Utvärdering av ammoniakkväveexponering i immunförsvar på mjälte och huvud-njure av Wuchang braxen (Megalobrama Amblycephala) Ⅱ
Nov 14, 2023
3. Diskussion
Hur fiskens immunsystem reagerar på olika typer av miljöföroreningar har blivit ett hett ämne [34–37]. Som ett allmänt förekommande giftigt ämne kan ammoniak ha en oväntad inverkan på vattenlevande djurs hälsa eftersom fiskar ofta lider av kronisk ammoniakstress i realistiska situationer. Vår nuvarande studie klargjorde påverkan av långvarig exponering för ammoniak på fiskimmunitet och dess mekanism.
I vårt nuvarande experiment ökade serumkortisol avsevärt med ökningen av ammoniakexponeringskoncentrationen, vilket indikerar förekomsten av stress i Wuchang braxen.Liknande resultat observerades hos piggvar (Scophthalmus ma. imus), vanlig karp (Cyprinuscarpio) och juvenil trubba braxen (Megalobrama) amblycephala) [32,38,39. Kronisk ammoniakexponering ledde också till signifikanta minskningar av serumlysozym, komplement och C4 i denna studie. Lysozym, som en indikator på medfödd immunfunktion, är det primära immunenzymet för att bekämpa infektioner (40]. Komplementsystemet, som en av broarna mellan medfödd immunitet och förvärvad immunitet, spelar en väsentlig roll för att rensa immunkomplex och döda sjukdomsframkallande bakterier och virus [41,42). Vissa tidigare studier har rapporterat att akut ammoniakstress kan hämma lysozymaktiviteter (17,43] och minska protein- och mRNA-nivåerna av C3 och C4 i fisk (44-46). Våra nuvarande resultat visade alltså att kronisk ammoniakstress undergrävde medfödd immunitet hos fisk.I föreliggande studie fann man koncentrationsberoende ökningar av ammoniakkoncentrationer både i mjälten och huvudnjuren men en signifikant skillnad upptäcktes endast i mjälten. Liknande ökningar hittades i mjälten ochhuvud-njure index, vilket indikerar att ammoniakstress orsakade allvarlig skada på två huvudsakliga immunorgan. Histologiska fynd avslöjade vidare att ansamling av ammoniak kan vara den främsta orsaken till patologiska skador i mjälten ochhuvud njure, som kännetecknades av ökade melanom-makrofagercentra och cytoplasmavakuolisering. Melano-makrofagcentra är kända som makrofagaggregat, och deras huvudsakliga funktioner är lagring av cellhärledda fosfolipider och järn efter erytrofagocytos, avsättning av resistenta patogener och antigenbearbetning i immunsvar [47-51]. Den ökade storleken och frekvensen av melano-makrofager centra tyder ofta på att fiskar upplever stress eller skada eller blir äldre [36,48,52]. Forskningen från Kwon och Chang rapporterade att en 5-dagars exponering för ammoniak (4.0~10,4 mg/L totalt ammoniakkväve) inducerade allvarlig hemosiderinavsättning och ökade melaninmakrofager i mjälten hos havsruda [ 53]. Liknande melano-makrofager sammansättning observerades i mjälten på Pelteobagrus vachellii exponerad för 1 och 5 mg/L totalt ammoniakkväve [17]. Dessutom visade kvantitativ utvärdering av histopatologiska förändringar att graden av patologisk skada orsakad av ihållande ammoniakstress var högre i mjälten än i huvudnjuren.
EKOLOGISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 25% ECHINACOSID OCH 9% ACTEOSIDE FÖR NJURINFEKTION
Skada på immunorgan hos fisk är alltid förknippad med förändringar av immunmolekyler [35]. I denmedfödda immunförsvaret, deninflammatoriska cytokiner IL-1och TNF- är de viktiga regulatorerna för initiering och modulering av inflammatoriskt svar [54-57]. Minskade nivåer av cytokinmolekyler (TNF-, IL-1) representerar en minskning av cellulär immunologisk funktion, vilket i slutändan resulterar i en hög infektionshastighet under externa stressorer [58–60]. Begränsade studier har dokumenterat att akut exponering för totalt 40 mg/L ammoniakkväve kan höja transkriptionella nivåer av cytokiner som IL-1 och TNF- i piggvar (Scophthalmus maximus), medan kronisk exponering för hög ammoniak (50 mg/L) totalt ammoniakkväve) inducerade den motsatta trenden hos karp (Carassius auratus) [14,60]. Våra nuvarande resultat visade att kronisk ammoniakexponering orsakade markanta minskningar av protein- och transkriptionsnivåer av mjält-IL-1 och TNF-, vilket ytterligare stöddes av Spearman-korrelationsanalysen mellan ammoniakkoncentrationer och nivåerna av mjält-IL{{15} } och TNF-. Liknande resultat hittades också i huvudnjuren. Våra aktuella data indikerade att kronisk ammoniakexponering störde det medfödda immunförsvaret genom att hämma transkription och proteinsyntes av inflammatoriska molekyler IL-1 och TNF- i två immunorgan, mjälten och huvud-njure.
Förutom det medfödda immunförsvaret spelar adaptiv immunitet också en avgörande roll i fiskens immunförsvar. IgM är den första antikroppen som utsöndras av det adaptiva immunsvaret mot en ny infektion eller mot ett främmande antigen, som huvudsakligen uttrycks i fiskens mjälte och huvud-njure [61,62]. Lägre nivåer av IgM kan vara associerade med svag adaptiv immunitet [63]. I den aktuella studien upptäcktes signifikanta minskningar av protein- och transkriptionsnivåer av IgM i mjälten men inte i huvudnjuren, vilket tyder på att ammoniakexponering har en hämmande effekt på produktionen av mjält-IgM. Qin et al. rapporterade att exponering för totalt 1 mg/L ammoniakkväve under 48 timmar och 96 timmar signifikant minskade transkriptionella nivåer av igm i mjälten på Pelteobagrus vachellii, men inte i huvud-njure [17]. Minskade IgM-nivåer hittades också i gälen, mjälten och hjärnan hos Rhynchocypris lagowski exponerad för 0.99 mg/L ojoniserad ammoniak under 96 timmar [18]. Vår Spearman-korrelationsanalys visade vidare att ammoniakexponeringskoncentrationen var signifikant negativ korrelerad med mjält-IgM, men inte signifikant korrelerad med huvud-njure-IgM. Således föreslog vår studie att kronisk ammoniakstress minskade den adaptiva immuniteten endast i mjälten. Det kan tyda på att mjälten är mer känslig för omgivande ammoniakbelastning än huvudnjuren. En anledning till denna hypotes kan vara den avvikande försämringen av strukturen hos mjälten och huvudnjuren som induceras av ammoniakstress i vår nuvarande studie.
De TLR:er som är allmänt fördelade i immunceller är primära sensorer för invaderande patogener. I den aktuella studien upptäcktes minskade transkriptionsnivåer av TLR i mjälten och huvud-njuren av Wuchang braxen, vilket antyder att ammoniak kan orsaka negativa effekter via TLR-signalvägen. Faktum är att hämningen av TLR kan vara relaterad till ökningen av serumkortisol inducerad av ammoniakexponering. Carrizo et al. bevisade att kortisolbehandling minskade mRNA-nivåer av TLR (tlr1/5 m/9/22) i Oncorhynchus mykiss myotuber [64]. Susarla et al. fann att kortisol kunde minska transkriptionella nivåer av cytokiner (VEGF, CCL5, IFN-, CXCL-10, IL-8 och GCSF) efter antingen eller både TLR3- och TLR4-stimulering av primära humana hornhinnefibroblaster [65]. Dessutom kan TLR-hämningen innebära ett block av TLR-signalvägar. Den MyD88-beroende vägen regleras av alla TLR, och den MyD88-oberoende vägen är speciell för TLR3- och TLR4-signalvägarna [66]. TLR-signalering leder också till PI3 K-AKT-vägaktivering, vilket i sin tur aktiverar B-celler för att producera antikroppar och syntetisera proinflammatoriska molekyler som IL-1 och TNF- genom NF-KB-signalvägen [67–69]. Det är värt att notera att transkriptionella nivåer av traf6 minskade i både mjälte och huvudnjure efter ammoniakexponering, medan inga signifikanta förändringar upptäcktes i uttrycket av myd88 och pi3 k. Således indikerade våra resultat att ammoniak utövade interferens med den MyD88- -oberoende vägen genom att hämma TRAF6 i både mjälte och huvudnjure. Dessutom kan TRAF6-aktiveringen utlösa aktiveringen av nedströms NF-KB-signalering och MAPK-signalering (p38, JNK och ERK), vilket i slutändan inducerar produktionen av olika inflammatoriska cytokiner inklusive TNF- och interleukin-1 /6/12 (IL-1 /6/12) [70,71]. Dessutom är TRAF6 också den avgörande mediatorn för CD40-signalering som reglerar IL-6 och Ig-sekretion [72]. I vår studie antydde den signifikanta nedregleringen av mRNA för mRNA från mjälten erk1 och nf-κb2 såväl som huvud-njure erk1, jnk1 och nf-κb1 mRNA att ammoniakexponering undertryckte nedströms NF-KB och MAPK signalmolekyler i mjälten och huvudet -njure. Dessutom nedreglerade ammoniakexponering NF-kB-signalering genom att undertrycka genen nf-kb1 i mjälten men genen nf-kb2 i huvud-njuren, vilket återspeglar det vävnadsspecifika inflammatoriska svaret mellanmjälte och huvud-njure. När det gäller MAPK-signalvägen hämmade ammoniakexponering signifikant uttrycket av mjälterk1 och huvud-njure erk1 och jnk1. Efter att ha utfört Spearman korrelationsanalys fann vi att ammoniakexponeringskoncentrationen var signifikant negativt korrelerad med nivåerna av immunparametrar (IL-1, TNF- och IgM) såväl som uttrycket av TLR-signalrelaterade gener i mjälten och huvud-njure. Därför antydde våra resultat att kronisk ammoniakexponering kan försämra medfödd och adaptiv immunitet via TLRs/MyD88-oberoende signalväg.
Höga IBR-värden återspeglade de förbättrade biologiska svaren och det dåliga hälsotillståndet hos organismerna [73]. De nuvarande resultaten för IBR-värden ökade med ökningarna i omgivande ammoniakkoncentration i både mjälte och huvudnjure. Detta resultat överensstämde med data om histopatologi och serum-immunparametrar. Vid samma koncentration av ammoniakstress var dessutom IBR-värdet högre i mjälten än i huvud-njure, vilket ytterligare bevisade att påverkan av ammoniakstress på mjälten var allvarligare än på huvud-njuren av Wuchang braxen.
4. Material och metoder
4.1. Djurunderhåll och experimentellt protokoll Juvenile
Wuchang braxen med en medelvikt på 9,98 ± 0,48 g från Tuanfeng Fishery (Hubei, Kina) flyttades till 300 L glasfibertankar, där de försågs med rinnande avklorerade och kontinuerligt luftade vatten. De acklimatiserades i 14 dagar genom att utfodra kommersiella dieter två gånger om dagen (9:{{10}} på morgonen och 15:00 på eftermiddagen). Efter ett preliminärt experiment visade sig 96 timmars LC50 och säkra koncentrationer av totalt ammoniakkväve för braxenungar vara 46.013 mg/L respektive 4,601 mg/L. Därför sattes exponeringsintervallet för ammoniak till 0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L och 30 mg/L totalt ammoniakkväve. Fisken fördelades slumpmässigt i 5 behandlingsgrupper med triplikattankar, och eldningsdensiteten var 20 ungar per tank. De experimentella koncentrationerna av ammoniak erhölls från en stamlösning av 10 g/L gjord med ammoniakklorid av reagenskvalitet (BASFR, 99,5%). För att bibehålla stabila ammoniakbehandlingskoncentrationer förnyades 1/2 experimentlösningen varje dag med en ny och lika stor koncentration av ammoniakkvävelösning. Under tiden genomgick kontrollgruppen liknande manipulation med luftat kranvatten. De verkliga totala ammoniakkvävenivåerna för varje behandling mättes genom nesslerisering varje dag. Under hela experimentperioden visade de dagliga övervakningsdata av HQ40 D Water Analyzer (Hach, Loveland, CO, USA) att vattentemperaturen var 25,0 ± 0,60 ◦C, koncentrationerna av löst syre var över 5,0 mg/L och pH hölls vid 7,55 ± 0,04, med små justeringar med användning av 10 % H2SO4 och 10 % NaOH. Fisk fick en kommersiell diet två gånger per dag på samma sätt som acklimatiseringen.
4.2. Provtagning och förberedelse
Efter en experimentell exponering på 30-dagar fastade fisken först i 48 timmar och sövdes sedan i MS-222-lösning. Kroppsvikten för varje juvenil mättes före dissektion och blodet samlades omedelbart från kaudalvenerna för att separera serumet för efterföljande biokemisk parameterbestämning. Vävnaderna (mjälte och huvud-njure) extraherades och vägdes. Mjälten och huvud-njurindexen beräknades med hjälp av formeln [vävnadsvikt (g)/kroppsvikt (g) * 100%]. Tre individuella mjältar och huvud-njurar från varje grupp användes för histopatologisk analys, och de andra frystes omedelbart vid -80 ◦C för analys av vävnadskoncentrationer av ammoniak, immunitetsparametrar och gentranskriptionsnivåer. Detta arbete som utfördes på M. amblycephala godkändes av Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Huazhong Agricultural University, Wuhan, Kina (HZAUFI-2019-018).
4.3. Ammoniakdetektering i mjälte och huvud-njure
För analys av ammoniaknivåer utfördes förbehandling av vävnadsprover och ammoniakdetektering enligt tidigare studier [74,75]. De detaljerade teststegen finns i Stödinformation (tilläggstext S1).
4.4. Serumimmunparametrar analys
Blodprover centrifugerades (845 g, 20 min, 4 ◦C) för beredning av serumprover. Varje experimentgrupp hade sex replikat och ett replikat inkluderade serum från 10 individer från samma tank. Serumkortisol bestämdes med radioimmunoassay (RIA) med hjälp av kitet från Beijing North Institute of Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, Kina) (www.bnibt.com, tillgänglig den 15 mars 2020) enligt en tidigare studie [76]. Innehållet av komplement C3 och komplement C4 och aktiviteten av lysozym mättes med kommersiella kit producerade av Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina) (www.njjcbio.com, tillgänglig den 15 mars 2020).
4.5. Analys av vävnadsimmunparametrar
Vävnadsprover från fem fiskar från samma grupp slogs samman som ett duplikat och homogeniserades med 0,85 % natriumklorid, centrifugerades sedan vid 845 × g under 15 minuter (4 ◦C) för uppsamling av supernatanten. Varje experimentgrupp hade sex replikat. Som beskrivits i tidigare studier [77,78] användes supernatanten för att testa koncentrationerna av IgM, IL-1, TNF- och totalt protein med användning av kommersiella kit. Alla kit köptes från Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina) (www.njjcbio.com, tillgänglig den 15 mars 2020).
4.6. Analys av genuttryck
Mrna-nivåerna av immunassocierade gener i mjälten och huvud-njure testades enligt metoden i en tidigare studie [79]. Detaljerad information om testproceduren finns i Stödinformation (tilläggstext S2). Primersekvenserna är listade i tabell 3. Smältkurvanalys utfördes för varje primer vid slutet av reaktionen för att demonstrera reaktionsspecificiteten. Efter att ha verifierat att amplifieringseffektiviteten för alla utvalda gener varierade från 90–110 %, beräknades de relativa Mrna-nivåerna med metoden 2−∆∆Ct med -aktin som intern kontroll [80].
4.7. Histopatologisk utvärdering
Mjält- och huvud-njurprov fixerades i 10 % neutralbuffrat formalin, dehydrerades sedan i etanol och bäddades in i paraffin. Slutligen färgades vävnadsskivor med hematoxylin och eosin (H&E). Ytterligare kvantitativ analys av patologiska förändringar utfördes enligt tidigare studier [82,83]. Det detaljerade analysprotokollet tillhandahålls i Stödinformation (tilläggstext S3).
4.8. Integrerad biomarkörsvarsanalys
IBR-analys är en metod för att integrera alla uppmätta biomarkörsvar i ett integrerat index för att bedöma stressnivåer [84–86]. I den aktuella studien användes den för att utvärdera de toxiska effekterna av olika ammoniakkoncentrationer på mjälten och huvudnjuren av Wuchang braxen efter en 30-dags exponering. Detaljerad information om beräkningsproceduren finns i Stödinformation (tilläggstext S4).
4.9. Statistiska analyser
Alla värden utsattes för envägsvariansanalys följt av Dunnetts post hoc-test för att utvärdera skillnader mellan medelvärden (SPSS 22.0, Chicago, IL, USA). Spear man-korrelationsanalys valdes för att bestämma sambandet mellan totala ammoniakkoncentrationer, immunparametrar och genuttrycksnivåer. Normalitet och varianshomogenitet har tidigare verifierats. Skillnader mättes och ansågs vara signifikanta vid p-värdet < 0.05.
5. Slutsatser
Vår studie ger bevis för att kronisk ammoniakstress förhöjda serum-COR, minskade serumlysozym och C3/C4 och minskade protein- och transkriptionsnivåerna av IL-1, TNF- och IgM såväl som uttrycksnivåerna av gener involverade med TLR. /MyD88- oberoende signalväg i mjälten och huvud-njuren hos M.amblycephala. Dessutom har indexen för ochpatologisk skadatill de två immunorganen ökade med vävnadsansamling av ammoniak. Dessa fynd visade att ammoniakackumulering i mjälten och huvud-njure orsakade histopatologisk skada och inducerade immunsuppression genom hämning av TLRs/MyD88-oberoende signalering. Dessutom visade sig de negativa effekterna av kronisk ammoniakbelastning på mjälten vara allvarligare än de på huvud-njure av Wuchang braxen.
Finansiering: Detta arbete stöddes gemensamt av Kinas nationella nyckel-FoU-program (2019 YFD0900303), China Agriculture Research System of MOF and MARA (CAS-45-24) och National Natural Science Foundation of China (nr. 32071621) .
Uttalande från institutionell granskningsnämnd: Vi följde alla lokala, nationella och internationella regler och konventioner, och vi respekterade normal vetenskaplig etisk praxis. Exemplaren som användes i denna studie kom från en population huvudsakligen av kommersiellt fiskade individer avsedda för mänsklig konsumtion. Djurprotokollet godkändes av Institutional Animal Care and Use Ethics Committee vid Huazhong Agricultural University (Wuhan, Kina) (HZAUFI-2019-018).
Informerat samtycke: Informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner som var involverade i studien.
Datatillgänglighetsförklaring: Alla datauppsättningar som genererats för denna studie ingår i artikeln/tilläggsmaterial.
Intressekonflikter: Författarna deklarerar om intressekonflikter.
Referenser
1. Randall, DJ; Tsui, T. Ammoniaktoxicitet hos fisk. Mar. Pollut. Tjur. 2002, 45, 17–23. [CrossRef]
2. David, AA; Debbie, C.; Allen, WK; John, EC Interaktion av joniserad och icke-joniserad ammoniak på kortsiktig överlevnad och tillväxt av räklarver, Macrobrachium rosenbergii. Biol. Tjur. 1978, 154, 15–31. [CrossRef]
3. Thurston, RV; Russo, RC; Vinogradov, GA Ammoniaktoxicitet för fiskar. Effekt av pH på toxiciteten hos de icke-joniserade ammoniakarterna. Environ. Sci. Technol. 1981, 15, 837-840. [CrossRef]
4. Armstrong, BM; Lazorchak, JM; Murphy, CA; Haring, HJ; Jensen, KM; Smith, ME Fastställande av effekterna av ammoniak på reproduktion av tjurfisk (Pimephales promelas). Sci. Total miljö. 2012, 420, 127–133. [CrossRef] [PubMed]
5. Eddy, FB Ammoniak i flodmynningar och effekter på fisk. J. Fish Biol. 2005, 67, 1495–1513. [CrossRef]
6. Miron, DS; Moraes, B.; Becker, AG; Crestani, M.; Spanevello, R.; Loro, VL; Baldisserotto, B. Ammoniak och pH-effekter på vissa metaboliska parametrar och gälhistologi hos silvermal, Rhamdia quelen (Heptapteridae). Vattenbruk 2008, 277, 192–196. [CrossRef]
7. Yu, C.; Huang, X.; Chen, H.; Godfray, HCJ; Wright, JS; Hall, JW; Gong, P.; Ni, S.; Qiao, S.; Huang, G.; et al. Hantera kväve för att återställa vattenkvaliteten i Kina. Nature 2019, 567, 516. [CrossRef] 8. Världshälsoorganisationen (WHO). En global översikt av nationella bestämmelser och standarder för dricksvattenkvalitet, 2:a upplagan; Världshälsoorganisationen: Genève, Schweiz, 2021; 66p.
9. Passell, HD; Dahm, CN; Bedrick, EJ Ammoniakmodellering för att bedöma potentiell toxicitet för fiskarter i RIO grande, 1989–2002. Ecol. Appl. 2007, 17, 2087–2099. [CrossRef]
10. Fan, B.; Li, J.; Wang, X.; Chen, J.; Gao, X.; Li, W.; Ai, S.; Gui, L.; Gao, S.; Liu, Z. Ammoniak spatiotemporal distribution och riskbedömning för sötvattensarter i akvatiska ekosystem i Kina. Ekotox. Environ. Saf. 2021, 207, 111541. [CrossRef]
11. Yue, F.; Pan, LQ; Xie, P.; Zheng, D.; Li, J. Immunsvar och uttryck av immunrelaterade gener i simkrabba Portunus trituberculatus utsatt för förhöjd ammoniak-N-stress i omgivningen. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2010, 157, 246–251. [CrossRef]
12. Qin, CJ; Shao, T.; Zhao, DX; Duan, HG; Wen, ZY; Yuan, D.; Li, HT; Qi, ZM Effekt av ammoniak-N och patogenutmaning på komplementkomponent 8 och 8-uttryck i mörkbarbelmalen Pelteobagrus vachellii. Fisk Skaldjur Immunol. 2017, 62, 107–115. [CrossRef] [PubMed]
13. Cheng, CH; Yang, FF; Ling, RZ; Liao, SA; Miao, YT; Ja, CX; Wang, AL Effekter av ammoniakexponering på apoptos, oxidativ stress och immunsvar hos blåsfisk (Takifugu obscurus). Aquat. Toxicol. 2015, 164, 61–71. [CrossRef]
14. Liu, BL; Jia, R.; Huang, B.; Lei, JL Interaktiv effekt av ammoniak och trängselstress på jonreglering och uttryck av immunrelaterade gener i juvenil piggvar (Scophthalmus maximus). Mar Freshw. Behav. Physiol. 2017, 50, 179–194. [CrossRef]
15. Li, M.; Zhang, M.; Qian, Y.; Shi, G.; Wang, R. Ammoniaktoxicitet hos den gula havskatten (Pelteobagrus fulvidraco): Den mekanistiska insikten från fysiologisk avgiftning till förgiftning. Fisk Skaldjur Immunol. 2020, 102, 195–202. [CrossRef] [PubMed]
Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Handla för fler specifikationer:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
