Effekter av Glyeosider of Cistanche på inlärning av kognition och synaptisk plasticitet hos sömnbristmodellråttor

ABSTRAKT

Mål:'Att undersöka omglykosider av cistanchekan förbättrainlärning och kognitiv funktion av sömnbristmodell råttor avreglerar synaptisk plasticitet. Metoder: Femtio Wistar-hanråttor delades slumpmässigt in i blank kontrollgrupp (kontroll), plattformskontrollgrupp (PC), modellgrupp (modell),glykosider av cistanche-gruppen(GCs) och estazolamgrupp (Est). Sömnbristmodellen för råttor framställdes med en modifierad vattenmiljömetod med flera plattformar. Morris vattenlabyrint och öppet fälttest användes för att detektera råttorrumslig kognitiv funktion aoch känslomässiga förändringar. Nissl-färgning användes för att observera förändringarna imorfologi och kvantitet av nervcelleri hippocampus CAl-området hos råttor. Western blot och R'T - PCl användes för att detektera expressionsnivåerna av synaptophysin(SYN), postsynaptisk membrantät substans 95 (PSD - 95) och hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF). Resultat: Resultaten från Morris vattenlabyrint visade att jämfört med kontrollgruppeninlärning och kognitiv förmågaav råttor i modellgruppen minskade signifikant (P<0. 05 ), and theinlärnings- och minnesfunktion hos råttorvar förbättrad GC-behandling (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Slutsats: Glykosider av cistanchekan påverka synaptisk plasticitet genom att reglera uttrycket av synaptiska relaterade markörer, och därigenom förbättra inlärningen och kognitiva funktionen hos sömnbristmodellråttor.

NYCKELORDGlykosider av cistanche; Hippocampus; Sömnbrist; Inlärning och minne; Ångest; Synaptisk plasticitet

HÖG NIVÅ GLYKOSIDER AV CISTANCHE TILL SALU

Sömnstörning (SD)är enfunktionell sömnstörningorsakas av en rad komplexa faktorer som sömnlöshet, frekventa drömmar och lätt uppvaknande. Förekomsten av SD har successivt ökat de senaste åren. Relaterade studier har rapporterat att SD kan orsakahjärt-kärlsjukdomar, metabolisk dysfunktion, immunsjukdomaroch degenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet såsom Alzheimers sjukdom [1]. SD kan orsaka oxidativ skada på hippocampus neuroner, orsaka kognitiv dysfunktion och producera humörförändringar som ångest och depression [2]. Cistanche deserticola är ett dyrbart kinesiskt medicinskt material som kan användas som medicin och mat. Det har effekterna att tonifiera njuren och fylla på qi, fukta tarmarna, främja tarmrörelser och stärka yang. Huvudextraktet av Cistanche deserticola, glykosider av cistanche (GCs), har antioxiderande, anti-apoptotiska, leverskyddande och neuroprotektiva effekter [3]. Vår tidigare forskning fann att GC kan förbättra inlärningen och kognitiva funktionen hos SAMP8-möss genom att spela en antioxidant och anti-apoptotisk roll [4]. Besläktade studier har visat att kognitiv dysfunktion orsakad av SD är nära relaterad till synaptisk plasticitet [5]. Det finns dock få rapporter om mekanismen genom vilken GC reglerar synaptisk plasticitet och förbättrar inlärnings- och minnesförsämring och kognitiv nedgång hos råttor som orsakas av sömnbrist. Därför syftar denna studie till att undersöka om GC påverkar synaptisk plasticitet genom att reglera uttrycket av synaptiska relaterade markörer, och därigenom förbättra inlärningen och kognitiva funktionen hos råttor i sömnbristmodellen, och tillhandahålla nya behandlingsidéer och planer för behandling av inlärning och kognitiv funktionsnedsättning orsakad av sömnstörningar med GC.

1 Material och metoder

1. 1 Försöksdjur

Wistar-hanråttor i åldern 6 till 8 veckor, som vägde 280 till 300 g, köptes från Beijing Sibeifu, med en djurproduktionslicens [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Alla djur hölls i Animal Experiment Center vid Baotou Medical College under följande förhållanden: temperatur (24 ± 1) grad, luftfuktighet 50% till 55%, 12 timmar ljus och 12 timmar mörker, och inga restriktioner för mat och vatten. Detta experiment godkändes av skolans etiska kommitté [Baoyi Lunshen 2022 nr (63)].

1. 2 Huvudreagenser och instrument

Totalt antal glykosider av Cistanche deserticola köptes från Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (batchnummer: KSM20220609011); Estazolam-tabletter köptes från CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (satsnummer: 044220343); proteinladdningsbuffert (P1015), RIPA-lysbuffert (R0010), kemiluminescerande lösning (PE0010), etc. köptes alla från Beijing Solebao; postsynaptisk densitet substans 95 (PSD-95) antikropp (AB192757), synaptophysin (SYN) antikropp (ab32127), köpt från Abcam, USA; hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) (48503-2), -aktin (52901), köpt från SAB, USA; get-anti-kanin IgG sekundär antikropp (SA00001-20), köpt från Proteintech, USA; råttmelatonin (MT), ELISA-kit (MM-0657R1), köpt från Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Paraffinskärare (Leica, Tyskland); optiskt mikroskop (Leica, Tyskland); Morris vattenlabyrint, öppet fält testbox (Shanghai Xinruan); vertikalt elektroforesinstrument

(Beijing Liuyi Company); avfärgningsshaker (Beijing Liuyi Company); protein avbildning analyssystem (Shanghai Tanon Technology); fluorescens kvantitativt PCR-instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Experimentella metoder

1. 3. 1 Djurgruppering och läkemedelsadministration

50 Wistar-hanråttor delades slumpmässigt in i blank kontrollgrupp (kontrollgrupp), plattformskontrollgrupp (plattformskontroll, PC-grupp), modellgrupp (modellgrupp), totala glykosider av Cistanche deserticola-grupp (GCs-grupp) , 50 mg/kg) och estazolagrupp (Est-grupp, 0,54 mg/kg), med 10 råttor i varje grupp. Kontrollgruppen och PC-gruppen gavs 0,9 % koksaltlösning genom sondmatning. Alla grupper gavs vid 7 på morgonen varje dag efter att modelleringen började, och sondmatningen varade i 21 dagar.

1. 3. 2. Förberedelse av djurmodell för sömnbrist

Sömnbristmodellen etablerades med den modifierade vattenmiljömetoden för flera plattformar [6]. Den experimentella utrustningen var en 130 cm x 50 cm x 45 cm rektangulär vattentank av polyetenharts. En liten plattform med en diameter på 5 cm och en höjd av 20 cm placerades i vattentanken. Plattformen för PC-gruppen hade en diameter på 10 cm och en höjd på 20 cm. Vattentanken fylldes med vatten till ett djup av cirka 18 cm och vattentemperaturen hölls vid (20 ± 1) grader. En vecka innan experimentets början placerades råttorna i sömnbristlådan varje dag i 60 minuter för att bekanta sig med miljön. Efter att modellen etablerats, förutom kontrollgruppen, placerades råttorna i varje grupp på den lilla plattformen i tid från 8:00 till 20:00 varje dag för sömnbrist under 21 dagar i följd. Alla råttor fick äta och dricka fritt och röra sig fritt på plattformen, med 12 timmars ljus och mörker omväxlande varje dag.

1.3.3 Morris vattenlabyrintexperiment

Morris vattenlabyrint delades upp i fyra områden, fyllda med vatten, och plattformen placerades i fjärde kvadranten. Vattenytan låg ca 2 cm ovanför plattformen. Matklassat ätbart melanin sattes till vattnet och vattentemperaturen hölls vid (25 ± 1) grader. (1) Positioneringsnavigeringsexperiment: Mitten av varje område valdes och råttorna placerades försiktigt i vattnet. De fick utforska fritt. Tiden det tog för råttorna att hitta målplattformen inom 60 sekunder registrerades. Råttor som inte hittade plattformen leddes till plattformen och stannade i 20 sekunder. Utbildningen fortsatte i 5 dagar. (2) Spatial utforskningstest: Den 6:e dagen avlägsnades plattformen och råttorna placerades i vattnet från mitten av den 2:a kvadranten mot väggen. Antalet gånger råttorna passerade plattformen inom 120 s och tiden de stannade i den 4:e kvadranten registrerades.

1.3. 4 Öppet fältexperiment

En 100 cm × 100 cm × 50 cm experimentlåda användes, och botten av lådan var uppdelad i 9 galler. Varje grupp råttor placerades i det öppna fältförsöksrummet i förväg för att anpassa sig till inomhusmiljön under 60 min. I början av experimentet placerades testråttorna i de fasta hörnen av den öppna fältexperimentlådan i tur och ordning, och antalet stående tider, rörelseavstånd och statisk tid för råttorna inom 5 minuter registrerades med hjälp av programvara för beteendeanalys. . Omgivningen krävdes att vara tyst under experimentet, och den experimentella enheten torkades med rent vatten respektive alkohol mellan två experiment för att undvika att lukten från den föregående råttan påverkade beteendebedömningen hos nästa råtta.

1. 3. 5 Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA)

Detektering av serum-MT-nivåer hos råttor Råttor bedövades genom intraperitoneal injektion och 5 ml blod samlades in från den abdominala aortan. Efter att ha väntat i 30 minuter vid rumstemperatur centrifugerades blodet för att erhålla serum. 40 μL provspädningsmedel tillsattes till varje brunn och sedan tillsattes 10 μL av provet som skulle testas. Efter försegling med förseglingsfilmen, inkubera vid 37 grader i 30 min. Tvätta 5 gånger, tillsätt 50 μL enzymmärkningslösning och inkubera vid 37 grader i 30 minuter efter försegling med förseglingsfilmen. Tvätta 5 gånger, tillsätt sedan den färgframkallande lösningen och reaktionsstopplösningen i tur och ordning. OD-värdet för varje brunn mättes med enzymmärkningsinstrumentet vid en våglängd av 450 nm.

１. ３. ６ Nissl-färgning

Tre råttor togs från varje grupp och hjärnvävnaden avlägsnades genom halshuggning. Hjärnvävnaden fixerades med 4% polymetylmetakrylatlösning och vävnaden dehydrerades, nedsänktes i vaxlösning och bäddades in och vävnaden skars i skivor med konventionella metoder. Skivorna hölls med en tjocklek av 5 μm, sköljdes med PBS, färgades med 0. 1 % toluidinblått för 0. 5 h, differentierad med 95 % alkohol, dehydrerad med 100 % alkohol, genomskinlig med xylen och förseglad med neutralt gummi. Förändringarna i morfologin och antalet neuroner i CA1-regionen av råtthippocampus observerades under ett mikroskop och bilder samlades in.

１. ３. 7 Western blot-experiment

Fyra råttor valdes ut från varje grupp och hippocampus isolerades genom halshuggning. Hippocampusvävnaden blandades med RIP A-lysbuffert i en isbadsmiljö och centrifugerades för att erhålla supernatanten. Proteinkoncentrationen detekterades med BCA-metoden. 20 ug protein tillsattes med proteinladdningsbuffert för elektrofores. Efter att proteinelektroforesen avslutats överfördes membranet vid 300 mA konstant flöde, blockerades med 5% skummjölkspulver, den primära antikroppen inkuberades vid 4 grader över natten och den sekundära antikroppen inkuberades vid rumstemperatur i 2 timmar. Efter att färgutvecklingslösningen använts användes kemiluminescensbildanalyssystemet för statistisk analys av proteinband.

1. 3. 8 RT-PCR-experiment

Tre råttor valdes från varje grupp för att framställa hippocampusvävnadshomogenat. Det totala RNA:t i vävnadsvätskan extraherades med Trizol-metoden och koncentrationen mättes. Ett fastande cDNA-synteskit användes för omvänd transkription, och en fluorescenskvantitativ amplifieringsreaktion användes för att detektera den relativa expressionsnivån av synaptiskt relaterat protein-mRNA med användning av ett fluorescenskvantitativt kit. Resultaten analyserades med användning av 2-ΔΔCt, och primersekvenserna visas i tabell 1.

1.4 Statistiska metoder

Dataresultaten som överensstämde med normalfördelningen uttrycktes som medel ± standardavvikelse (x ± s), och statistisk analys utfördes med programvaran GraphPad Prism 9.5. Enkelfaktorvariansanalys användes för jämförelse mellan flera prover och P < 0.05 indikerade att skillnaden var statistiskt signifikant.