Äggskalsmembran lindrar hyperurikemi genom att öka utsöndringen av urat hos råttor som injicerats med kaliumoxonat
Mar 16, 2022
Abstrakt:Hyperurikemi är den primära orsaken till giktartrit och andra metabola störningar. Äggskalsmembran (EM) är ett effektivt och säkert tillskott för att bota smärta och stelhet i samband med artros. Emellertid är effekten av EM på hyperurikemi oklar. Denna studie bestämmer effekterna av EM på kaliumoxonat-injicerad hyperurikemi. Urinsyra, kreatinin, koncentrationer av ureakväve i blodet i serum och xantinoxidasaktivitet i levern mäts. Proteinnivåer avnjur- urattransportör 1 (URAT1), organiska anjontransportörer 1 (OAT1), glukostransportör 9 (GLUT9) och ATP-bindande kassetttransportör G2 (ABCG2) injurebestäms mednjur-histopatologi. Resultaten visar att EM minskar serumurinsyranivåerna och ökar urinens urinsyranivåer hos hyperurikemiska råttor. Dessutom nedreglerar EMnjur-URAT1-proteinuttryck, uppreglerar OAT1 och ABCG2, men ändrar inte GLUT9-uttryck. Dessutom förändrar EM inte xantinoxidasaktiviteten i levern eller serumet. EM minskar också urinsyraupptaget i oocyter som uttrycker hURAT1. Slutligen minskar EM markantnjur-inflammation och seruminterleukin-1 nivåer. Dessa fynd tyder på att EM uppvisar antihyperurikemiska effekter genom att främja njur-uratutsöndring och regleringnjur-urattransportörer. Därför kan EM vara användbart vid förebyggande och behandling av gikt och hyperurikemi.
Nyckelord:Njure; njur; gikt; urattransportör 1; urinsyra; kaliumoxonat
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR/NJURDIALYS
Äggskalsmembran (EM) är filmen fäst på insidan av äggskalet och är en av komponenterna i ägg, ett viktigt livsmedel för människors hälsa. Det möjliggör penetration av syre och blockerar invasionen av mikroorganismer. EM består av organiskt material (70 procent), oorganiskt material (10 procent) och vatten (20 procent), varvid 80 procent av det organiska materialet består av protein. Dessutom består den av 2,3 procent fett och 3,4 procent kolhydrater [1,2]. Bland beståndsdelarna i ägg används äggula och äggvita som råvaror för mat, och äggskal är en råvara för kalciumtillskott för att bilda och underhålla tänder och ben [3]. Emellertid klassas EM som avfall och används inte ofta. De antiartritiska effekterna av EM har nyligen rapporterats i en lipopolysackarid-inducerad djurmodell och i humana kliniska studier [4,5]. EM har också förbättrat inflammation hos råttor med kollageninducerad reumatoid artrit [6]. Dessutom har EM visat antiartritisk aktivitet hos mononatriumjodacetat-inducerade artrosråttor [7]. Mononatriumjodacetat är en inducerare av giktartrit, och ansamling av mononatriumuratkristaller i lederna kan resultera i inflammation, vilket leder till giktartrit. Hyperurikemi kan orsaka att kristaller av urinsyra (eller urat) bildas, och avsättningen av dessa kristaller i lederna orsakar gikt, en form av artrit som kan vara mycket smärtsam. EM är en källa till kollagen, kondroitinsulfat, glukosamin, hyaluronsyra och kalcium, som alla har undersökts omfattande för behandling av artros [8]. Resultaten av dessa studier visar den potentiella användbarheten av EM för att förebygga och behandla gikt och hyperurikemi.
Hyperurikemi är en viktig riskfaktor för utvecklingen av insulinresistens, diabetes, fetma, högt blodtryck, åderförkalkning och hjärt-kärlsjukdom, såväl som giktartrit [9–11]. Lämplig kontroll av hyperurikemi bidrar till att förebygga och behandla dessa sjukdomar. Hyperurikemi uppstår med ökad urinsyraproduktion eller försämrad urinsyrautsöndring [12]. Genom att minska produktionen och öka utsöndringen av urinsyra kan uratsänkande behandling spela en avgörande roll i kontrollen av hyperurikemi och hyperurikemiassocierade störningar [13]. Vanliga uratsänkande läkemedel som allopurinol och febuxostat, en hämmare av urinsyrasyntes, används ofta för att behandla gikt; dock kan dessa xantinoxidas (XO)-hämmare ha allvarliga biverkningar, såsom allopurinol överkänslighetssyndrom [14–16]. Bensbromaron är ett urikosuriskt läkemedel som har använts för att kontrollera gikt under de senaste 30 åren, men på grund av allvarliga levertoxicitetsbiverkningar drogs det tillbaka från den europeiska marknaden [17]. Det finns således ett behov av att utveckla läkemedel som härrör från naturliga produkter utan toxicitet som är mer effektiva för förebyggande och långtidsbehandling av hyperurikemi-associerade störningar. Därför undersöker denna studie om EM skyddar mot hyperurikemi. Denna studie utvärderar den antihyperurikemiska aktiviteten av EM hos råttor med hyperurikemi inducerad av kaliumoxonat (PO). PO är en selektivt kompetitiv urikashämmare, som används allmänt för att hämma effekten av leverurikas, vilket leder till hyperurikemi [18,19]. Således är PO-behandlade råttor en praktisk djurmodell inte bara för att undersöka patologin för hyperurikemi utan också för att utvärdera potentiella mediciner [20]. För att undersöka aktiviteten och de underliggande mekanismerna för EM på hyperurikemi, undersöks de dubbla mekanismerna för EM via hämning av urinsyraproduktion och förstärkning av urinsyrautsöndring i hyperurikemiska djur.
CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSFULLT
2. Material och metoder
2.1. DjurSju veckor gamla Sprague Dawley-hanråttor köptes från Orient Bio (Seongnam, Korea). De anpassades i ett luftkonditionerat djurrum vid 22 ± 1 ◦C med 50 procent ± 10 procent luftfuktighet. Råttorna fick tillgång till en standarddiet och vatten ad libitum. Djurstudierna godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Korea Institute of Oriental Medicine, och experimenten utfördes i enlighet med kommitténs riktlinjer (godkännandekod. 19-024).
2.2. Hyperurikemi-induktion och EM-administrationEM som användes i denna studie tillhandahölls som ett torkat pulver av JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd. (Cheonan, Korea). För att inducera hyperurikemi injicerades 15 0 mg/kg PO (en urikashämmare) intraperitonealt i djuren. Följande positiva kontrollläkemedel användes: allopurinol (Sigma, St. Louis, MO, USA) och bensbromaron (TCI, Tokyo, Japan). Före injektion löstes PO i 0,5 procent karboximetylcellulosa (CMC, Sigma, USA) och 0,1 M natriumacetat (Sigma, USA). För att undersöka de antihyperurikemiska aktiviteterna av EM (experiment 1, preliminär akut studie), delades råttorna in i fem grupper (5 djur per grupp): en normal grupp; en PO-injicerad hyperurikemigrupp (PO); en PO plus 10 mg/kg allopurinol-administrerad grupp; en PO plus 100 mg/kg EM-administrerad grupp; och en PO plus 200 mg/kg EM-administrerad grupp. I experiment 1 löstes prover i CMC och administrerades oralt (en gång) till råttorna 1 timme efter PO-injektion under 1 dag. För att undersöka de dosberoende aktiviteterna och molekylära mekanismerna för EM (experiment 2), delades råttorna in i 7 grupper (n=5 vardera): en normal grupp (N); en PO-injicerad hyperurikemigrupp; en PO plus 10 mg/kg allopurinol-administrerad grupp; en PO plus 50 mg/kg bensbromaron-administrerad grupp; en PO plus 50 mg/kg EM-administrerad grupp; en PO plus 100 mg/kg EM-administrerad grupp; och en PO plus 200 mg/kg EM-administrerad grupp. Prover löstes i 0,5 procent CMC-lösning och administrerades oralt (varje dag) till råttorna 1 timme efter PO-injektion under 5 dagar.
2.3. Samling av blod-, urin- och vävnadsproverBlod samlades in 2 timmar efter läkemedelsadministrering, och urin samlades också in efter 2 timmar, med användning av en metabolisk bur efter provbehandling. Efter insamling av blod och urin, vävnad(njureoch lever) prover delades försiktigt upp och bevarades vid 80 ◦C för ytterligare analyser. Serumet separerades genom centrifugering (2000 x g, 15 min, 4 ◦C). Serum- och urinproverna användes sedan för biokemisk analys.
2.4. Analys av urinsyrakoncentrationer i serum och urinUrinsyrakoncentrationerna från serumet och urinen bestämdes med användning av ett kommersiellt urinsyraanalyskit (Biovision, Milpitas, CA, USA) enligt instruktioner från tillverkaren.
2.5. Mätning av proinflammatoriska cytokinnivåer i serumSeruminterleukin (IL)-1-koncentrationer mättes med användning av en rått-IL-1 enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA)-kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).
2.6. In Vitro Xanthine Oxidase Activity från lever och serumXO-aktiviteten i levervävnad och serum bestämdes med användning av XO-aktivitetsanalyssatsen enligt tillverkarens protokoll (Sigma, USA). XO-aktiviteten mättes med en Spectra Max M3 mikroplattläsare (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) med tidigare publicerade protokoll [21]. Enzymreaktionen initierades genom tillsats av 0,5 mM xantin som substrat, och koncentrationen av urinsyra mättes varje minut under 5 min. XO-hämmaren allopurinol användes som referens. Den hepatiska XO-aktiviteten normaliserades av den totala proteinnivån.
CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURINFEKTION
2.7. Njurhistopatologisk undersökningNjurvävnad avlägsnades, fixerades omedelbart under 1 dag i formalin och bäddades sedan in i paraffin. Varje prov skars 6 µm tjockt och sektionerna färgades med hematoxylin och eosinreagens. De färgade sektionerna visualiserades sedan under mikroskopi.
2.8. Western blot-analysNjurevävnader homogeniserades i en pro-prep-extraktionslösning (Intron, Seoul, Korea) och centrifugerades sedan (13,000× g, 4 ◦C) i 15 min. Supernatanten användes för Western blotting-analys av målproteinerna. Totala proteinnivåer bestämdes genom en DC-proteinanalys med bovint serumalbumin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De primära antikropparna inkluderade -aktin (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), glukostransportör 9 (GLUT9, MyBioSource, San Diego, CA, USA), urattransportör 1 (URAT1; MyBioSource, San Diego, CA, USA) och organisk anjontransportör 1 (OAT1; MyBioSource, San Diego, CA, USA). Banden från membranet visualiserades med ECL-detektionsreagens med hjälp av en ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Seoul, Korea). Densiteten från de erhållna bilderna bestämdes med hjälp av programvaran Image J1.49 från NIH (Bethesda, MD, USA). De visualiserade målproteinnivåerna normaliserades till -aktin. ATP-bindande kassetttransportör G2 (ABCG2) uttryck erhölls med användning av ett rått ABCG2 ELISA kit (MyBioSource) och normaliserades av totala proteinnivåer.
2.9. Mätning av Uratupptag med UART1-Uttryckande oocyterDe hURAT{{0}}uttryckande oocyterna från Xenopus konstruerades som tidigare beskrivits [20]. URAT1-hämmaren bensbromaron (TCI, Tokyo, Japan) behandlades som referens. Oocyterna inkuberades i en reaktionsbuffert med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) och en ND-lösning (pH 7,4; 5 mM 4-(2- Hydroxietyl)) piperazin-1-etan-sulfonsyrabuffert, 2 mM KCl, 1 mM magnesiumklorid, 1,8 mM kalciumklorid och 96 mM natriumklorid), med 1 mM pyrazinkarboxylsyra (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA) vid 37 ◦C. Oocyterna inkuberades ytterligare i en lösning innehållande olika koncentrationer av EM (1, 10 och 100 µg/ml) med 50 µM [14C] urinsyra (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) vid 37 ◦C. Efter 60 minuter stoppades urinsyraupptaget genom ett tillskott av kall DPBS. Efter stopp löstes oocyterna i en lösning av 0,1 N natriumhydroxid och 10 % natriumdodecylsulfat, och radioaktiviteten räknades genom vätskescintillation.
2.10. StatistikAlla data uttrycktes som medel ± standardfel för medelvärdet. De signifikanta skillnaderna utvärderades statistiskt genom envägsvariansanalys följt av Dunnetts test för post hoc-analys med GraphPad Prism 7.05 programvara. Skillnaden ansågs statistiskt signifikant när p-värdet var mindre än 0,05.
3. Resultat
3.1. Effekter av äggskalsmembran på urinsyrautsöndring i serum,En enda PO-injektion under 1 dag ökade signifikant serumurinsyranivåerna hos PO-injicerade hyperurikemiska råttor jämfört med de hos normala råttor (Figur 1). Samtidigt reducerade EM vid 100 och 200 mg/kg och allopurinol (positiv kontroll) effektivt serumurinsyra hos PO-injicerade hyperurikemiska råttor. Därför utfördes nästa studier för att identifiera de dosberoende aktiviteterna och mekanismerna för EM.
3.2. Effekter av äggskalsmembran på urinsyranivåer i serum och urin,APO-injektion under 5 dagar höjde signifikant serumurinsyranivåerna i PO-gruppen jämfört med de i den normala gruppen (Figur 2a). Behandlingen av EM vid 100 och 200 mg/kg, liksom allopurinol och bensbromaron, reducerade signifikant serumurinsyranivåerna i PO-gruppen. Dessutom att utvärderanjurfunktion, koncentrationer av kreatinin och blodkarbamidkväve (BUN) mättes. Serumkreatininkoncentrationerna var inte olika mellan grupperna (Figur 2b). Serum-BUN-koncentrationerna höjdes i PO-gruppen, men dessa nivåer minskade i gruppen EM 200 mg/kg och den positiva kontrollen (allopurinol och bensbromaron) (Figur 2c).
För att utvärdera effekten av EM på urinsyrautsöndringen undersöktes urinens urinsyranivåer. PO-gruppen hade signifikant minskade nivåer av urin-urinsyra, som ökade genom administrering av EM (100 och 200 mg/kg) och bensbromaron (Figur 2d). Dessa data visade att EM kan öka extraktion av njururat för att minska serumurinsyranivåerna hos hyperurikemiska råttor.
3.3. Effekter av äggskalsmembran på njurinflammationMild tubulär dilatation, vakuolär degeneration av den tubulära epitelcellen, svullnad och infiltration av inflammatoriska celler observerades injureav PO-injicerade hyperurikemiska råttor (Figur 3a). Emellertid förbättrade EM dessa effektivtnjur-histopatologiska förändringar hos hyperurikemiska råttor. Dessutom visade hyperurikemiska råttor ökade serumnivåer av proinflammatoriskt cytokin IL -1 (Figur 3b). EM vid alla koncentrationer nedreglerade serumnivåerna anmärkningsvärt hos hyperurikemiska råttor. Administrering av bensbromaron ökade serum-IL-1-nivåerna mer än PO-injicerade hyperurikemiska råttor, även om det inte är signifikant, och det är förmodligen biverkningen av detta läkemedel. Dessa resultat tyder på att EM effektivt förbättradesnjureinflammation och funktion hos hyperurikemiska råttor.
3,34. Effekter av äggskalsmembran på XO-aktivitet
XO i levern inducerar urinsyraproduktion. Således, för att definiera mekanismen för den hämmande effekten av EM på hyperurikemi, utvärderades XO-aktiviteten i serum och lever, lever XO-aktivitet ökade signifikant i PO-gruppen (Figur 4a,b). XO-hämmaren, allopurinol, minskade signifikant XO-aktiviteten i serum och lever. Emellertid ändrade EM inte XO-aktivitet vid alla doser. Dessa data indikerar att EM inte hämmar XO-aktivitet och minskar urinsyraproduktionen.
3.5. Effekter av äggskalsmembran på uratutsöndringFör att utvärdera effekten av EM på uratutsöndring, uttrycket av fleranjurtransportörerundersöktes. EM vid 100 och 200 ug/mL, och bensbromaron, sänkte signifikant URAT1-proteinnivåerna injure(Figur 5a,b). Emellertid ändrade EM inte GLUT9-proteinnivåerna (Figur 5c). EM vid 200 ug/ml ökade OAT1-proteinnivåerna och EM-administrationen vid alla koncentrationer ökade ABCG2-nivåerna (Figur 5d, e).
3.6. Effekt av EM på in vitro URAT1-upptag i oocyterDessutom bekräftades effekten av EM på in vitro uratupptagssystem. EM-behandlingen vid 1, 10 och 100 ug/mL uppvisade potent hämning av urinsyraupptag in vitro hURAT1-överuttryckande oocyter (Figur 6). Dessa data indikerar att EM reglerar uttrycket av urattransportörer för att öka uratutsöndringen.
Diskussion
Hos människor spelar njurarna en viktig roll i urinsyrahomeostas, eftersom mer än 70 procent av uratutsöndringen ärnjur,medan de återstående 30 procenten utsöndras i avföringen från tarmen [22,23]. Uratutsöndringen kan dock försämras avnjur-störningar som leder till hyperurikemi. Utsöndringen av urinsyra är beroende av transportproteiner i proximala tubulinjureför att kontrollera utsöndringen av urinsyra i blodet och filtratet [24].Njururattransportörer URAT1, belägen vid det luminala membranet, och GLUT9/ vid det apikala membranet avnjureproximala tubuli, utgör den primära vägen för uratreabsorption injure[25,26]. OAT1, som ligger i det basolaterala membranet av den proximala tubuli, och ABCG2, som ligger vid det apikala membranet, är främst ansvariga för uratutsöndring från blodet till epitelceller [27]. Regleringen av dessa urattransportörer anses vara ett stort terapeutiskt mål för hyperurikemi. I denna studie minskade EM effektivtnjur-URAT1-nivåer i PO-injicerade hyperuremiska råttor, även om GLUT9-proteinuttryck inte förändrades. Dessutom var OAT1- och ABCG2-proteinuttryck uppreglerade injureefter EM-behandlingen, och uppvisar därigenom en urikosurisk effekt. Denna studie bekräftade den hämmande aktiviteten av EM på uratupptag av URAT1 i URAT1-överuttryckande oocyter och att denna effekt var effektiv för att vända URATl-främjat uratupptag. Totalt erhålls 90 procent av uratreabsorptionen genomnjur-URAT1 [28]. Kontrollen av dessanjureurattransportörer genom EM-behandlingen kan bidra till att främjanjur-urinsyrautsöndring hos hyperurikemiråttor. Kreatinin och ureakväve är biomarkörer för onormaltnjurefunktion, som indikerar förmågan hosnjureatt utsöndra proteinmetaboliter [24]. Resultaten visade att PO ökar serumurinsyra- och BUN-koncentrationerna mednjur-dysfunktion. Emellertid vände EM på 200 mg/kg denna ökning med förbättradnjurfunktion. Enzymet XO katalyserar oxidationen av hypoxantin eller xantin till urinsyra [28]. XO-hämmarna, såsom allopurinol, minskar serumurinsyrakoncentrationer och överproduktionen av reaktiva syrearter, främst förknippade med XO-överaktivitet, vilket ofta genererar inflammatoriska cellskador på det vaskulära endotelet, vilket bidrar till utvecklingen av det metabola syndromet och kardiovaskulära störningar [29] ]. Därför kan hämningen av XO-överaktivering vara ett terapeutiskt mål för att kontrollera de skadliga effekterna av överskott av urinsyra. Vår studie visade dock att EM inte vände serum och lever XO-aktivitet hos råttor med PO-inducerad hyperurikemi.
Hyperurikemi kan vara ett riskmoment förnjuredysfunktion [23]. I föreliggande studie,njuredysfunktion kännetecknades av ökade BUN-nivåer i serum och inflammatoriska cytokiner IL-1p ochnjur-inflammation hos hyperurikemiska råttor. Dessanjur-dysfunktioner försvagades av EM-behandlingen, vilket tyder på en förbättring av njurinflammation. Läkemedlet bensbromaron förhöjde dock IL-1p-nivåer i serum hos hyperurikemiska råttor, och njurskador rapporterades som en primär negativ effekt av urikosuriska läkemedel, inklusive bensbromaron och probenecid [30]. EM innehåller naturligt förekommande glukosamin, kondroitinsulfat, hyaluronsyra, kollagen, peptider och andra svavelhaltiga aminosyror [8]. Tidigare studier rapporterade att glukosamin och kondroitin har visat antiinflammatoriska och anti-artroseffekter [31,32]. Hyaluronsyra uppvisade antiinflammatoriska och antihyperurikemiska effekter i mononatriumuratkristallinducerade djurmodeller för akut giktartrit och hyperurikemi [33]. Resultaten av dessa studier visar den potentiella användbarheten av dessa komponenter för att förebygga och behandla hyperurikemi. Vår studie visade dock inte vilka komponenter i EM som förstärkte utsöndringen av urinsyra. Effekterna av bioaktiva komponenter som härrör från EM måste undersökas ytterligare. I denna studie visade vi att PO-inducerad hyperurikemi ochnjurinflammationhämmades av EM-behandling. Därför kan EM vara ett lovande antihyperurikemiskt medel. Antag att en effektiv dos av EM hos råttor är 100 mg/kg (maximal dos; 200 mg/kg). Baserat på kroppsytan är den mänskliga ekvivalentdosen av EM 16,2 mg/kg (972 mg/dag hos vuxna). Från dessa in vivo-studier är den rekommenderade dagliga dosen av EM under milda tillstånd 486 mg eller 972 mg dagligen, och en maximal dos är 1944 mg dagligen för svåra tillstånd. Doseringen kan dock variera beroende på behandlingslängd och ålder. Baserat på dessa resultat kommer en human klinisk studie av EM att fortsätta inom en snar framtid.
