Effekter av olika extraherade delar av Cistanche Deserticola på hypoglykemiska effekter av Db/Db svarta möss Ⅱ

2 Experimentella metoder

2.1 Beredning av Cistanche deserticola bearbetade produkter Cistanche deserticola:

Ta Cistanche deserticola medicinska material, tvätta bort orenheter, ånga i en kastrull vid normalt tryck i 2 timmar, skär i 6 mm och torka i 70 grader. Cistanche deserticola: Ta Cistanche deserticola avkoksbitar, tillsätt lämplig mängd risvin, blanda väl, fukta i 8 timmar (gult risvin: vatten=1:1), ånga under högt tryck i 4 timmar och torka kl. 70 grader. (Använd 30 ml risvin för varje 100 g Cistanche deserticola).

NATURLIGT ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-butik

2.2 Anrikning av olika extraherade delar av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Ta 30 g Cistanche deserticola/Tamarococus deserticola-pulver, tillsätt 10 gånger mängden vatten, värm och återlopp för extraktion två gånger, 2 timmar varje gång, kombinera extrakten, koncentrera, tillsätt etanol tills alkoholhalten når 60 %, fäll ut kl. låg temperatur i 12 timmar och filtrera med sug. fällningen är den råa polysackariddelen. Koncentrera supernatanten till en lämplig koncentration, applicera den på D101 makroporös adsorptionsharts och eluerade den med vatten och etanol av olika koncentrationer i sekvens. Samla upp vatteneluatet och koncentrera under reducerat tryck till en tjock pasta, som är den totala oligosackaridfraktionen; tvätta med 40% etanol. Delikvidera, koncentrera och torka under reducerat tryck, vilket är den totala glykosidfraktionen av Cistanche deserticola.

2.3 Innehållsbestämning av olika extraherade delar av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Bestämning av den totala polysackaridhalten i Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Väg glukosprovet 20. 00 mg i en 50 mL mätkolv för att göra 0. För en 4 mg·mL -1 glukosstandardlösning, pipettera 3, 4, 5, 6 respektive 7 ml i en 50 ml mätkolv, späd till volym med vatten och pipettera 2,0 ml av varje koncentrationsgradient glukoslösning i ett provrör. Ta ytterligare en lika stor mängd destillerat vatten som en blank kontroll, tillsätt 1 mL 5 % fenol till varje rör, skaka väl, tillsätt snabbt 5 mL koncentrerad svavelsyra, låt stå i 10 minuter, lägg den i ett 40 graders vattenbad i 15 minuter, ta ut den, kyl snabbt till rumstemperatur och mät absorbansvärdet vid 490 nm, ta absorbansen (A) som ordinatan och glukoskoncentrationen (C) som abskissan, rita en standardkurva och få regressionsekvation Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Väg noggrant 1,0 g av det totala polysackaridpulvret av råvaror och produkter, placera dem i respektive 50 ml mätkolvar, tillsätt vatten för att lösa upp och justera volymen till märket, dra noggrant 2,0 ml i ett provrör och mät i samma sätt som standardkurvans framställningsmetod. , det är allt.

2.3.2 Bestämning av betaininnehåll i Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Beredning av referenslösning:

Väg noggrant 1,17 mg av referenslösningen för betain, lägg den i en 5 ml mätkolv, tillsätt 50 % metanol för att lösas upp och späd till volymen, och den är klar.

2.3. 2． 2 Kromatografiska förhållanden

Den kromatografiska kolumnen är Ecosil {{0}}AMINO kromatografikolonn (4,6 mm×250 mm, 5 μm), mobil fas: acetonitril-vatten (99,5 ∶ 0,5) , kolonntemperatur: 30 grader, detektionsvåglängd: 194 nm, flödeshastighet: 0,6 mL·min-1, injektionsvolym 10 μL, kromatogram visas i figur 1. 2.3.2.3 Preparering av testlösning Exakt väg upp pulvret av den totala oligosackaridfraktionen av råa respektive färdiga produkter 1,0 g, placerad i 5 ml mätkolv, tillsätt destillerat vatten för att lösas upp och späd till volym, skaka väl, passera genom 0,45 μL mikroporöst filtermembran, och det är klart.

2.3.2.4 Provinnehållsbestämning

Absorbera den totala oligosackaridtestlösningen exakt i rå och beredd Cistanche deserticola, mät den enligt villkoren under "2.3.2.2" och beräkna betainhalten i provet.

2.3.3 Bestämning av innehållet av echinacosid, verbascoside och heterocymicifugarin i Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Beredning av referenslösning

Väg upp 4,50 mg echinacosid, 4,80 mg verbascoside och 5,05 mg heterologt comimicin exakt i 5 ml mätkolvar, tillsätt 50 % metanol för att lösa upp och späda till märket och ta varje kontroll. Lägg 200 μL av injektionsprovlösningen i injektionsprovlösningen flaskan, tillsätt 400 μL 50 % metanol och blanda väl för att göra en blandad referenslösning, skaka väl och den är klar.

2.3.3.2 Kromatografiska förhållanden

Den kromatografiska kolonnen är Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), metanol är den mobila fasen A, 0,1 % myrsyra är den mobila fasen B, gradienteluering, {{ 12}}~45 min, 30% A→ 70% A, flödeshastigheten är 1,0mL·min-1, kolonntemperaturen är 30 grader, detektionsvåglängden är 330 nm, injektionsvolymen är 10μL, och kromatogrammet visas i figur 2.

2.3.3.3 Beredning av testlösning

Väg exakt 1,0 g av det totala glykosidpulvret av råvaror och produkter, placera dem i 100 ml mätkolvar, tillsätt 50 % metanol för att lösa upp, justera volymen till märket och skaka väl. Dra noggrant upp 5 mL av varje prov i en 10 mL mätkolv, tillsätt 50 % metanol för att fylla upp volymen, skaka väl och passera genom ett 0,45 μm mikroporöst filtermembran för att erhålla.

2.3.3.4 Provinnehållsbestämning

Dra exakt Cistanche deserticola totalglykosiderprovet och mät det enligt villkoren under "2.3.3.2". Beräkna innehållet av echinakosid, verbaskosid och heterolog medskyldig i provet.

2.4 Djurgruppering, modellering och läkemedelsadministration

Djurrummet har 12 timmars ljus och 12 timmars mörker, en relativ luftfuktighet på 50 % till 70 % och en rumstemperatur på 18 till 22 grader. db/db svarta möss och db/m svarta möss (normal kontrollgrupp) matades normalt med vanligt foder, och experimentet startade vid 9 veckors ålder. Förutom den normala kontrollgruppen valdes de återstående db/db svarta mössen slumpmässigt ut efter blodsockernivåer och kroppsvikt. Indelad i 8 grupper, nämligen modellgrupp, positiv kontrollgrupp, Cistanche deserticola total polysackaridgrupp, Cistanche deserticola total oligosackaridgrupp, Cistanche deserticola totala glukosidgrupp, Tartschistanche deserticola total polysackaridgrupp, Tarthouse deserticola deserticola de oligosaccharidgrupp total, Tarthouse deserticola de oligosaccharidgrupp total glucosides. Förutom normal kontroll

Förutom modellgruppen och modellgruppen administrerades råttorna i de andra grupperna intragastrisk administrering i en dos av 2 ml/100 g under 4 på varandra följande veckor. Koncentrationen av vätskan var 4,1 g·kg-1. Den normala kontrollgruppen och modellgruppen behandlades på samma sätt. Ge en viss mängd normal saltlösning till magen.

2.5 Effekter av olika extraherade delar av Cistanche deserticola på blodsockernivåer hos db/db svarta möss

2.5.1 Oralt glukostoleranstest (OGTT).

Efter 26 dagars administrering fastade de i 12 timmar och 60 minuter efter administrering nästa dag fick de svarta mössen i varje grupp 2,0 g·kg-1 glukos vid 0, {{10}}.5, 1.0 respektive 2. .0 h svansvensblod togs för att mäta blodsockervärdet. Med blodsockervärdet som ordinatan och tiden som abskissan gjordes ett blodsockerförändringsdiagram och arean under linjen för blodsockerkurvan för varje experimentgrupp beräknades enligt formeln (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. I formeln: A, B, C och D är blodsockervärdena vid 0, 0,5, 1,0 respektive 2,0 timmar.

2.5.2 Beräkning av insulinresistensindex och arteriosklerosindex

Insulinresistensindexet beräknades enligt litteraturmetoden [20]: HOMA-IR=Glukos × Insulin / 22. 5. HOMA - =20 × Insulin / (Glukos - 3.5) × 100 %. IR är insulinresistens och (%) är -cellfunktion. Den molära enheten för glukos är mmoL·L-1

. Insulin ges i mU·L-1. Glukos- och insulinantal mäts under fasta. Arteriosklerosindex (aterogent index) beräknades enligt metoden som beskrivs av Zheng et al. [21]. Beräkningsmetod: Aterogent index=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Effekter av olika extraherade delar av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola på serum INS och HbA1c från db/db svarta möss

Ta de frysta serumproverna och låt dem få rumstemperatur innan de används för testning med INS- och HbA1c-enzymkopplade immunanalyskit. Följ strikt metoderna och stegen i kitinstruktionerna.

2.6 Effekter av olika extraherade delar av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola på leverns oxidativa stressnivå hos db/db svarta möss

Ta de frysta serumproverna och låt dem få rumstemperatur innan de används för testning med MDA- och SOD-enzymkopplade immunanalyssatser. Följ strikt metoderna och stegen i kitinstruktionerna.

2.7 Effekter av olika extraherade delar av Cistanche deserticola/Cistanche deserticola på leverfettmetabolismen hos db/db svarta möss

Råttserum-TG, TC, HDL-C och LDL-C-nivåer mättes med hjälp av relevanta kit. För specifika mätsteg, se satsens instruktioner.

2.8 Effekter av olika extraherade delar av Cistanche deserticola/Ratiana kamfer på UA, Cr och mALB i plasma och urin från db/db svarta möss

Ta frysta plasma- och urinprover och låt dem få rumstemperatur innan de används för att testa UA-, Cr- och mALB-enzymkopplade immunanalyssatser. Följ strikt metoderna och stegen i kitinstruktionerna.

2.9 Observation av pankreas- och njurpatologiska snitt genom HE-färgning

Bukspottkörteln och njurvävnaderna indränkta i 10 % paraformaldehydfixativ under 24 timmar avlägsnades, tvättades med destillerat vatten och lagrades i 70 % etanol. Vävnadsprover avlägsnades, dehydrerades med graderad etanol, rengjordes, inbäddades i paraffin, sektionerades och färgades sedan med hematoxylin och eosin (H&E-färgning). När sektionslimmet har torkat, använd ett högupplöst digitalt bildsystem för att observera och ta bilder av sektionerna.

2.10 Bestämning av njurvävnad typ IV kollagen genom immunhistokemi

För uttryck avvaxades njursektioner till vatten och utsattes sedan för antigenåtervinning. De blockerades med 10 % getserum och inkuberades med den primära antikroppen vid 4 grader över natten. Efter tvättning inkuberades den sekundära antikroppen. Den nuvarande lösningen var DAB för färgutveckling. Tvätt, uttorkning och försegling utfördes under ett optiskt mikroskop. Observera typ-IV kollagenproteinuttrycket i njurvävnad.

2.11 Statistiska metoder

Använda GraphPad Prism version 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) programvara för att analysera data och resultat

Resultatet är medelvärde±SEM Indikerar att skillnaden mellan de två grupperna är enkelriktad

ＡＮＯＶＡ(ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ ett par kolumntest) metod, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.