunnsplatta innehållande 2 procent FBS. Sedan 50µL/mL ECH, RES och AGEsattes till plattan och inkuberades vid 37°C◦C i 24 timmar. Efter 24 timmar, 20 ,70 -diklorfluoresceindiacetat(DCFH-DA) tillsattes och inkuberades vid 37°C◦C i 30 min. Efter centrifugering (400× g, 5 min),

och AGEs tillsattes och inkuberades vid 37◦C i en 5 procent CO2 inkubator i 24 timmar. Efter, 400µL av T-PERtillsattes, skrapades bort cellerna och centrifugerades vid 125,000× g i 20 min (4◦C). Supernatantenhämtades och förvarades kl−80 ◦C (−80 ◦C-frys, Nuaire, Plymouth, MN, USA) för vidare analys.

Bicinchoninsyra (BCA) kit användes för proteinkvantifiering. Sedan, 10µL av standardcelllösningoch 200µL BCA-reagens sattes till 8-brunnsplattor och inkuberades vid 37◦C i en 5 procent CO2 inkubatori 30 min. Absorbansen mättes vid 562 nm. Proteinidentifieringsanalys utfördesgenom natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) elektrofores. Prover varframställd genom att tillsätta proteinlysat till proteinladdningsbuffert och western blot-analys utfördesför att detektera de specifika proteinerna.

2.2.2. In vivo analys

Djurmodelldesign: Sextio 4-veckogamla Sprague–Dawley (SD) hanråttor köptes frånNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Varje råtta hölls individuellt i desinfektionsmedelburar i rostfritt stål under kontrollerad temperatur (23± 1 ◦C) och luftfuktighet (40–60 procent) med 12 timmarljus/12 timmar mörk cykel. Mat och vatten tillhandahölls ad libitum. Varje råtta domesticerades i den förstavecka och fick laboratoriegnagardiet 5001 som huvuddiet. Alla procedurer följde standardenav Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Approval No. 101026) av NationalTaiwan Ocean University, Taiwan. Efter domesticering delades råttor in i två grupper: kontrollengrupp (Con) som matades med labbdiet 5001, och diabetikergruppen som matades med en fettrik kost(HFD, 40 procent) för hela experimentet. Efter att ha matats med HFD i 4 veckor, diabetikergruppenråttor injicerades med streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) för att inducera diabetes mellitus (DM). Inom15 min efter injicering av STZ injicerades nikotinamid (230 mg/kg kroppsvikt). En vecka efter injektionen,ett oralt glukostoleranstest (OGTT) utfördes för att fastställa den framgångsrika induktionen av diabetikerMellitus (DM). Därefter delades djuren in i sex grupper: kontrollen (matad med labbdiet5001); DM-grupp (DM plus 45 procent HFD); DMR-grupp (DM plus rosiglitazon: 0,571 mg/kg kroppsvikt) plus 45 procent HFD;DME1-grupp (DM plus CTE: 80 mg/kg kroppsvikt) plus 45 procent HFD; DME2-grupp (DM plus CTE: 160 mg/kg kroppsvikt)plus 45 procent HFD; och DME4-gruppen (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) plus 45 procent HFD. Rosiglitazon (RSG) vartas som positiv kontroll. Tre doser CTE (80, 160 och 320 mg/kg) användes enl.rekommendationen från Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) hälsokost funktionellriktlinjer för utvärdering. Behandlingar gavs till slutet av experimentet. Alla experimentråttoroffrades efter 6 veckor. Blodet uppsamlades från råttorna centrifugerades vid 3000 rpm för15 min vid 4◦C. Supernatanten undersöktes för följande analys:Totalt glukos, triglycerider och kolesterol

Bestämning:

Glukosbestämningen varutförs av glukosenzymatiska kit. Sedan, 20µL blodplasmaprover sattes tillreagenser och hölls vid 37◦C i 5 min. De totala triglyceriderna och den totala kolesterolkoncentrationen varbestäms genom att använda triglycerid- och kolesterolenzymatiska kit. Sedan, 10µL blodplasma varsattes till reagensen och experimentet utfördes enligt tillverkarens instruktioner.Absorbansen mättes vid 510 nm.Totalt plasmaglukos/triglycerid/kolesterol (mg/dL)=(Aprov− ATom)/(Astandard-− ATom) × 200. Ett prov: Absorbans av blodprover, ATom: Absorbansvärde för kit utan prov, standard: Absorbansvärde för standardreagenset, 200: standardreagenser vid en koncentration av200 mg/dL.Bestämning av insulin, leptin och homeostatisk modell – insulinresistens (HOMA-IR):Insulinnivån bestämdes med insulin ELISA-kit. Här, 25µL blodplasma tillsattesreagens och absorbansen mättes vid 450 nm. Totalt leptininnehåll bestämdes med användning avleptinenzym immunometrisk analyssats. Sedan 100µL plasma analyserades och absorbansenmättes vid 450 nm med användning av en ELISA-läsare. Hela experimentet genomfördes enligttillverkarens instruktioner. HOMA-IR-värdet bestämdes från homeostasmodellenbedömningsekvation=Fastande plasmainsulinkoncentration (mU/mL)× fastande plasmaglukoskoncentrationer (mmol/L)/22,5.Plasmalipidperoxidation: Här blandades 0,5 mL blodplasma med 1 mL reagens (15 procent ,vikt/volym triklorättiksyra i {{0}},25 N saltsyra (HCl) och 0,375 procent ,w/v tiobarbitursyra i0.25 N HCl) och placeras i ett vattenbad (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Schweiz) vid 100◦C för15 min. Efter kylning tillsattes 1 ml n-butanol, skakades kraftigt och centrifugerades vid 1500× g i 10 min. Supernatanten uppsamlades och absorbansen mättes vid 532 nm [12]. Malondialdehyd (MDA) koncentration (nM/mL)=[(Ett provvid 532 nm− Ablank vid 532 nm)/ (Standardvid 532 nm− Ablank vid 532 nm)] × 5. Bestämning av plasmanivåer av testosteron och luteiniserande hormon (LH): TestosteronetELISA-kit användes för att mäta nivån av testosteron i blodplasman. RIA kit var van vidbestämma LH-koncentrationen. Sedan 50µL plasma tillsattes och beräkningarna baseradespå koncentrationen av hormonet LH-RP-3 (standard). De ytterligare stegen genomfördes enligttill tillverkarens instruktioner.Bestämning av tumörnekrosfaktor (TNF)- och Interleukin-6 (IL-6) Koncentration:Den infångade antikroppen späddes 250 gånger i beläggningsbuffert, tillsattes till en 96-brunnsplatta (100µL/brunn),och höll på 4◦C över natten. Supernatanten aspirerades och tvättades femton gånger med tvättbuffert (1 gång PBS, 0,05 procent Tween 20). Efter inkubation (1 h) med 200µg analysspädningsmedel, var cellernatvättas 5 gånger med tvättbuffert och 100µL av TNF- standardlösning eller testproversattes till varje brunn och inkuberades i 2 timmar. Efter tvätt, 100µL av IL-6 detekterade antikroppar tillsattesoch inkuberades i 1 timme vid rumstemperatur. Supernatanten aspirerades och tvättades 5 gånger. Sedan,480 µL enzym avidin-pepparrotsperoxidas (HRP) tillsattes och inkuberades i 30 minuter i rummettemperatur. Supernatanten aspirerades och tvättades fem gånger med tvättbuffert. Sedan 100µL av substratlösning tillsattes och inkuberades i 15 minuter vid rumstemperatur. Senare, 50µL av stopplösning (1 M fosforsyra) sattes till varje brunn och absorbansen mättes vid 450 nm.Analys av sperma- och testikelparametrarSpermieprovtagning: Spermieprovtagningen utfördes enligtmetod som tidigare rapporterats i [13]. Spermierna uppsamlades från supernatanten och användes förvidare analys.Antalet spermier, spermier rörlighet och onormala spermier: Antalet spermier varberäknas med hjälp av hemocytometern och trypanblåttlösningen. Sedan 100µL spermievätska varblandat med trypanblått lösning och antalet spermier, rörlighet och onormala spermier varberäknas med hjälp av en hemocytometer och mikroskop [14]. Nitroblått Tetrazolium NBT-reduktion och lipidperoxidation av spermier och testiklar: lipidenperoxidation och NBT-reduktion analyserades enligt samma procedur för plasmaanalys.

Bestämning av superoxiddismutas (SOD) och katalasaktivitet: Superoxiddismutas(SOD)-aktivitet analyserades med användning av RANSEL-kitet. Här, 0,05 mL testikelhomogenattillsattes till 1,7 mL reaktionslösning (0.05 mM xantin, 0,025 mM 2-(4-jodfenyl)-{{0}}(4-nitrofenol)-5-fenyltetrazoliumklorid (INT)). Efter blandning, 0,25 ml xantinoxidas (80 U/L)tillsattes och fick reagera vid rumstemperatur under 30 s vid rumstemperatur. Absorbansen varuppmätt vid 505 nm. Proteinkoncentrationen av testikelhomogenatet bestämdes avBio-Rad DC proteinanalyskit och dess specifika aktivitet (U/mg protein) beräknades. Katalasen(CAT) aktivitet bestämdes enligt en tidigare rapporterad metod [15]. H&E (Hematoxylin och Eosin) färgningTestisen blötlades i 10 procent formalin i 24 timmar och lagrades vid 4◦C. Skivade vävnaderna imikrostorlek och fäst på rutschkanan. Efter fixering (95 procent metanol plus 5 procent ättiksyra) var objektglasennedsänkt i hematoxylin i 3 minuter, tvättat med rinnande vatten i 5 minuter och sedan blötlagt dem med50 procent, 70 procent och 90 procent alkohol i en minut. Därefter färgades objektglasen med eosin i 10 s ochblötläggs i 100 procent alkohol i en minut tills det bleknat. Slutligen blötlades objektglaset i xylen för enminut. Senare lufttorkades objektglaset och förseglades. Det färgade röret placerades i en inverterad faskontrastmikroskop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japan) för att observeramorfologin.Analys av hypotalamusMusen KISS1, G-proteinkopplad receptor (GPR) 54, suppressor av cytokinsignalering 3 (SOCS-3)och sirtuin 1(SIRT1)gensekvenser identifierades från NCBI (National Center for BiotechnologyInformation) gendatabas och en specifik primer designades med Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, USA). De primrar som användes i experimentet är listade i tabellen1.

Extraktion av ribonukleinsyra (RNA) från hypotalamus. Extraktion av RNA frånhypotalamus i hjärnan utfördes med hjälp av RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Den erhållnamRNA mättes kvantitativt genom omvänd transkription (RT) och polymeraskedjereaktion(PCR). Komplement-DNA erhållet från RT-analys lagrades vid−20 ◦C för senare användning.Det extraherade DNA:t utsattes för polymeraskedjereaktionsanalys (PCR) med användning av Taq-polymeras.Sedan 5-10µL av PCR-produkten togs och analyserades genom elektrofores på en 1,5 % agarkolloid. Bilden togs i ett UVP BioDoc-It bildsystem. Omvänt transkriberad komplementärdeoxiribonukleinsyra (cDNA) togs och PCR utfördes med IQ SYBR Green SupermixUtrustning. Senare analyserades den med iQTM 5 Optical System Software. Proteiner extraherades med användning av enproteinextraktionsreagens (T-PER). Sedan tillsattes 20 mg testikelhomogenat till 400µL av T-PER och centrifugerad (Höghastighetscentrifug, Hettich CR-12, Tuttlingen, Tyskland) vid 4◦C (125,000× g) i 20 min. Följande metod liknade "identifiering och kvantifieringanalys av protein" in vitro-analys.2.3. Statistisk analysDe experimentella resultaten uttrycktes som medelvärde± standardavvikelse (medelvärde± SD) ochdata analyserades med hjälp av Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 programvara, IBM, Armonk,New York, NY, USA. Skillnaderna mellan grupperna analyserades genom envägsanalys avvarians (ANOVA). Flera jämförelser av olika grupper analyserades med Duncans test vidvärdet avp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Resultat

3.1. In vitro analys

3.1.1. Jämförelse av antioxidantaktiviteter av ECH, CTE och RES

Långvarig hög oxidativ stress och kronisk inflammation är de främsta orsakerna till diabetikerkomplikationer [16]. CTE innehåller olika fenyletanoidglykosider såsom echinakosid(ECH) och akteosid, med potential för antioxidantaktivitet [17]. DPPH radikal rensninganalys utfördes för att utvärdera antioxidantaktiviteten hos ECH. Trolox och resveratrol(3,5,4'-trihydroxistilben, RES) togs som standard respektive positiv kontroll. Som visati figur1, visade ECH bättre radikalfångande aktivitet och aktiviteten var signifikant högreän den för den positiva kontrollen (RES).

3.1.2. Cellviabilitet för ECH på LC-540 och TM3 Leydig-cellerMTT-analys utfördes för att utvärdera cellviabiliteten för olika koncentrationer av ECH.LC-540 Leydig-celler och TM3 Leydig-celler visade mer än 80 procent av livskraften efter att ha behandlats medECH (Figur2). Jämfört med de andra koncentrationerna, en 100-µM-koncentration (spädningar på 100µM i 2 procent FBS) av ECH visade bättre cellviabilitet i TM3 Leydig-celler. Resultatet visade attökad koncentration av ECH bidrar inte till någon signifikant toxicitet för cellerna.

3.1.3. Effekt av ECH på AGE-inducerad superoxidproduktion med NBT-analys i LC-540 och TM3Leydig Cell

AGE orsakar oxidativ skada i kroppen på grund av oxidation av glukos och bildandet avfria radikaler som O2-, hydroxylradikaler och karbonylgrupper [18]. Efter att ha blivit stimulerad med50 µg/mL AGE, LC-540 (Figur3a) och TM3 (Figur3b) celler behandlades med ECH och RES(5 µM och 10µM vardera). Resultaten visade att produktionen av superoxidanjon ökadei kontrollgruppen (stimulerade AGEs), men produktionen av superoxidanjon minskade efterbehandling med ECH och RES. Från figur3, det var underförstått att ECH och RES minskar nivånsuperoxidproduktion och skydda cellerna från oxidativ skada. När det gäller LC-540-celler,10 µM ECH visade nästan liknande aktivitet med den normala gruppen. Superoxidproduktionen i bådaceller minskade med en ökning av koncentrationen av både ECH och RES.3.1.4. Effekt av ECH på H2O2 Produktion i AGE-stimulerade LC-540 Leydig-cellerDCFH-DA-analys utfördes för att detektera närvaron av oxidativa ämnen. Efter att ha ingåttcellerna, FL fluorescerande färgämnet DCFH-DA oxideras av intracellulär H2O2 och bildar diklorfluorescein(DCF). Som visas i figuren4, det fanns en signifikant ökning av intracellulärt H2O2 produktion iAGE-stimulerad grupp (kontroll) medan tillägget av 10µM ECH och RES reducerades signifikantden H2O2 produktion i celler. Administration av 10µM ECH resulterade i endast cirka 47,1 procent av H2O2 produktion, betydligt lägre än i kontrollgruppen.

3.1.5. Effekt av ECH på RAGE och NF-κB-proteinuttrycksnivåer i AGE-stimulerad LC-540Leydig celler

Western blot-analys utfördes för att bekräfta närvaron av RAGE i LC-540 Leydigceller. Effekten av ECH på RAGE (Figur5a) och NF-κB (Figur5b) proteinuttrycksnivåeri AGEs-stimulerade Leydig-celler visades i figur5. Resultaten visade att, 50µg/mlkoncentration av AGE inducerade högre RAGE och NF-κB-uttryck i LC-540 Leydig-celler och10 µM-koncentrationen av ECH och RES har signifikant minskat uttrycket av RAGE och NF-κB. Uttrycket av NF-κB var signifikant lägre i RES och ECH än RAGE-antagonister. Alltså resultatenbekräftade att ECH minskade nivån av inflammation genom att minska nivån av RAGE och NF-κB.

.1.6. Effekt av ECH på testosteronsyntesvägen i AGE-stimulerade LC-540 Leydig-celler.

Processen för spermatogenes och manlig infertilitet beror på närvaron av testosteron.Som visas i figuren6, uttrycken för StAR (Figur6a), CYP11A1 (Figur6b), CYP17A1 (Figur6c), och HSD17 3 (Figur6d) proteiner minskade signifikant i AGE-stimulerad LC-540 Leydigceller (kontrollgrupp). Uttrycken av StAR, CYP11A1, CYP17A1 och HSD17 3 proteiner varökade signifikant när RAGE-antagonisten, RES och ECH tillsattes. Den ökadeuttryck av StAR- och CYP11A1-proteiner sågs i både de ECH- och RES-behandlade grupperna.Expressionsnivån för CYP17A1 var nästan lika i RES- och ECH-grupper. Uttrycken förHSD17 3-proteinet i ECH-behandlade Leydig-celler var mycket högre än de hos RES och RAGEantagonistbehandlade celler. Ökat uttryck av StAR, CYP11A1, CYP17A1 och HSD17 3 proteinerindikerade normal produktion av testosteron.

5celler/mL och behandling med RES och ECH(10µM) administrerades under 24 timmar. -aktin togs som intern kontroll. Den normala gruppen (Nor)behandlades med medium och kontrollgruppen (Con) behandlades med AGEs (50µg/ml).

Resultatvisades som medelvärde±SD (n = 3). Betydande skillnader (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analyseras av Duncans test med flera avstånd.