Förbättring av fenyletanoidglykosiders biosyntes i cellkulturer av Cistanche Deserticola genom osmotisk stress

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstraktEffekten av osmotisk stress på celltillväxt och fenyletanoidglykosider (PeGs) biosyntes undersöktes i cellsuspensionskulturer avCistanche deserticolaYC Ma, en medicinalväxt i öknen som odlas i den västra delen av Kina. Olika initiala sackaroskoncentrationer påverkade signifikant celltillväxt och PeGs-biosyntes i suspensionskulturerna, och den högsta torrvikten och PeGs-ackumuleringen nådde 15,9 gl–1-DW respektive 20,7 mg g–1-DW vid den initiala osmotiska stress på 300 mOsm kg–1 där sackaroskoncentrationen var 175,3 mM. Stökiometrisk analys med olika kombinationer av sackaros och icke-metaboliskt socker (mannitol) eller icke-sockerosmotiska medel (PEG och NaCl) visade att osmotisk stress i sig var en viktig faktor för att förbättra PeGs biosyntes i cellsuspensionskulturer avCistanche deserticola. De maximala PeGs-halterna på 26,9 och 23,8 mg g–1-DW erhölls efter 21 dagar vid kombinationerna av 87,6 mM sackaros med 164,7 mM mannitol (303 mOsm kg–1) respektive 20 mM PEG, vilket var högre än den för C. deserticola-cellkulturer odlade under en initial sackaroskoncentration av 175,3 mM efter 30 dagar. Den stimulerade PeGs-ackumuleringen i cellsuspensionskulturerna var korrelerad till ökningen av fenylalanin-ammoniumlyas (PAL)-aktivitet inducerad av osmotisk stress.

Nyckelord Cistanche deserticola, Läkeväxt i öknen, Fenyletanoidglykosider, Osmotisk stress, Fenylalanin ammoniak-lyas

Cistanchetubulosahar många effekter, klicka här för att veta mer

Introduktion

Cistanche deserticolaYC Ma, en dyrbar kinesisk ört, parasiterar rötterna av Haloxylon ammodendrun och växer i ökenområden i västra Kina. Fenyletanoidglykosider (PeGs), de huvudsakliga bioaktiva komponenterna som isolerats från C. deserticola, har markanta aktiviteter för att avlägsna fria radikaler, förbättra immuniteten, förbättra sexuell funktion, etc. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). På grund av okontrollerad exploatering och utnyttjande avCistanche deserticola, naturresursen avCistanche deserticola var på gränsen till utmattning. Med tanke på dessa problem har PeGs-produktion av cellsuspensionskulturer av C. deserticola ansetts vara ett lovande alternativ för att lösa bristen påCistanche deserticolaväxtmaterial (Lu och Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

Osmotisk stress är en viktig faktor som påverkar växternas tillväxt, utveckling, morfogenes och bildandet av sekundära metaboliter. Förbättrad produktion av sekundära metaboliter från vävnadskulturer in vitro under optimal osmotisk stress har rapporterats i ett fåtal medicinalväxtarter (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). Sackaros är ett vanligt osmotiskt stressmedel som används i dessa fall och fungerar också som en viktig kol- och energikälla. Därför är det mycket svårt att skilja effekten av osmotisk stress och sockerarters näringsmässiga roll som kolkällor. En ökning av initial osmotisk stress med icke-metabolisk mannitol, sorbitol och PEG förbättrade också paklitaxel-ackumulering i Taxus Chinensis-cellkulturer, saponin- och polysackarid-ackumulering i Panax notoginseng-cellkulturer och eleutherosider-ackumulering i Eleutherococcus sessili et alflorus embryogenic kulturer (Kimhangic et al. et al. 2001; Shohael et al. 2006). Deras resultat visade att effekterna av kolhydratkoncentration och osmotisk stress var olika beroende på växtarter och sekundära metaboliter.

Syftet med den aktuella studien är fokuserat på de osmotiska effekterna av sackaros, mannitol, PEG och NaCl på celltillväxt och PeGs biosyntes iCistanche deserticolacellsuspensionskulturer. PAL-aktivitet i suspensionskulturerna undersöktes under olika kombinationer av initiala osmotiska medel, och den möjliga mekanismen för förbättrad PeGs-ackumulering genom att öka osmotisk stress diskuteras.

Material och metoder

Växtmaterial och kallusinduktion

Frön avCistanche deserticolaYC Ma samlades in från ökenområden i Xinjiang-provinsen i Kina och lagrades i 4C före användning. Botanisk identitet bekräftades genom jämförelse med referensstandarder vid Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, PR China. Frön ytsteriliserades genom doppning i 70 procent etanol i 30 s, nedsänktes sedan i en 20 procent vattenlösning av 5,4 procent natriumhypoklorit i vatten under 20 minuter, följt av tre sköljningar med sterilt destillerat vatten. Calli inducerades från ytsteriliserade frön avCistanche deserticolapå MS (Murashige och Skoog 1962) medium kompletterat med 1.0 mg l–1 naftalenättiksyra (NAA), 2.0 mg l–1 6-bensyladenin ({{7} }BA), 0.25 mg l–1 2, 4-diklorfenoxiättiksyra (2, 4-D), 6 gl–1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, produkt-ID: A181) och 30 gl-1 sackaros i 60 dagar i ett odlingsskåp i mörker vid 25C. Kalluskulturerna inducerade från fröexplantaten subodlades därefter till ovanstående fasta medium med ett intervall på 30 dagar (Cheng et al. 2005a).

Etablering och underhåll av cellsuspensionskulturer

Suspensionskalluskulturerna (3,0 g färskvikt) som filtrerades genom en 1,000 lm mask och kvarhölls på en 200 lm mesh sikt subodlades till en 500-ml Erlenmeyer kolv innehållande 100 ml av ovanstående flytande medium på en roterande skakapparat vid 110 rpm vid 25°C i mörker med ett subkulturintervall på 18 dagar. Mediets pH justerades till 5,8 med 1 M NaOH eller 1 M HCl före autoklavering. Suspensionscalluskulturerna subodlade efter tio gånger användes som inokulum för följande experimentella kolvkultur. Alla kolvexperiment utfördes i 250 ml Erlenmeyer-kolvar innehållande 50 ml flytande medium med 30 gl-1 sackaros och inokulerade med 1,5 g färskvikt av 18-daggamla cellsuspensionskulturer. Dessa Erlenmeyer-kolvar inkuberades på en roterande skakapparat (110 rpm) vid 25°C i mörker.

Osmotisk stressexperiment

För att undersöka effekten av initial sackaroskoncentration påcelltillväxt och PeGs-ackumulering,Cistanche deserticolasuspensionskulturer odlades i MS-medium med 87,6,175,3 och 262,9 mM sackaros. För osmotiska stresstillstånd,Cistanche deserticolasuspensionskulturer inkuberades i MSmedium innehållande 87,6 mM sackaros kombinerat med164,7 mM mannitol. Andra osmotiska ämnen (PEG 4,000 ochNaCl) tillsattes i ekvivalenten av osmolariteten av87,6 mM sackaros. De osmotiska ekvivalenta koncentrationernaav osmotiska medel bestämdes experimentellt som PEG4,000 av 20 mM respektive NaCl på 50 mM. Tredubbla kolvar användes i alla experiment och alla värdenvar medel för tredubbla kolvar ± SD.

Analys

Cistanche deserticolaodlade celler under olika osmotisk stress observerades med Nikon AFX-DX ljusmikroskop (Nikon, Japan) under 400· förstoringar. Odlingsmediets osmolaritet mättes med en ångtrycksosmometer (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). För bestämning av färskvikt (FW)Cistanche deserticolacellerna pressades försiktigt på filterpapper för att avlägsna överskottsvatten och vägdes. Därefter torkades cellerna i en ugn vid 60°C under 24 timmar och torrvikten (DW) registrerades. Den kvarvarande sockerkoncentrationen bestämdes med användning av fenol och koncentrerad svavelsyra, med användning av glukos som standard (Dubois et al. 1956).

PeGs extraherades från de torkade cellerna med metanol under 15 minuter vid 60C i ett ultraljudsvattenbad (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Kina) med en frekvens på 40 kHz och en effekt på 100 W. Filtratet koncentrerades och återstoden löstes i destillerat vatten och passerade sedan genom en makroretikulär hartskolonn (AB-8, kemisk produkt från Nankai University, Tianjin, Kina). Metanoleluatet uppsamlades och den totala PeGs-halten analyserades vid 333 nm genom att använda echinakosid som standard (Du och Liu 1993a; Du et al. 1993b).

Cellviabiliteten uppskattades genom reduktion av 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) (Steponkus och Lanphear 1967). Viabilitetsindexet definieras som absorbansen uppmätt per gram färsk vävnad. Bestämningen av PAL-aktivitet baserades på metoden enligt Koukol och Conn (1961). En enhet av PAL-aktiviteten (U) definieras som mängden absorbansvariation på 0.01.

resultat och diskussion

Effekt av initial sackaroskoncentration på celltillväxt och PeGs biosyntes i cellsuspensionskulturer avCistanche deserticola.Svaret frånCistanche deserticolacellsuspensionskulturer till initial sackaroskoncentration mellan 87,6 och 262,9 mM testades. Såsom visas i Fig. 1 växte cellerna och ackumulerade PeG snabbt vid en låg initial sackaroskoncentration på 87,6 mm, och celltillväxten och PeGs-ackumulering undertrycktes uppenbarligen vid en hög initial sackaroskoncentration på 262,9 mM. Förhållandet mellan färskvikt och torrvikt minskade när initial sackaroskoncentration ökade från 87,6 från 262,9 mM (data ej visade). Den maximala torrvikten på 15,9 gl–1 och en PeGs-halt på 20,7 mg g–1-DW erhölls på dag 30 vid en initial sackaroskoncentration på 175,3 mM varav osmolariteten var cirka 300 mOsm kg–1. Under mikroskopisk observation separerades cellväggar från sin cytoplasma vid den högsta osmotiska stressen på 388 mOsm kg–1 där en initial sackaroskoncentration var 262,9 mM (Fig. 2), och den högsta osmotiska stressen kan störa cellernas metabolism och resultera i allvarlig tillväxthämning och minskning av PeGs biosyntes. Ett liknande fenomen observerades också i suspensionskulturer av T. Chinensis suspensionscellkulturer, och den optimala sackaroskoncentrationen för paklitaxelproduktion var 175,3 mM (Kim et al. 2001). En initial sackaroskoncentration på 204,5 mM var emellertid fördelaktig för tillväxten av cellkulturer av E. sessiliflorus. En högre sackaroskoncentration på 262,9 mM förbättrade biosyntesen av eleutherosider, fenol och flavonoider i Eleutherococcus-kulturerna (Shohael et al. 2006). Det är tydligt att den initiala sackaroskoncentrationen är viktig för tillväxten och sekundära metaboliter ackumulering av växtcellkulturer och dess effekt är relaterad till en specifik cellinje.

Effekt av olika osmotiska medel på celltillväxt och PeGs biosyntes i cellsuspensionskulturer av C. deserticola

För att förstå den osmotiska rollen av metabolisk sackaros och andra icke-metaboliska kemiska substrat på PeGs biosyntes i cellsuspensionskulturer avCistanche deserticolaEn serie experiment utfördes med användning av sackaros kombinerat med de icke-metaboliska osmotiska medlen (mannitol, PEG och NaCl). I dessa experiment tillsattes 164,7 mM mannitol, 20 mM PEG och 50 mM NaCl till mediet innehållande 87,6 mM sackaros och gjorde den initiala osmolariteten runt 300 mOsm kg–1, vilket var ett ekvivalent osmotiskt tillstånd jämförbart med mediet med 175,3 mM sackaros.

Som visas i fig. 3a, b hämmade tillsatsen av mannitol (icke-metaboliskt sockerosmotiskt medel) och PEG (icke-permeabelt osmotiskt medel) celltillväxthastigheten något men förbättrade signifikant PeGs-biosyntesen iCistanche deserticolacellsuspensionskulturer. Det maximala PeGs-innehållet på 26,9 respektive 23,8 mg g–1-DW erhölls på dag 21 när cellerna odlades i kombinationerna av 87,6 mM sackaros med antingen 164,7 mM mannitol (303 mOsm kg–1) eller 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). PeGs-beloppen var högre än förCistanche deserticolacellkulturer odlade i MS flytande medium med en initial sackaroskoncentration på 175,3 mM på dag 30. Socker konsumerades gradvis under tidenCistanche deserticolacellodling, och sedan minskade den sockerinducerade osmotiska stressen i enlighet därmed (fig. 3c, d). Osmotisk stress av det flytande mediet med en initial sackaroskoncentration på 175,3 mM sjönk från 280 till 110 mOsm kg-1 när PeGs i cellkulturerna började ackumuleras på dag 9 och nådde sitt maximum på dag 30 (data visas inte). Icke-metaboliska osmotiska ämnen (mannitol och PEG) förbrukades inte under cellodlingen, vilket gjorde att osmotisk stress av flytande medium kunde bibehållas mellan 200 och 280 mOsm kg-1, ett osmotiskt tryck som är gynnsamt för PeGs biosyntes. Dessa resultat visade att osmotisk stress i sig spelade en viktig roll i förbättringen av PeGs biosyntes iCistanche deserticolacellkulturer.

Tillsats av NaCl rapporterades förbättra indolalkaloider respektive saponinbiosyntes i cellkulturer av Catharanthus roseus och Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), men behandlingen av NaCl undertryckte celltillväxten av T. Chinensis samtidigt som den inte visar någon skillnad i palitaxelbiosyntes (Kim et al. 2001). Därför är en detaljerad utredning nödvändig för varje fall. Tillsatsen av en osmotisk ekvivalent av 50 mM NaCl undertryckte celltillväxt och PeGs-biosyntes. Detta resultat kan bero på den permeabla naturen hos NaCl, vilket inte är fördelaktigt för cellkulturerna av denna ökenväxtart som kan tolerera torkastress mycket väl.

Fig. 3 Effekt av kombinationerna av sackaros och andra icke-metaboliska osmotiska ämnen på celltillväxt (a), PeGs-ackumulering (b), sockerkonsumtion (c) och osmotisk stressförändring (d) under loppet av C. deserticola-cellen kultur. Värden är medel för tredubbla kolvar ± SD

Effekt av olika osmotiska medel på cellviabilitet och PAL-aktivitet i cellsuspensionskulturer av Cistanche deserticola

I våra tidigare studier (Cheng et al. 2005b, 2006) stimulerade elicitortillägg dramatiskt PeGs biosyntes iCistanche deserticolacellkulturer, och stimuleringen var korrelerad med ökad aktivitet av PAL, det första nyckelenzymet i PeGs biosyntes (Hahlbrock och Grisebach 1979). Som visas i fig. 4 minskade tillsatsen av icke-metabolisk 164,7 mM mannitol eller 20 mM PEG till MS flytande medium innehållande 87,6 mM sackaros cellviabiliteten något, men förbättrade signifikant PAL-aktiviteten som var högre än den som inducerades av en initial sackaroskoncentration av 175,3 mM. Den förbättrade PeG-ackumuleringen iCistanche deserticolacellsuspensionskulturer var relaterade till ökningen av PAL-aktivitet stimulerad av själva osmotisk stress. En initial sackaroskoncentration på 175,3 mM i MS flytande medium orsakade en minskning av cellviabiliteten på 15 dagar och hämmade PAL-aktivitet på 21 dagar. Efter en period av sockerkonsumtion av den växandeCistanche deserticolacellkulturer, både cellviabilitet och PAL-aktivitet hos de odlade cellerna ökade och nådde sitt maxima på dag 24 respektive dag 30. Förbättrad PAL-aktivitet genom osmotisk stress observerades också förbättra saponinbiosyntesen i P. ginseng-cellkulturer och alkaloidackumulering i C. roseus-odlade celler (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Tillsatsen av permeabel NaCl till MS flytande medium innehållande 87,6 mM sackaros minskade emellertid cellviabiliteten och hämmade PAL-aktiviteten under hela odlingsperioden. Som ett resultat undertrycktes både celltillväxt och PeGs biosyntes uppenbarligen.

Fig. 4 Variation av cellviabilitet (a) och PAL-aktivitet (b) i C. deserticola cellkulturer under olika osmotisk stress under loppet avCistanche deserticolacell kultur. Värden är medel för tredubbla kolvar ± SD

Cistanche deserticolaär en ökenart och undersökning av en ökenart in vitro cellkulturer gav nya utmaningar och möjligheter för att förstå växtfysiologi och ekologiska anpassningar. I denna studie utvecklade vi ett system med potential att studera en osmotisk stressmedierad signaltransduktionsbiosyntesväg, och systemet gav grunden för storskalig produktion av PeGs med hjälp avCistanche deserticolacellkulturer genom en ny osmotisk stressreglerad strategi.

Erkännanden

Författarna erkänner det ekonomiska stödet från den kinesiska vetenskapsakademins innovationsforskningsprogram.

Från: 'Förbättring av biosyntesen av fenyletanoidglykosider i cellkulturer av Cistanche deserticola genom osmotisk stress' av Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Referenser

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolacellsuspensionskulturer: Fenyletanoidglykosiderbiosyntes och antioxidantaktivitet. Process Biochem 40:3119-3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Upprepad framkallning ökar ackumuleringen av fenyletanoidglykosider i cellsuspensionskulturer avCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Förbättring av biosyntesen av fenyletanoidglykosider i Cistanche deserticola cellsuspensionskulturer av kitosan elicitor. J Biotech 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Bestämning av fenyletanoidglykosider iCistanche deserticolagenom makroretikulär hartsspektrofotometri. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Isolering och identifiering av fenyletanoidglykosider frånCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Kolorimetriska metoder för bestämning av socker och relaterade ämnen. Anal Chem 28:350-357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Exponeringen för transkanelsyra av osmotiskt stressade Catharanthus roseus-celler odlade i en 14-l bioreaktor ökar alkaloidackumuleringen. Biotechnol Lett 22:921–925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Enzymiska kontroller i biosyntesen av ligin och flavonoider. Ann Rev Plant Physiol 30:105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Effekt av osmotiskt tryck på paklitaxelproduktion i suspensionscellkulturer av Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Metabolismen av aromatiska och egenskaperna hos fenylalanindeaminaset från Hordeum vulgare. J Biol Chem 236:2692-2698
Lu MC (1998) Studier om den lugnande effekten avCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161–165

Lu CT, Mei XG (2003) Förbättring av produktion av fenyletanoidglykosider av en svampframkallare i cellsuspensionskultur avCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Ett reviderat medium för snabb tillväxt och bioanalyser med tobaksvävnadskulturer. Plant Physiol 15:473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Effekten av sällsynta jordartsmetaller på tillväxten avCistanche deserticolaceller och produktionen av fenyletanoidglykosider. J Biotechnol 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Förbättring av eleutherosideproduktion i embryogena kulturer av Eleutherococcus sessiliflorus som svar på sackarosinducerad osmotisk stress. Process Biochem 41:512-518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Användningen av organiska och oorganiska föreningar för att öka ackumuleringen av indolalkaloider i Catharanthus roseus (L.) Don cellsuspensionskulturer. J Exp Bot 38:1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Förfining av trifenyltetrazoliumkloridmetoden för att bestämma köldskada. Plant Physiol 42:1423–1426 Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Betydande förbättring av taxanproduktion i suspensionskulturer av Taxus Chinensis genom sackarosmatningsstrategi. Process Biochem 35:479-483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Rengörande effekt av glykosider avCistanche deserticolaom fria radikaler och dess skydd mot OH-inducerad DNA-skada in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Förbättring av saponinproduktion i Panax ginseng cellkultur genom osmotisk stress och näringstillförsel. Enzyme Microb Technol 36:133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Effekt av osmotiskt tryck på celltillväxt och produktion av ginsengsaponin och polysackarid i suspensionskulturer av Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Jämförelser mellanCistanche deserticolaYC Ma och Cistanche tubulosa (Scheak) har några farmakologiska aktiviteter. Tradit Chin Med J 21:436–438