Östrogen aktivitet av glykosider från Cistanche Deserticola som ett östrogenreceptoradjuvans in vitro

INTRODUKTION

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" på kinesiska), en traditionell kinesisk örtmedicin som först registrerades iShenNongBenCaoJing, har använts för behandling av njurbrist, impotens, senil förstoppning och blodbrist i tusentals år.[1] Det är huvudsakligen distribuerat i ökenregioner i nordvästra Kina, såsom Gansu och Xinjiang.[2]Modern farmakologisk forskning visade att C. deserticola kan främja breda medicinska funktioner, såsom hormonreglering, immunmodulerande, antioxidativ, neuroprotektiv, antiinflammatorisk ochöstrogen aktivitet.[3,4] Glykosider av Cistanches(GC) ansågs vara en av de huvudsakliga aktiva komponenterna med olika biologiska effekter.

Östrogenreceptorer- (ER) och ER är de undertyper av ER som skulle kunna reglera fysiologiska funktioner.[7] Dessa proteiner skulle kunna reglera transkriptionen av målgener genom att binda till associerade DNA-regulatoriska sekvenser i cellkärnan. Båda subtyperna är markant uttryckta i det kardiovaskulära och centrala nervsystemet.[8,9] ER finns huvudsakligen i bröstkörteln, livmodern, äggstocken, ben, manliga reproduktionsorgan och prostata. ER finns huvudsakligen i prostata, äggstockar och urinblåsa.[10,11] Dessutom finns det några vanliga fysiologiska roller för de två subtyperna, såsom i utvecklingen och funktionen av äggstockarna och skyddet av det kardiovaskulära systemet.[ 12,13] Tidigare forskning i vår grupp avslöjade den östrogenliknande mekanismen hos GC med metoden för metabolomisk analys.[14] I en kontinuerlig studie analyserade vi mekanismen för östrogen aktivitet hos GC på MCF-7-cellinjer relaterade till ER.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRAÖSTROGEN AKTIVITETPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIAL OCH METODER

Instrument

Inkubatorn ECO-170P-230 kom från New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 mikroplattläsare och elektroforesapparater kom från Bio-Rad Laboratories, Inc., CX21-mikroskopet var från Olympus Co., Ltd., GIS-2019 gelbildsystem var från Tanon Science and Technology Co., Ltd., den platta bottenplattan var från Corning Inc., EPICS-XL flödescytometri var från Beckman-Coulter Inc. och StepOnePlus Real-Time polymeraskedjereaktion ( PCR)-systemet var från Thermo Fisher Scientific.

Kemikalier och reagens

GCs bereddes i vårt laboratorium som metoden som tidigare rapporterats, [14] och renheten av GCs bestämdes till 52% (akteosid användes som en markör för att bestämma GCs) med ultraviolett spektrofotometri. Estradiol (E2) köptes från Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Fetalt bovint serum (FBS) och RPMI-1640 kom från Gibco Co., Ltd., plattbotten med 96 brunnar var från Corning Inc., och dimetylsulfoxid (DMSO) och 3-[4,5-dimetyl-2-tiazolyl ]‑2,5‑difenyltetrazoliumbromid (MTT) köptes från Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol-reagens, Reverse Transcription (RT) Kit och TB Green™ RT-PCR Kit köptes från TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kina. Anti‑ER Rabbit pAb, anti‑ER Rabbit pAb och ‑actin antikroppar köptes från Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Alla andra vanliga kemikalier köptes från kommersiella standardleverantörer.

Provberedning

Beredning av glykosider av Cistanches stamlösning

GC-extrakt löstes i DMSO för att göra en stamlösning med en koncentration av 0.1051 g/ml och lagrades vid 4 grader. Fenolrödfri RPMI-1640 användes för att späda stamlösningen till olika koncentrationer före användning.

Beredning av stamlösning av östradiol

E2-extrakt löstes i DMSO för att göra en stamlösning med en koncentration av 0,27 mg/ml och lagrades vid 4 grader. Fenolrödfri RPMI-1640 användes för att späda stamlösningen till olika koncentrationer före användning.

Beredning av koldextranbehandlat - fetalt bovint serum

Hundra milliliter FBS blandades med 250 mg aktivt kolpulver och 25 mg dextran. Efter inkubering i 45 minuter vid 55 grader centrifugerades blandningen vid 4 grader, 1000 rpm under 15 minuter. Supernatanten filtrerades med Millipore Express PES-membran för att få den koldextranbehandlade (CDT)-FBS och lagrades vid -20 grader.

Cell kultur

De mänskliga bröstcancercellinjerna MCF-7 erhölls från den amerikanska kulturkollektionen (ATCC). Dessutom odlades cellerna med RPMI-1640-medium innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin vid 37 grader under en fuktad 5 % CO2-atmosfär. Celler odlades i det fenolrödfria RPMI-1640-mediet innehållande 5 % CDT-FBS 4 dagar före MTT-analysen så att östrogenet i cellerna kunde rensas.

Cellproliferationsanalys av östradiol på MCF-7-cellinjer

Cellproliferation mättes med hjälp av MTT-analysen för MCF-7-celler.[15,16] E2 löstes i RPMI-1640-odlingsmedia innehållande 0.1 % DMSO vid slutkoncentrationer av {{27 }}.1, 1, 10, 100 och 1000 nM. MCF-7-cellinjer odlades i fenolrött-fritt RPMI-1640-medium i 4 dagar. Efter tvättning med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) tre gånger tillsattes 100 µL FBS-fritt RPMI-1640-medium till 96-brunnars plattor med 1,5 × 104 per brunn och inkuberades vid 37 grader i 24 timmar. Därefter behandlades cellerna med olika koncentrationer av E2-lösningen i 72 timmar. Sedan sattes 100 µL MTT-lösning (0,5 mg/ml) till varje brunn. Celler inkuberades under 4 timmar. Slutligen tillsattes 150 µL DMSO för att lösa formazankristallerna. Absorbansen mättes vid 570 nm av en mikroplattläsare och proliferationshastigheten (PR) beräknades.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cellproliferationsanalys av glykosider av Cistanches på MCF-7-cellinjer

Cellproliferation mättes med MTT-analysen för MCF-7-celler. GC:er löstes i RPMI-1640-odlingsmedium innehållande 0,1 % DMSO vid slutkoncentrationer av 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 och 175 µg /ml. MCF-7-cellinjer odlades i fenolrött-fritt RPMI-1640-medium innehållande 5 % CDT-FBS under 4 dagar. Efter tvätt med PBS tre gånger tillsattes 100 µL FBS-fritt RPMI-1640-medium till 96-brunnars plattor med 1,5 × 104 per brunn och inkuberades vid 37 grader i 24 timmar. Därefter behandlades cellerna med olika koncentrationer av GCs-lösningen under 24, 48 respektive 72 timmar. Sedan sattes 100 µL MTT-lösning (0,5 mg/ml) till varje brunn. Celler inkuberades under 4 timmar. Slutligen tillsattes 150 µL DMSO för att lösa formazankristallerna. Absorbansen mättes vid 570 nm av en mikroplattläsare och PR beräknades. Fenolrödfri RPMI-1640 och medium innehållande E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) var de negativa respektive positiva grupperna.

Cellproliferationsanalys av glykosider av Cistanches med fulvestrant på MCF-7-cellinjer

Cellproliferation mättes med MTT-analysen för MCF-7-celler. GC:er löstes i RPMI-1640-odlingsmedia innehållande 0,1 % DMSO vid slutkoncentrationer på 1,75, 17,5 och 175 µg/ml. MCF-7-cellinjer odlades i fenolrött-fritt RPMI-1640-medium innehållande 5 % CDT-FBS under 4 dagar. Efter tvätt med PBS tre gånger tillsattes 100 µL FBS-fritt RPMI-1640-medium till 96-brunnars plattor med 1,5 × 104 per brunn och inkuberades vid 37 grader i 24 timmar. Därefter behandlades cellerna med olika koncentrationer av GCs-lösningen och inkuberades med fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) i 48 timmar. Sedan sattes 100 µL MTT-lösning (0,5 mg/ml) till varje brunn. Celler inkuberades under 4 timmar. Slutligen tillsattes 150 µL DMSO för att lösa formazankristallerna. Absorbansen mättes vid 570 nm av en mikroplattläsare och PR beräknades. Fenolrödfri RPMI-1640 och medium innehållande E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) var de negativa respektive positiva grupperna.

Cellcykelanalys

GC:er löstes i RPMI-1640-odlingsmedia innehållande 0,1 % DMSO vid slutkoncentrationer på 1,75, 17,5 och 175 µg/ml. MCF-7-cellinjer odlades i fenolrött-fritt RPMI-1640-medium innehållande 5 % CDT-FBS under 4 dagar. Efter tvättning med PBS tre gånger tillsattes 1 mL FBS-fritt RPMI-1640-medium till 6-brunnars plattor med 2,5 × 105 per brunn och inkuberades vid 37 grader i 24 timmar. Därefter behandlades cellerna med olika koncentrationer av GCs-lösningen och inkuberades med fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) i 48 timmar. Därefter samlades cellerna och tvättades med PBS tre gånger, centrifugerades vid 4 grader, 1000 rpm i 10 minuter och fixerades med 70% etanol vid -20 grader, över natten. Efter tvättning med PBS två gånger färgades cellerna med PI-lösning (50 mg/ml) innehållande 1 mg/ml RNase A och 0,1 % Triton X-100 under 30 minuter i mörker vid 4 grader. Cellcykeln detekterades med användning av flödescytometri och proliferationsindex (PI) beräknades enligt följande. Fenolrödfri RPMI-1640 och medium innehållande E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) var de negativa respektive positiva grupperna.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100 %

RNA-isolering och realtids kvantitativ polymeraskedjereaktionsanalys

För att mäta nivån av mRNA användes en RT-kvantitativ PCR (qPCR)-analys. Totalt cellulärt RNA extraherades med ett TRIzol-reagens. För qPCR transkriberades RNA omvänt till cDNA från 4 µg totalt RNA med användning av ett RT-kit. RT‑PCR-analyser utfördes med TB Green™ RT‑PCR Kit. Alla protokoll utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Primerparet som användes för amplifiering av ER var 5'‑GGGAAGTATGCTATGGAATCTG‑3' (framåt) och 5'‑TGGCTGGACACATATAGTCGTT‑3' (omvänt); primerparet som användes för amplifiering av ER var 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (framåt) och 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (omvänt). PCR-förhållandena för ER och ER var 94 grader i 3 minuter följt av 37 respektive 40 cykler på 94 grader i 30 sekunder, 58 grader i 2 minuter och 72 grader i 2 minuter. Primerparet som användes för amplifiering av GAPDH var 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (framåt) och 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (omvänt). PCR-förhållandena för GAPDH var 94 grader i 3 minuter följt av 30 cykler av 94 grader i 30 s, 58 grader i 2 minuter och 72 grader i 2 minuter. Varje gång RT-qPCR-experimentet upprepades mer än två gånger. För detta användes GAPDH som intern kontroll. Det relativa genuttrycket av ER /ER av transfektanter om kontrollceller beräknades: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

Uttrycket av ER- och ER-proteiner detekterades genom western blot-analys som den rapporterade metoden med mindre modifieringar. Kortfattat odlades MCF-7-cellerna i 6-brunnars plattor med 2,5 × 105 celler per brunn och behandlades med GCs vid slutkoncentrationen 1,75, 17,5 respektive 175 µg/ml under 48 timmar. Efter inkubation bereddes helcellsextrakten med RIPA-buffert innehållande 1 mM PMSF. Proteiner i helcellsextrakten separerades med 12 % natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och överfördes sedan till polyvinylidendifluoridmembran. Membranet blockerades med 5 % (vikt/volym) skummjölk löst i TBST-buffert och inkuberades med primära och sekundära antikroppar i sin tur. Bundna antikroppar observerades.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRAÖSTROGEN AKTIVITETPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Statistisk analys

Resultaten uttrycktes som medelvärden och standardavvikelser, och statistisk signifikans utfördes med Students t-test med SPSS 21.0 programvara (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was considered statistically significant. 

RESULTAT

Efter 24 timmars E2-behandling förbättrades proliferationen av MCF-7-celler [Figur 1a]. 10 nM E2-lösning kan uppenbarligen stimulera tillväxten av cellerna (123,89%). Men med ökningen av E2-koncentrationen försvagades cellproliferationsförmågan. Därför var 10 nM den optimala koncentrationen av E2 i detta experiment. GCs-grupp vid koncentrationerna 1,75, 17,5 och 175 µg/mg kunde öka proliferationen av MCF-7-cellinjerna på ett tids- och dosberoende sätt och uppvisade en signifikant skillnad med en negativ grupp [Figur 1b]. Jämfört med den negativa gruppen uppvisade E2-gruppen uppenbar proliferation (120,06%). Kombinerad läkemedelsgrupp (CMG) (fulvestrant med E2 eller GC) i CDT-FBS-mediet inkuberades med MCF-4-celler. Efter 72 timmar

inkubation, kan CMG leda till lutningen av PR jämfört med den individuella medicineringsgruppen (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

SLUTSATS

I denna forskning analyserades effekten av GC på proliferationen och cellcykeln av MCF-7 med metoden MTT respektive flödescytometri.GC kan öka spridningen av MCF-7-cellervid koncentrationen 1,75, 17,5 och 175 µg/ml efter inkubation under 72 timmar. Ökningen tenderar dock att avta när CC och fulvestrant används tillsammans. GC kan öka PI-värdet för MCF-7-celler, minska cellen i G1-fasen och öka cellerna i S- och G2-faserna.

Fulvestrant är en ER-specifik antagonist, som blockerar den nukleära lokaliseringen av ER genom att försämra receptordimerisering och energiberoende nukleär transport.[17] I denna forskning har en slutsats bekräftat att fulvestrant kan försvaga spridningen av GC på MCF-7-celler, och det kan påverka cellcykeltransformation. Därför indikerade denna studie den östrogena aktiviteten hos GC, och även ER är

mål för GC. I RT-PCR- och western blot-experimentet ökade mRNA- och proteinuttryck av ER och ER i MCF-7-cellerna med ökningen av GC-koncentrationen. Därav,GC kan spela en roll i östrogen aktivitetenligt uppreglerat mRNA och proteiner från ER och ER.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRAÖSTROGEN AKTIVITETPHGS75% ECH 30% ACT 12%