Förstärkning av de anti-angiogena effekterna av delfinidin när det är inkapslat i små extracellulära vesiklar del 2
Mar 16, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
3.2. Delphinidin Metaboliter inom sEVs
Förutom delfinidin (Figur 2A), peonidin-3-galaktosid(Retentionstid=11.11 min, [M]' m/z=463.12404)(Figur 2B) ochdelfinidin3-O- -rutinosid (retentionstid=12.34 min, [M] m/z=611.16121)(Figur 2C) upptäcktes under dessa experimentella förhållanden i sEVs . Spår av dessa metaboliter upptäcktes också i standardlösningen av delfinidin. Analysen baserades på den exakta massan, även om en autentisk standardlösning är nödvändig för att bekräfta denna observation.
3.3. Effekter av Delphinidin och sEV-laddat Delphinidin på HAoEC-proliferation
Delfinidin ensamt eller laddat i sEVs modifierade inte livsdugligheten för HAoECs under 24 timmar vid koncentrationer på 1 till 10 ug/ml (Figur 3A).
VEGF (20 ng/ml), använd som en positiv kontroll, ökade icke-signifikant endotelcellsproliferation (Figur 3B). Native sEVs (10 ug/ml) hade ingen effekt. Delphinidin hämmade endotelcellsproliferation på ett koncentrationsberoende sätt, med en maximal effekt nådd vid 10 ug/ml (Figur 3B). På samma sätt inducerade sEV-laddat delfinidin en koncentrationsberoende hämning avendotelialcellproliferation. Intressant nog erhölls den maximala hämningen vid en koncentration av 5 ug/ml av sEV-laddat delfinidin, en koncentration två gånger lägre än den för enbart delfinidin. Dessa resultat tyder på att sEV-laddat delfinidin var två gånger mer potent ändelfinidinensam.
3.4. Effekter av Delphinidin och sEV-laddat Delphinidin på NO-produktion
Som visas i figur 4 inducerade ATP（10μM） en ökning av DAF-2fluorescensillustrerar NO-produktion i endotelceller. Native sEVs påverkade inte NO-nivån. Delfinidin enbart ökade NO-produktionen på ett koncentrationsberoende sätt, med maximal effekt på 10 ug/ml. Delphinidin-laddade sEVs framkallade också en koncentrationsberoende ökning av endotelial NO-produktion. Intressant nog erhölls den maximala effekten av sEV-laddat delfinidin vid 1 ug/ml, medan den fria delfinidinen nådde denna effekt vid 10 ug/ml. Sålunda var sEV-laddat delfinidin 10 gånger mer potent än delfinidin enbart för att öka NO-produktionen.
3.5. Effekter av Delphinidin och sEV-laddat Delphinidin på angiogenes
HAoECs omstrukturerades och bildade kapillärliknande strukturer (Figur 5A,B). Native sEVs hade ingen effekt på bildandet av kapillärliknande strukturer. Som tidigare beskrivits [6] reducerade delfinidin enbart antalet förgreningar av kapillärliknande strukturer på ett koncentrationsberoende sätt, varvid den maximala effekten nåddes vid 1 0 ug/ml med en 40-procentig minskning. Intressant nog utövade delfinidinladdade sEVs en potent minskning av antalet kapillärförgreningar. Delfinidin vid 0,1 ug/ml laddat i sEVs minskade redan antalet förgreningar med 60 procent, och denna effekt var större än den som erhölls med enbart 10 ug/mL delfinidin. Således var sEV-laddat delfinidin mer än 100 gånger mer potent i att hämma angiogenes än delfinidin enbart.
Figur 5. In vitro angiogenesanalys. (A) Representativa faskontrastmikrofotografier av tubulära strukturer i odlad HAoEC exponerade i 24 timmar för delfinidin eller sEVs laddade med delfinidin i olika koncentrationer. Förstoring: 40×. Fyra områden från varje brunn analyserades. (B) Stapeldiagrammet illustrerade den signifikanta minskningen av andelen förgreningspunkter efter behandling jämfört med PBS-behandlad (kontroll). Data visas som medelvärde ±SEM för sex oberoende experiment i jämförelse med kontroll: a: p<0.0001><0.0001 vs.del=""><0.0001 vs.="" del=""><0.001 vs.=""><><0.05vs.del5;g:><0.05 vs.sev=""><0.001 vs.sevdel0.5="" and=""><0.0001 vs.sevdel="">
4. Diskussion
Den aktuella studien visar att delfinidinen laddad i sEVs uppenbarligen var mer potent än fritt delfinidin när det gäller dess förmåga att frigöra endotelial NO, hämma endotelproliferation och minska kapillärliknande strukturer. Förutom delfinidin som hittats i sEVs, visade analysen av delfinidinmetaboliter inom sEVs närvaron av två metaboliter (dvs.delfinidin3-O--rutinosid och peonidin-3-galaktosid) som finns i delfinidinprover. Således bröts delfinidin ned till samma metaboliter i sin fria form eller när det laddades in i sEVs; emellertid var dessa mer potenta när det gäller att verka på endotelceller. När det var inkapslat i sEVs var delfinidin (används som en generisk term och omfattar naturliga metaboliter delfinidin 3-O-ß-rutinosid och peonidin-3-galaktosid) 2-faldigt, {{8} }}vikt och 100-vikt mer potent än fritt delfinidin när det gäller endotelproliferation, endotelial NO-produktion och kapillärliknande bildning. Således utövar sEV-laddat delfinidin effekter på olika steg som leder till angiogenes. Dessa resultat indikerar att sEVs kan betraktas som en lovande leverans av delfinidin som ett innovativt tillvägagångssätt för att rikta sjukdomar associerade med ökad angiogenes, inklusive cancer, ateroskleros och diabetiska retinopatier.
Cistanche kan förbättra immuniteten
Inkapslingen av polyfenoler för att skydda dem från nedbrytning är ett naturligt fenomen. Det har faktiskt visat sig att växter rika på polyfenoler producerar elbilar som bär dessa molekyler. Till exempel finns flavonoidglykosiden naringin och dess metabolit, naringenin, i grapefrukthärledda elbilar [12]. Dessutom kan nanopartiklar härrörande från växter användas som vektorer för andra molekyler av intresse. Det har faktiskt rapporterats att grapefrukthärledda nanopartiklar laddade med en STAT3-hämmare inaktiverar STAT3 i GL26-tumörceller och förbättrar överlevnaden för möss [19]. En annan strategi för inkapsling av polyfenoler är att använda vesiklar härledda från däggdjursceller. En färsk rapport utvärderade den exosomala formuleringen av antocyanidiner mot olika typer av cancer [19]. sEVs skördade från rå mjölk från nötkreatur laddad med en blandning av cyanidin, delfinidin, petunidin, peonidin och malvidin ökar den antiproliferativa aktiviteten av antocyanidiner mot sex olika typer av cancerceller via hämning av TNFo-inducerad aktivering av NF-kB [20] . Faktum är att effekterna av sEV laddade med antocyanidiner är mer effektiva än de som erhålls av fria antocyanidiner. Denna metod har fördelar; men det är fortfarande riskabelt. Faktum är att användningen av EV från däggdjursceller kan orsaka immunreaktioner. sEVs härrörande från omogna mänskliga dendritiska celler inducerade inte någon toxicitet, och den omogna naturen hos dendritiska celler inducerade låg immunogenicitet [21,22]. Såvitt vi vet är detta första gången som en laddningseffektivitet för delfinidin inom JAWS ⅡI sEVs har beskrivits. Laddning av delfinidin i sEVs (9 procent) skyddar och begränsar troligen dess nedbrytning till metaboliter under de experimentella förhållanden som används. De involverade mekanismerna kräver ytterligare studier. Metaboliterna som finns i sEVs, såsom delfinidin 3-O- -rutinosid eller peonidin-3-galaktosid, finns också i in vivo-experiment med delfinidin 14,15]. Tidigare arbeten har rapporterat att nedbrytningsprodukter av delfinidin har potenta biologiska aktiviteter, inklusive anti-cancer och antiinflammatoriska aktiviteter [20]. Bland fenolsyror bildas gallussyra mestadels genom nedbrytning av delfinidin i odlingsmedier [23]. I den aktuella studien fann vi att metaboliter som upptäckts i sEV-laddat delfinidin var identiska med de som upptäckts från fritt delfinidin [18]. Även om den exakta andelen metaboliter inkapslade i dessa sEVs inte bestämdes, var de mer effektiva på målceller än enbart metaboliter. Således var delfinidin och dess metaboliter troligen mer stabila och skyddade från nedbrytning.
Vi har tidigare rapporterat att delfinidin i bovina aorta-endotelceller stimulerar NO-frisättning genom att öka intracellulär Ca2 plus-koncentrationer via ökningen av superoxidanjonbildning. Detta var associerat med ökad tyrosinfosforylering av flera intracellulära proteiner, vilket resulterade i endotelberoende vasodilatation [24,25]. Delfinidin interagerar direkt med aktivatorstället för ER, vilket leder till aktivering av endotelial NO-syntas, NO-produktion och endotelberoende vasorelaxation 4]I föreliggande studie var sEV-laddat delfinidin 10 gånger mer potent än fritt delfinidin; sålunda skulle det förmodligen vara mer effektivt för att korrigera NO-endoteldysfunktionen associerad med kardiovaskulära sjukdomar, inklusive hypertoni, stroke eller metabola sjukdomar [3].
Vi har tidigare rapporterat att uppreglering av NO-vägen inte är ansvarig för den antiproliferativa effekten av delfinidin. Delfinidin hämmar faktiskt endotelcellsproliferation genom aktivering av ERK{{0}}/-2-vägen, vilket leder till cellcykelstopp och ackumulering av celler i G0/G1-fasen via nedreglering av cyklin A och D1 uttryck och en uppreglering av p27kip1 [6,7]. Vi fann också att delfinidin minskar tumörtillväxt av melanomceller in vivo genom att agera specifikt på endotelcellsproliferation via hämning av VEGFR2-signalering, MAPK, PI3K och på transkriptionsnivå på CREB/ATF1-faktorer och hämning av fosfodiesteras 2 [9]. I den föreliggande studien var delfinidinladdade sEV: er två gånger mer potenta än fritt delfinidin för att hämma endotelproliferation. Således indikerar dessa resultat att delfinidin-laddade sEVs är ett lovande tillvägagångssätt för att förebygga patologier associerade med överskott av endotelproliferation och därför generering av det vaskulära nätverket såsom plackutveckling och stabilitet vid ateroskleros och tumörutveckling i cancer.
I enlighet med dessa fynd visar vi att delfinidin minskar kapillärliknande bildning i en experimentell modell för angiogenes. Intressant nog, när det inkapslades i sEVs (även vid laddning så låg som 9 procent), var delfinidin 100-faldigt mer potent än fritt delfinidin i minskande kapillärliknande bildning.
Begränsning av studien: Den anti-angiogena potential som uppvisas av många naturliga föreningar som finns i många medelhavskostbeståndsdelar, inklusive delfinidin, gör detta kostmönster särskilt intressant som en källa till kemopreventiva medel, definierade inom angiopreventionsstrategin. Detta har nyligen granskats av Martinez-Podeva et al. [26]. Delphinidin verkar vara lika potent som andra flavonoider för att inducera anti-angiogena egenskaper. Även om det finns rikligt i kosten, absorberas antocyaniner i allmänhet, och delfinidin i synnerhet, dåligt. En konsekvens av den dåliga biotillgängligheten av antocyaniner är att många effekter som observerats in vitro (t.ex. hämning av COX-2) sannolikt inte kommer att inträffa in vivo, vilket inte är fallet för delfinidin, baserat på våra tidigare studier [{{ 5}}]. Ytterligare studier som använder delfinidin inkapslad i sEV behövs dock för att bekräfta ökningen av de anti-angiogena egenskaperna hos detta tillvägagångssätt in vivo.
Sammanfattningsvis ökade sEV-laddat delfinidin effektiviteten av delfinidin 100-faldigt för proliferation, 10-faldigt för NO och 2-faldigt för kapillärliknande bildning. Således skyddade sEVs antingen delfinidin och dess metaboliter från nedbrytning, eller några oidentifierade delfinidinmetaboliter som fanns i sEVs var mer potenta. Den differentiella styrkan som erhålls för proliferation, NO-produktion och angiogenes stöder hypotesen att delfinidinbelastade elbilar utövar effekter på olika steg som leder till angiogenes. Ändå ger vi bevis på att vi optimerade delfinidins effektivitet, troligen genom att minska dess nedbrytning och öka leveransen när den var inkapslad i elbilar. Således representerar delfinidin-laddade sEVs ett kraftfullt leveranssystem för att minska angiogenes i endotelceller, utan oönskade biverkningar, med kännedom om den låga biotillgängligheten av denna förening. Vi understryker en innovativ terapeutisk strategi baserad på biokonstruerade elbilar som vektorer för delfinidin för att hjälpa till att öka dess potentiella hälsofördel för att rikta in sig på angiogenesrelaterade sjukdomar, inklusive cancer, som så småningom kan utvidgas till ytterligare sjukdomar med överdriven vaskularisering.
Den här artikeln är extraherad från Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378 https://www.mdpi.com/journal/nutrients
