Förbättra top-down proteomik i hjärnvävnad med FAIMS del 4

Vi identifierade också ett flertal fragment härledda från icke-kanoniska splitsningsisoformer av tauprotein som är kända för att uttryckas i den mänskliga hjärnan.83 Kortfattat definieras tau-isoformer av antalet N-terminala insättningar på grund av alternativ splitsning av exon 2 och/eller 3 (refereras till till as0N, 1N och 2N) och antalet mikrotubulibindande upprepningar på grund av alternativ splitsning av exon 10 (refererad till som 3R eller 4R).84

Tau-protein är ett viktigt protein i neuronala celler, som spelar en mycket viktig roll för att upprätthålla den normala strukturen och funktionen hos neuronala celler. Studier har visat att tau-protein är nära besläktat med minne, och dess onormala uttryck kan leda till kognitiv försämring och till och med kognitiv försämring.

Forskare har gjort mycket forskning om förhållandet mellan tau-protein och minne. Enligt forskning kan tau-protein hjälpa till att reglera stabiliteten hos nervfibrer och därigenom främja informationsöverföring och minnesbildning mellan neuronala celler. Men när tau-proteinet är onormalt, såsom proteinackumulering, kommer det att leda till brott av nervfibrer och döden av ett stort antal neuronala celler, vilket kommer att påverka bildandet och underhållet av minne och till och med leda till minnesförsämring. Därför är det mycket viktigt att upprätthålla det normala uttrycket och funktionen av tau-protein för att upprätthålla minnets hälsa.

Nyligen genomförda studier har också funnit att näringsämnena i vissa livsmedel och drycker också är fördelaktiga för att upprätthålla den normala funktionen av tau-protein. Till exempel kan antioxidanter, Omega-3-fettsyror och koffeinrika grönsaker och frukter hjälpa till att reglera uttrycket och funktionen av tau-protein, vilket hjälper till att förbättra minnet och kognitiva funktioner.

Därför bör vi vara uppmärksamma på att upprätthålla goda levnadsvanor, kontrollera kosten, minska stress, etc., för att upprätthålla det normala uttrycket och funktionen av tau-protein. Samtidigt kan upprätthålla goda studievanor och måttlig träning också bidra till att främja informationsöverföring och minnesbildning mellan neuronala celler. Jag tror att så länge vi uppmärksammar att upprätthålla en hälsosam livsstil kan vi ha ett hälsosamt minne och njuta av livet bättre. Detta visar att vi behöver förbättra vårt minne. Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial med många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av Cistanche kommer från de olika aktiva ingredienser den innehåller, inklusive garvsyra, polysackarider, flavonoidglykosider, etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa på en mängd olika sätt.

Klicka på vet 10 sätt att förbättra minnet

Det är också värt att notera att endogena fragment av tau är ett vanligt fynd i mänsklig hjärnvävnad och cerebrospinalvätska, och differentiell fragmentering av tau kan spela en roll i AD-progression.85,86

Vi observerade flera fragment som otvetydigt kunde skilja {{0}}N och 1N tau (figur 10A, S7 och S8). Det faktum att vi observerar höga spektraltal för 0N (86 PrSMs) och 1N (91 PrSMs), men inte observerar några PrSMs för 2N, är i linje med tidigare kvantitativ immunoblotting som fann 0N och 1N att vara de dominerande formerna och gör ~ 91% av total tau medan 2N endast utgjorde ~9%.87

Om den entydiga tilldelningen av de mikrotubulibindande upprepningarna observerade vi spektra som också kunde tilldelas både 3R (figur 10A och S9) och 4R tau (figur 10A och S10).

Sparsam slutsats gjorde det möjligt för oss att dra slutsatsen att braintau representeras mestadels av blandningen av 1N3R (Tau-B) följt av 0N4R (Tau-D) splitsvarianter, vilket stämmer överens med tidigare observationer.87,88

Medan andra splitsningsisoformer också hade unika fragment, var det låga antalet spektrala matchningar (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Överraskande nog är N-ändarna av de dominerande R-domäninnehållande fragmenten en fortsättning från C-ändarna av de dominerande N-domänen innehållande fragmenten, eller med andra ord, de verkar vara länkade fragment producerade från en möjlig proteolytisk klyvningshändelse (refererad till som plats #1 i figur 10A). Dessutom delar C-ändarna av de 3Rand 4R-domäninnehållande proteoformerna samma klyvningsställe (referat till som plats #2 i figur 10A), även om sekvenserna i sig är olika på grund av splitsningsvariation av exon 10.

Ännu mer överraskande, alla dessa klyvningsställen ligger inom tre väl beskrivna hexapeptidmotiv.89–95 Figur 10B visar alla de unika fragment vi identifierade från våra datamängder som kunde kartläggas till 1N3R tau-isoformen, såväl som platsen för klyvningen webbplatser.

Klyvningsställe #1 ligger inom den andra prolinrika regionen av tau, som delar upp KVAVVR-hexapeptidsekvensen och tillhandahåller ett av de starkaste bindningsställena för mikrotubuli (Figur 10B). 89–91 Klyvningsställe #2 ligger inom 3R- och 4R-hexapeptidmotiven VQIVYK och VQIINK, som har visats driva aggregering av tau (Figur 10B).92–95

Intressant nog börjar eller slutar många av fragmenten, såsom visas i figur 10B, i närheten av dessa två klyvningsställen. Vart och ett av dessa hexapeptidmotiv är känt för att bilda en -struktur, ofta i form av -hårnålar som ligger till grund för aggregationen involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar. kan störa deras aggregeringssåddregioner.25,85,86

Slutligen hittade vi många spektrala matchningar för A som endast kunde observeras exklusivt genom att använda FAIMS.

Dessa A-proteoformer, som vanligtvis kräver speciella fraktionerings- eller hanteringstekniker för att förbättra återhämtningen på grund av deras hydrofoba och aggregationsbenägna egenskaper, 9,16,97,98 observerades intakta med användning av FAIMS inom -40 till -50 CV-intervallet.

Detta inkluderar de kanoniska A 1–42 och A 1–40 (Figur 11A, B, respektive), såväl som flera N-terminalt trunkerade former (specifikt A 2–42 och A 4–42, Figur 11C, D).

Det är värt att notera att A-proteoformer med olika N- och C-terminala klyvningar är notoriskt svåra att identifiera i bottom-up-analyser på grund av den extrema hydrofobiciteten hos de tryptiska produkterna, vilket framhäver en fördel med analys av intakt protein.

Vi tror att FAIMS-TDP-metoden erbjuder ett robust sätt för att uppnå intakt identifiering av dessa A-proteoformer, vilket möjliggör enkel bestämning av de olika kombinationerna av N- och C-terminala klyvningsprodukter som finns.

SLUTSATSER

Vi har beskrivit hur nano-LC omvänd fasseparation av ett mycket komplext prov som innehåller proteiner, över ett brett massintervall, kan dra nytta av implementeringen av gasfasfraktionering genom FAIMS i samband med top-down masspektrometri.

FAIMS visades påverka överföringen av proteoformer genom storlek och/eller laddning, vilket minskar MS1-komplexiteten och tillåter större täckningsdjup av proteomet.

FAIMS vid en enda CV (−50) möjliggjorde identifiering av 1833 ± 17 unika proteoformer i genomsnitt, mer än dubbelt jämfört med utan FAIMS (754 ± 35). Tillägget av FAIMS resulterade inte i en försämring av kvantifieringsreproducerbarheten och förblev nära 20 % RSD, vilket är jämförbart med etikettfria bottom-up-metoder.

Minskande CV för FAIMS noterades för att öka molekylmassan av jonspecies som överfördes till instrumentet (median MW på ~5 kDa vid -50 CV mot ~15 kDa vid -20 CV), och modulering av CV observerades också påverka överföringen av en proteoforms laddningstillståndshölje differentiellt.

Vi definierade också optimala kombinationer av CV som skulle kunna producera det största teoretiska maximumet av proteoformer/gener eller proteomsekvenstäckning. Jämfört med de tre "No FAIMS"-datauppsättningarna, kan extern CV-stegning vid -50, -40 och -30 V mer än fördubbla antalet unika proteoformer, unika gener och proteomsekvenstäckning.

Det är också värt att påpeka att vårt arbete endast utforskade ett relativt litet CV-intervall som vi ansåg passade bäst för vår TDP-metod med hjälp av ett komplext urval. Eftersom FAIMS enkelt kan anpassas till andra metoder, kan lågupplösta MS1-analyser med Orbitrap-analysatorer kunna förbättra identifieringen av större proteoformer inom CV-området vi testade, såväl som bortom -20 V där större proteoformer sannolikt skulle observeras.

Man kan också föreställa sig att framtida massanalysinstrument som förbättrar förvärvet av större proteoformer och är kompatibel med FAIMS kan dra nytta av att utforska CV:n under -20, vilket sträcker sig in i det positiva spänningsområdet.

Vårt TDP-arbetsflöde gjorde det möjligt för oss att identifiera och karakterisera unika proteoformer härledda från gener med kända roller i neurodegenerativa sjukdomar.

Detta inkluderade bestämning av sammansättningen av en okänd massförskjutning närvarande nära den järnbindande domänen av -synuklein, som användes för att lokalisera potentiella järnbindande domäner i - och synuklein också. PARK7 visade sig också vara modifierad med en succinylgrupp på dess Cys-rest på det aktiva stället.

Vi kunde otvetydigt särskilja tau-fragment som motsvarar 0N, 1N, 3R och 4R splitsningsvarianter individuellt och beskriva nya proteolytiska klyvningsställen belägna inom eller nära flera aggregeringssådd hexapeptidrepeats.

Slutligen möjliggjorde FAIMS identifieringen av flera intakta A-proteoformer, inklusive den aggregationsbenägna A 1–42, utan behov av komplex fraktionering eller reningsteknik.

Sammanfattningsvis tror vi att tillägget av FAIMS för att upptäcka TDP kommer att ge en robust och reproducerbar metod för att öka det tillgängliga proteomet för detektion och karaktärisering.

Kompletterande material

Se webbversionen på PubMed Central för kompletterande material.

TACK

Författarna vill tacka Tao Liu och Richard Smith för deras råd och användbara diskussioner.

Detta arbete stöddes av U01 AG061356 (PLDJ) och R01 AG015819 (DAB). En del av forskningen utfördes med hjälp av EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Biological and Environmental Research-programmet. Grafiska abstrakta och bildtillgångar i figur 1 skapades med hjälp av Biorender.com.

REFERENSER

(1). Nichols E; Sök CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd-Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Snickare DO; Carvalho F;Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE;Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Hay SI; Irvani SSN; Jha RP;Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T;Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S; Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR; Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Damm CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A;Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahraian MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; Venketasubramanian N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Global, regional och nationell börda av Alzheimers sjukdom och andra demenssjukdomar, 1990–2016: en systematisk analys för Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Masters CL Amyloid prekursorprotein (APP) och beta A4 amyloid i etiologin för Alzheimers sjukdom: prekursor-produkt relationer i störningen av neuronal funktion. Brain Pathol. 1991, 1, 241-251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimers sjukdom: amyloidkaskadhypotesen. Science 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Goedert M. Tau-protein och den neurofibrillära patologin av Alzheimers sjukdom. Trends Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau och neurodegenerativ sjukdom: historien hittills. Nat. Rev Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musik ES; Holtzman DM Tre dimensioner av amyloidhypotesen: tid, rum och 'vingmän'. Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Takeda S. Tau förökning som ett diagnostiskt och terapeutiskt mål för demens: potential och obesvarade frågor. Främre. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Top-down proteomik inom hälsa och sjukdom: utmaningar och möjligheter.Proteomics 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiskt intresse. MI; Popov IA; Nikolaev EN Massspektrometrianalys av mångfalden av Abeta-peptider: svårigheter och framtida perspektiv för upptäckt av AD-biomarkörer. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Massspektrometri är ett mångfacetterat vapen som ska användas i kampen mot Alzheimers sjukdom: amyloida betapeptider och mer. Massspektrum. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andreev VP; Petyuk VA; Bryggare HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Läger D; Smith RD; Lieberman AP; Albin RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Label-free kvantitativ LC-MSproteomics av ​​Alzheimers sjukdom och normalt åldrade mänskliga hjärnor. J. Proteome Res. 2012, 11,3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Kugghjul M; Wang PG; Chin LS; Li L. Integrerad proteomik och nätverksanalys identifierar proteinhubbar och nätverksförändringar vid Alzheimers sjukdom. ActaNeuropatol. Commun. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com