Förstärkning av de anti-angiogena effekterna av delfinidin när det är inkapslat i små extracellulära vesiklar del 1
Mar 15, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Abstrakt:(1)Bakgrund: Antocyanin delfinidin uppvisar anti-angiogena egenskaper både i in vitro och in vivo angiogenesmodeller. Emellertid absorberas delfinidin in vivo dåligt, så dess blygsamma biotillgänglighet och stabilitet minskar dess anti-angiogena effekter. Föreliggande arbete drar fördel av små extracellulära vesikelegenskaper (EV) för att förbättra både stabiliteten och effektiviteten av delfinidin. När delfinidin är inkapslat i sEVs, hämmar delfinidin de olika stadierna av angiogenes på humana aorta-endotelceller (HAoECs).(2) Metoder: sEVs från omogna dendritiska celler producerades och laddades med delfinidin. En metod baserad på UHPLC-HRMS implementerades för att bedöma delfinidinmetaboliter inom sEVs. Proliferationsanalys, kväveoxid(NO)produktion och Matrigel-analys utvärderades i HAoECs.(3)Resultat: Delfinidin, 3-O- -rutinosid och Peonidin-3-galaktosid hittades båda i delfinidin och delfinidin-laddade sEVs.sEV-laddade delfinidin ökade styrkan av fritt delfinidin 2-faldigt för endotelproliferation, 10-faldigt för endotelial NO-produktion och 100-faldigt för kapillärliknande bildning . Således utövar sEV-laddat delfinidin effekter på de olika stegen av angiogenes. (4) Slutsatser: sEVs kan betraktas som ett lovande tillvägagångssätt för att leverera delfinidin för att rikta in sig på angiogenesrelaterade sjukdomar, inklusive cancer och patologier associerade med överdriven vaskularisering.
Nyckelorddelfinidin; endotelceller; angiogenes; små extracellulära vesiklar; cancer; hjärt-kärlsjukdomar
1. Introduktion
Polyfenoler finns främst i vegetabiliska livsmedel och drycker och ger smak och färg på vegetabiliska livsmedel. Dessutom har epidemiologiska studier rapporterat en större minskning av kardiovaskulär risk och cancer i samband med dieter rik på polyfenoler [1-3.
Delfinidin (2-(3,4,5-tri-hydroxifenyl)kromenylium-3,5,7-triol) är en antocyanin som rikligt identifieras i pigmenterade grönsaker och frukter, särskilt bär och röda druvor. Vi har tidigare rapporterat att delfinidin har samma farmakologiska profil som ett totalt extrakt av rödvinspolyfenolföreningar för att främja ökningen av intracellulär kalciumkoncentration och aktivering av tyrosinkinaser [3], vilket leder till produktion av endotel kväveoxid (NO) efter östrogenreceptorn alfa (ERo)stimulering [4]. Dessutom rapporterade vi att delfinidin via ERo fungerar som en immunmodulerande och antiinflammatorisk molekyl som kan förändra T-lymfocytproliferation och differentiering hos patienter med kardiovaskulära riskfaktorer [5].
Slutligen visade vi att delfinidin uppvisar anti-angiogena egenskaper, både i in vitro och in vivo angiogenesmodeller, och minskar in vivo tumörtillväxt av melanom [6-10]. Faktum är att delfinidin hämmar endotelcellsproliferation genom involvering av cyklin D 1- och A-beroende vägar [6,7]. Vi rapporterade också ett möjligt samband mellan hämning av VEGF-inducerad mitokondriell biogenes genom Akt-vägen av delfinidin och dess anti-angiogena effekt [8]. Dessutom minskar delfinidin tumörtillväxt av melanomtumörceller in vivo genom att verka specifikt på endotelcellsproliferation. Mekanismen antyder ett samband mellan hämning av VEGF-inducerad proliferation via VEGFR2-signalering, MAPK, PI3K och på transkriptionsnivå på CREB/ATF1-faktorer, och hämningen av fosfodiesteras2[9]. Mest intressant, höga doser av delfinidin minskade neovaskularisering i en in vivo-modell av angiogenes utlöst av ischemi med användning av en råttmodell av femoral artärligatur [10]. Tillsammans visar dessa data att delfinidin är en lovande förening för att förhindra patologier associerade med kardiovaskulära störningar och tumörbildning.
Delfinidin är dock mindre potent för att inducera dessa fördelaktiga effekter jämfört med totala rödvinspolyfenolextrakt, särskilt för att inducera endotelberoende NO-medierad vasodilatation [11]. Delfinidin är faktiskt ljuskänsligt och stabilt endast vid pH<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">
En strategi för att övervinna sådana problem är användningen av extracellulära vesiklar (EVs) som ett läkemedelsavgivningssystem. Vi fann nyligen att elbilar, inklusive stora och små elbilar (sEV), är nanostrukturer som kommer från olika subcellulära fackegenskaper, och övervinner begränsningarna hos klassiska nanoformuleringar. sEVs minskar instabilitet och immunogenicitet, förbättrar biotillgänglighet och målselektivitet [13]. Vissa rapporter understryker de skyddande effekterna av elbilar som frigörs av celler behandlade med polyfenoler. Faktum är att sEVs berikade med miR-21 från celler behandlade med curcumin minskade tumörcelltillväxt och angiogenes, korrigerade endotelpermeabilitet och minskade cellviabiliteten för olika cancercellinjer [14]. Dessutom undertryckte miR -16- sEV från celler behandlade med epigallocatechin gallat tumörtillväxt [15].
Cistanche kan förbättra immuniteten
I den aktuella studien utnyttjade vi sEV-egenskaper för att förbättra både stabiliteten och effektiviteten av delphinidin.sEV-laddad delfinidininducerad angiogeneshämning med användning av humana aorta-endotelceller (HAoECs). Delfinidinhalt i termer av metaboliter inom dessa elbilar bestämdes också.
2. Material och metoder
2.1.Cellkultur
HAoECs (Promocell, Heidelberg, Tyskland) odlades vid 37 grader och 5 procent CO2 i endotelcelltillväxtmedium MV2 (Promocell) kompletterat med 1 procent penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankrike). Celler trypsiniserades vid 70/80 procent sammanflöde och användes mellan passagerna 3 och 6 för alla experiment.
Dendritiska cellinjen JAWS II köptes från American Type Culture Collection (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, USA). JAWS II-celler odlades vid 37 grader och 5 procent CO, i ett komplett odlingsmedium bestående av alfaminimum essentiellt medium (Lonza; Basel, Schweiz) innehållande ribonukleosider och deoxiribonukleosider och kompletterat med 20 procent fetalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies; Grand Island, NY, USA), 4 mM L-glutamin (Lonza), 1 mM natriumpyruvat (Lonza), 1 procent penicillin/streptomycin (penicillin/-streptomycin, Sigma-Aldrich) och 5 ng/ml murin GM-CSF (Miltenyi Biotec; San Diego, CA, USA). Celler trypsiniserades vid 70/80 procent sammanflöde och användes mellan passagerna 8 och 16 för alla experiment.
2.2.sEVIsolation
JAWS II-celler såddes med en täthet av 5×10 graders celler i en T175-cellodlingskolv i ett komplett odlingsmedium, och de har svalt i FBS innan någon isolering. Cellmedium centrifugerades vid 300 × g och 2 000 × g under 10 minuter för att avlägsna celler respektive cellrester. Den resulterande supernatanten centrifugerades vid 20,000× g i 30 minuter för att utesluta stora elbilar. Supernatanten centrifugerades vid 200,000×g (Optima MAX-XP ultracentrifug och MLA-50-rotor, Beckman Coulter, Villepinte, Frankrike) under 2 timmar för att pelletisera sEV. Sedan tvättades sEVs i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41,8 mM, pH =7.4) och återcentrifugerades vid 200 000 xg i 2 timmar. Slutligen återsuspenderades sEV-pellets i 1 ml PBS och lagrades vid 4 grader tills efterföljande användning. Mängden sEVs bestämdes med användning av metoden enligt Lowry, med bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich) som standard. sEVs användes vid 10 ug/ml.
2.3. Delphinidin Laddar
Delphinidin framställdes i vatten vid pH {{0}} med {{10}},1 procent DMSO för att nå koncentrationen 10 ug/ml. sEVs tillsattes (2 mg) och lösningen omrördes och vortexade sedan i 10 minuter. Efter 2 timmars ultracentrifugering vid 200,000×g, rekonstituerades den erhållna pelleten i 1 ml 0,1 procent DMSO eller PBS. Delfinidinabsorbans mättes vid 530 nm, och en standardkurva med olika koncentrationer (0,1 till 10 ug/ml) av fritt delfinidin utfördes. Procentandelen av effektiviteten av laddningen av sEVs var 9 procent, oberoende av koncentrationen av delfinidin som användes (data visas inte). Således justerades mängden delfinidin för att erhålla den önskade koncentrationen (0,1 till 5 ug/ml) inom 10 ug/ml sEVs. För att avlägsna fritt delfinidin tvättades dessa vesiklar två gånger.
2.4. Nanopartikelspårningsanalys (NTA)
sEV-prover späddes i steril NaCl0,9 procent, och storleksfördelningen analyserades med hjälp av NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Storbritannien). Videor spelades in. NTA-mjukvaran bestämde storleksfördelningen med Stokes-Ensteins ekvation.
2.5. Transmission elektronisk mikroskopi
sEV fixerades först över natten vid 4 grader med 2,5 procent glutaraldehyd (LFG Distribution, Lyon, Frankrike) i 0,1 M PBS. Sedan tvättades sEVs två gånger i PBS med 100,000×g centrifugering i 70 min. sEVs avsattes på koppargaller i 2 minuter och färgades negativt med 20 μL uranylacetat 5 procent (utspädd i etanol 50 procent) ） i 30 s. Galler observerades sedan med ett Jeol JEM 1400-mikroskop (Jeol, Croissy sur Seine, Frankrike) arbetat vid 120 keV.
2.6. Bestämning av delfinidinmetaboliter inom sEVs
Provberedningen var enligt följande: 250 μL metanol (MeOH) tillsattes till 10 ug sEVs rekonstituerade i PBS, och prover utsattes för en 20 minuters ultraljudsbehandling. Tvåhundra uL MeOH tillsattes ytterligare och prover centrifugerades (10,000× g, 10 min,4 grader) och indunstades i en miVac duo-koncentrator (Genevac Ltd., Ipswich, Storbritannien). Det torra extraktet rekonstituerades med 200 μL vatten av LC-MS-kvalitet innehållande 1 procent myrsyra. Blandningen utsattes för andra centrifugering (10,000× g, 5 min, 4 grader) före ultrahögpresterande vätskekromatografi kopplad till högupplöst masspektrometri (UHPLC-HRMS) analys för att analysera delfinidinmetaboliter med noggranna massmätningar.
Den kromatografiska separationen uppnåddes med en Kinetex@ 1,7 μm XB C18,150×2,1 mm-kolonn tillsammans med motsvarande SecurityGard C18-kolonn (Phenomenex). Mobila faser bestod av H2O i kanal A och acetonitril i kanal B, båda innehållande 0,1 procent myrsyra. Elueringsgradienten (A∶B, o/ø) var som följer∶ håll initialvillkoren 95:5 i 2 minuter, följt av en linjär gradient från 95:5 till 0:100 över en 6 min period, håll vid 0:100 i 3 min, återgå till initiala förhållanden 95:5 och håll dessa förhållanden i 3,5 min. En konstant flödeshastighet av 0,300 ml/min användes; injektionsvolymen var 10 μL.
Full scan och riktade SIM-masspektra förvärvades i positivt joniseringsläge, med upplösning 70,000 Full Width at Half Maximum (FWHM) med automatisk förstärkningskontroll (AGC) mål på 3 × 10 graders joner och en maximal joninjektion tid (IT) på 200 ms. Databeroende MS/MS-experiment förvärvades i 'Top5:s databeroende läge.
Metaboliter som rapporterats i litteraturen [16-18] övervakades: Delfinidin, aldehyd, floroglucinol aldehyd, gallussyra, chalcone, petunidin-3-galaktosid, petunidin-3-arabinosid, petunidin {{4} }O-rutinosid, delfinidin-3-arabinosid, delfinidin-3-galaktosid, delfinidin 3-O-(6-kumaroylglukosid),delfinidin 3-O- - rutinosid, cyanidin-3-galaktosid, cyanidin3-O- -rutinosid, peonidin-3-galaktosid och malvidin-3-galaktosid.
Daglig instrumentkalibrering utfördes genom infusion av Pierce LTO Velos ESI positiva/negativa kalibreringssatser som rekommenderas av tillverkaren. Xcalibur 2.2-programvara (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) användes för datainsamling, och programvaran TraceFinder 3.0 (Thermo Fisher Scientific) användes för databehandling.
2.7. Cellviabilitetsanalys
1 × 104 HAoECs såddes på en 96-brunnsplatta och odlades i 24 timmar och behandlades med delfinidin (1 till 10 ug/mL). Sedan, 5 ug/mL 3-(4,5-dime-tyltiazol-2-yl)-5-(3-karboximetoxifenyl)-2-({ {15}}sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS-reagens, Promega, WI, USA) tillsattes i varje brunn och inkuberades vid 37 grader i 120 minuter. Absorbansen mättes på en CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, Tyskland) spektrofotometer vid 490 nm.
2.8. Proliferationsanalys
Proliferationsanalyser utfördes med användning av CyQUANT Cell proliferation Assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens rekommendationer. Kortfattat såddes 1,5 × 10* celler i en 96-brunnsplatta. Celler svaltades i serum i 2 timmar och behandlades sedan med delfinidin, naturliga sEVs eller sEVs laddade med delfinidin i olika koncentrationer. Efter 24 timmars inkubation tvättades cellerna med PBS och en färgbindande lösning tillsattes. Celler inkuberades vid 37 grader i 30 minuter. En fluorescerande mikroplattläsare (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenberg, Tyskland) med filter för 485 nm excitation och 530 nm emission användes för fluorescensmätning.
2.9.NO Production Assaty
HAoECs såddes på ett 8-brunnsglas (Ibidi, Gräfelfing, Tyskland) med en hastighet av 3×104 celler per brunn (dvs. 3×104 celler/cm²) i 300 μL av mediet. Vid 70-80 procent konfluens stimulerades celler under 24 timmar med delfinidin, naturliga sEVs eller sEV-laddade delfinidin. Adenosintrifosfat (ATP) användes som en positiv kontroll (10 μM, Sigma-Aldrich) för att stimulera produktionen av NO. Efter 24 timmar avlägsnades mediet från varje brunn och diaminofluoresceindiacetat (DAF-2 DA)-proben tillsattes (5 μM under 30 minuter, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Därefter tvättades brunnarna med PBS. Celler fixerades med paraformaldehyd (4 procent, 20 min). Fluorescens avlästes med konfokalmikroskopi (Zeiss, Jena, Tyskland, LSM700). Fyra bilder förvärvades och ImageJ-mjukvaran användes för kvantifiering.
2.10. Matrigelanalys
HAoECs såddes i brunnar belagda med Matrigel (gel av extracellulär matris av murint sarkom från Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich). Kortfattat placerades 10 μL flytande Matrigel i varje brunn i en 15-brunn Ibidi μ- skjut angiogenesplattan (lbidi) och inkuberades sedan i 45 minuter vid 37 grader för att bilda en gel. HAoECs såddes sedan och inkuberades vid 37 grader och 5 procent CO, i 45 minuter före behandlingar med antingen delfinidin, naturliga sEVs eller sEV-laddade delfinidin Bildandet av "kapillärliknande strukturer" observerades med ett optiskt mikroskop (Olympus CK40) Kvantifiering utfördes genom att mäta antalet kapillärliknande strukturer med användning av Bildprogramvara.
2.11.Statistisk analys
Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM. Betydelsen av skillnaderna mellan grupperna bestämdes genom variansanalys (ANOVA), följt av Tukeys multipla jämförelsetest. p-värden på<0.05 were="" considered="">
3. Resultat
3.1.sEV Karakterisering och laddning av Delphinidin
I överensstämmelse med litteraturen inducerade delfinidin laddat i sEVs inte förändringar i storleken på vesiklarna, eftersom de var 118,7± 2,9 och 111,7 ± 1,8 nm för tomma sEVs respektive delfinidinladdade sEVs, vilket bestämts med nanopartikelspårningsanalys (figur 1A) och bekräftades genom elektronmikroskopanalys (Figur 1B). Dessutom uttryckte båda typerna av sEVs, naturliga och de laddade med delfinidin, exosomala markörer som ALIX, CD63 och TSG101 på liknande nivåer (Figur 1C), medan de inte uttryckte ß-aktin, en markör för stora EV.
Figur 1. Karakterisering av sEVs.(A) Storleksfördelningar av infödda sEVs och sEVs laddade med delfinidin baserat på NTA-mätningar. (B) Representativ överföringselektronmikroskopibild av infödda sEVs och sEVs laddade med delfinidin. Skalstapel=100 nm.(C) Western Blot-analys som visar uttrycket av Alix, CD63, TSG101 och ß-Actin i sEVs och sEVs laddade med delfinidin.
Den här artikeln är extraherad från Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378
