Extraktion av fenyletanoidglykosider från Cistanche Tubulosa genom höghastighetsskjuvningshomogeniseringsextraktion

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei och Ruili Guo

Bakgrund:

Cistanche tubulosaär en välkänd traditionell kinesisk medicin med ursprung i Xinjiang. Den är allmänt spridd i norra Afrika, Indien, etc. Mål: Den huvudsakliga bioaktiva komponenten avC. tubulosaär fenyletanoidglykosider (PhGs). Echinakosid och akteosid är de indikativa komponenterna för bestämning av PhG och används främst för leverskydd, immunskydd etc. Därför är det mycket viktigt att extrahera PhG från C. tubulosa. Metoder: I denna studie jämfördes metoderna för ultraljudsassisterad extraktion (UAE), mikrovågsassisterad extraktion (MAE) och höghastighetsskjuvningshomogeniseringsextraktion (HSHE). Dessutom optimerades extraktionsförhållandena för HSHE-metoden. Resultat: Resultaten visade att HSHE-metoden var bättre än både UAE- och MAE-metoderna, och de optimala extraktionsparametrarna för HSHE var en etanolkoncentration på 50 procent, en extraktionstemperatur på 70 grader, en rotationshastighet på 16 000 rpm, en extraktionstid på 2 min, ett förhållande mellan fast substans och vätska på 1:9 och en extraktionscykel. Utbytet av echinakosid och akteosid var 1,366 respektive 0,519 procent, och överföringshastigheterna för echinakosid och akteosid nådde 87 respektive 94 procent. Slutsatser: Man kan dra slutsatsen att HSHE-metoden är en enkel, snabb och effektiv teknik för att extrahera PhG från C. tubulosa. Höjdpunkter: En effektiv och miljövänlig HSHE-metod har undersökts för extraktion av PhG från C. tubulosa. De optimala förhållandena för HSHE-metoden för extraktion av PhG från C. tubulosa erhölls. Denna forskning ger en ny metod för industriell utvinning av PhG frånC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaär en vanlig traditionell kinesisk medicin som har sitt ursprung i Xinjiang. Den är allmänt spridd i norra Afrika, Arabiska halvön, Pakistan och Indien och registrerades officiellt i den kinesiska farmakopén 2010. Den huvudsakliga bioaktiva komponenten iC. tubulosaär fenyletanoidglykosider (PhGs), en klass av vattenlösliga naturprodukter inklusive echinakosid, akteosid, isoakteosid och 2-acetylakteosid (1, 2). Strukturen hos PhGs består av kanelsyra- och hydroxifenyletyldelar, som båda är bundna till en -glukopyranos genom ester- respektive glykosidbindningar (3). Farmakologiska studier har visat att PhG från C. tubulosa har många medicinska funktioner, såsom antitrötthet (4), neuroprotektiva (5–7), leverskyddande (8–10) och immunskyddande effekter (11). Därför är effektiv extraktion av PhG från C. tubulosa av stor betydelse för utveckling och användning av naturliga produkter.

De nuvarande traditionella extraktionsmetoderna för PhG är het-refluxextraktion, ultraljudsassisterad extraktion (UAE) och mikrovågsassisterad extraktion (MAE; 12–16). Dessa metoder har olika nackdelar, såsom låg verkningsgrad, långa extraktionstider och höga kostnader. Jämfört med de traditionella metoderna är metoden för höghastighetsskjuvningshomogeniseringsextraktion (HSHE) en framväxande, ny extraktionsmetod och har fördelarna med snabbare extraktionstider, mindre lösningsmedelsavfall, högre utbyten, enklare anordning och enklare drift (17). Arbetsprincipen för HSHE-metoden är baserad på en roterande inre fräs som drivs av en höghastighetsmotor. En kraftfull skjuvkraft produceras av de inre och yttre skärarna för att störa och blanda proverna. Samtidigt orsakar skäraren med höghastighetsrotation tryckskillnader mellan skärarens inre och yttre kaviteter, vilket resulterar i en massöverföring mellan proverna och lösningsmedlen. Med kombinationen av hög skjuvkraft, kollisionskraft, tryck och andra krafter kan en löslig balans mellan fasta prover och lösningsmedel snabbt uppnås (18). Således kan extraktionsprocessen av HSHE slutföras på några minuter, och till och med så snabbt som dussintals sekunder (19–22).

Nyligen har HSHE utforskats i utvinning av bioaktiva komponenter från olika naturprodukter (23–25). Cheng et al. använde HSHE för att extrahera fem lignaner från frukten av Schisandra Chinensis (26). Resultaten visade att de optimala förhållandena var en etanolkoncentration på 75 procent, en extraktionstid på 1 min, ett förhållande mellan fast substans och vätska på 1:19, en extraktionsspänning på 180 V och en provpartikel storlek 120 mesh. Det totala utbytet av de fem lignanerna var 13,89 ± 0,014 mg/g under de optimerade betingelserna. Tang et al. använde HSHE för att få bioaktiv olja från perillafrön (27). De optimala förhållandena var en extraktionstid på 2 minuter, ett förhållande mellan fast substans och vätska på 1:10, en extraktionsspänning på 150 V och två extraktionscykler. Utbytet av perillafröolja nådde 59,3 procent. Ovanstående resultat indikerar att HSHE har fördelarna med korta extraktionstider, låga kostnader och höga utbyten. Det finns dock en brist på forskning om utvinning av PhGs av HSHE.

I den aktuella studien användes HSHE för att utforska dess potentiella tillämpning vid utvinning av PhG frånC. tubulosa. Utbytet av PhGs bestämdes med HPLC. De tre extraktionsmetoderna, HSHE, UAE och MAE, jämfördes under samma förhållanden. Effekterna av etanolkoncentration, extraktionstemperatur, rotationshastighet, extraktionstid, förhållande mellan fast substans och vätska och antalet extraktionscykler av utbytet undersöktes. För- och nackdelar med detta arbete och referenserna jämförs och diskuteras.

Material och metoder

Material och kemiska reagenser

C. tubulosaköptes från Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Kina). Standarderna för echinakosid (renheter större än eller lika med 98 procent) och akteosid (renheter större än eller lika med 98 procent) köptes från Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Acetonitril, metanol och ättiksyra var av HPLC-kvalitet (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanolen av analytisk kvalitet köptes från Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Kina). Avjoniserat vatten användes under hela experimenten.

HPLC-analys

En HPLC-analys utfördes på en Waters e2695 vätskekromatografi (Waters, Milford, MA) utrustad med en 2489 UV/Visible Detector och en Symmetry C18-kolonn (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 μm partikelstorlek. Koncentrationerna av echinakosid och acteosid analyserades med HPLC-metoden. Den mobila fasen bestod av (1) acetonitril och (2) en 2-procentig vattenlösning av isättika. Gradientelueringsprogrammet presenteras i tabell 1.

Den detekterade våglängden var 330 nm, flödeshastigheten var 1 ml/min, injektionsvolymen var 10 μL och ugnstemperaturen var inställd på 30 grader. Den kromatografiska toppen för analyten bekräftades genom att jämföra dess retentionstid med den för standarderna. Kvantifiering utfördes genom att integrera toppen med användning av en extern standardmetod.

Precisionstestet utfördes genom att injicera samma extraktionsprov fem gånger. För stabilitetstestet analyserades samma prover i steg om 0, 1, 2, 4, 12, 24 och 48 timmar. Återvinningstesterna av echinakosid och acteosid utfördes genom att tillsätta standarderna i extraktionsproverna. Alla toppareor och retentionstider för echinakosid och acteosid registrerades. Resultaten av kalibreringskurvorna för echinakosid och akteosid listas i tabell 2.

Beräkning av avkastningen

Echinakosid och acteosid användes som indikativa komponenter för bestämning av PhGs. Utbytet av echinakosid eller akteosid beräknades med hjälp av följande ekvation:

Y=CV/B×100 procent (1)

där Y=utbyte av echinakosid eller akteosid (procent); C=koncentrationer av echinakosid eller akteosid (mg/ml); V=volym av extraktionslösningen (ml); och W=vikt av C. tubulosa-pulvret (mg).

Extraktionsmetoder för PhGs

Stjälkarna av C. tubulosa maldes först med en elektrisk kvarn (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Kina) och filtrerades med en filtersikt (ungefär 380 μm). Sedan torkades C. tubulosa-pulvret i ugnen vid 70 grader tills vikten var konstant. Fem gram C. tubulosa-pulver blandades med extraktionslösningsmedlet och placerades i en extraktionsflaska. Därefter förvärmdes den flytande blandningen (30–80 grader) i 5 minuter i ett vattenbad med konstant temperatur (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Kina).

(a) HSHE-metoden.—HSHE utfördes av ett FA25-system (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, Kina), som bestod av den roterande fräsen, höghastighetsmotorn och styrenheten. Den inre skärarens rotationshastighet reglerades i intervallet 10000–28000 rpm, och extraktionstiderna justerades i intervallet 2–15 min.

(b) UAE-metoden. – Fem gram torkat prov och 300 ml metanol vägdes noggrant och tillsattes i en extraktionsflaska. Extraktionsflaskan nedsänktes i ett ultraljudsbad och utfördes vid en ultraljudseffekt av 300 W under 10 min. Extraktionstemperaturen var inställd på 30 grader.

(c) MAE-metod.—Fem gram torkat prov och 300 ml metanol vägdes noggrant och tillsattes i en extraktionsflaska. Extraktionsflaskan placerades i mikrovågsreaktorn och utfördes vid 180 W under 10 min. Extraktionstemperaturen var inställd på 30 grader.

HSHE-metoden jämfördes med UAE- och MAE-metoderna med samma extraktionslösningsmedel, extraktionstid, extraktionstemperatur, fast-till-vätska-förhållande och extraktionscykelnummer. Extraktionslösningen filtrerades av ett 0.22 μm membran och analyserades via HPLC för att bestämma koncentrationerna av echinakosid och acteosid. Alla extraktionsprocesser upprepades tre gånger

Fastställande av överföringssatser

Baserat på standardmetoden i 2015 China Pharmacopoeia, bestämdes echinakosid- och acteosidinnehållet i C. tubulosa-pulver (28). Ett gram C. tubulosa-pulver och 50 ml 50 procent metanol vägdes noggrant och sattes till en 50 ml brun mätkolv. Den flytande blandningen vägdes och blötlades i 30 min. Därefter nedsänktes den bruna mätkolven i ett ultraljudsbad och utfördes vid en ultraljudseffekt på 250 W och en frekvens på 35 kHz under 40 min. Den flytande blandningen vägdes på nytt och 50% metanol tillsattes för att tillföra lösningsmedelsförlust. Extraktionslösningen filtrerades av ett 0,22 μm membran och analyserades med HPLC för att bestämma koncentrationerna av echinakosid och acteosid. Extraktionsprocesserna upprepades tre gånger.

Överföringshastigheterna för echinakosid eller akteosid beräknades med hjälp av följande ekvation:

X= M1/M2 ×100 procent (2)

där X=överföringshastighet för echinakosid eller akteosid (procent); M1=kvalitet av echinakosid eller akteosid i extraktet (mg); och M2 =-kvalitet av echinakosid eller akteosid i C. tubulosa-pulver (mg).

Resultat och diskussion

Validering av HPLC-metoden

HPLC-profilerna för echinakosid och acteosid från C. tubulosa med användning av HSHE visas i figur 1. RSD för toppareorna för echinakosid och acteosid var 1,89 respektive 1,4 0 procent. Resultaten visade att HPLC-metoden har god precision i den kvantitativa analysen av echinacosiden och acteosiden. Vid olika tidpunkter (0–48 timmar) var RSD-värdena för toppareorna för echinakosid och acteosid 1,71 respektive 1,70 procent, vilket indikerar att provet var stabilt under 48 timmar. Återvinningen av echinakosid och acteosid var 99,3 respektive 99,1 procent och deras RSD var 0,70 respektive 0,67 procent, vilket bekräftade HPLC-metodens tillförlitlighet.

Jämförelse av de olika extraktionsmetoderna

En jämförelse av HSHE-metoden med MAE- och UAE-metoderna avseende utbyten av echinakosid och acteosid utfördes, vars resultat visas i figur 2. Det observerades att utbytena av echinakosid och acteosid som erhölls med HSHE var högre än de som erhölls av både MAE och UAE. Jämfört med MAE var utbytena av echinakosid och acteosid erhållna av HSHE högre med 20,5 respektive 20,8 procent. Och jämfört med Förenade Arabemiraten var utbytena av echinakosid och akteosid erhållna av HSHE högre med 6,6 respektive 7,4 procent. Dessa resultat indikerar att HSHE avsevärt kan öka utbytet av PhGs.

Optimering av HSHE-metoden

Extraktionsparametrarna för PhGs av HSHE inkluderar etanolkoncentration, extraktionstemperatur, rotationshastighet, extraktionstid, förhållande mellan fast substans och vätska och antalet extraktionscykler (26, 29).

Effekt av etanolkoncentration på extraktion av PhGs

Etanolkoncentrationen är en viktig faktor som påverkar utbytet av PhG. Som visas i figur 3 undersöktes utbytena av echinakosid och acteosid från C. tubulosa under olika etanolkoncentrationer. Den avslöjade att utbytet av echinakosid ökade från 0 till 30 procent och sedan minskade från 30 till 90 procent med ökande etanolkoncentrationer. Utbytet av akteosid ökade från 0 till 70 procent och minskade sedan från 70 till 90 procent med ökande etanolkoncentrationer. När etanolkoncentrationen var 50 procent var summan av utbytena av echinakosid och akteosid på sitt maximum. De olika etanolkoncentrationerna har olika polariteter, vilket leder till olika lösligheter av echinakosid och akteosid. Den optimala etanolkoncentrationen var således 50 procent.

Effekt av rotationshastighet på utvinning av PhGs

Figur 5 visar effekterna av olika rotationshastigheter på utbytet av PhG. Utbytet av echinakosid och akteosid ökade med ökande rotationshastigheter. Ökningen av rotationshastigheten kan öka skjuvkraften hos den inre och yttre skäraren, vilket ökar utbytet av PhGs. Den optimala rotationshastigheten var 16000 rpm.

Effekt av extraktionstid på extraktion av PhGs

Utbytena av echinakosid och acteosid under de olika extraktionstiderna visas i figur 6. Utbytena av echinakosid och acteosid var stabila med ökande extraktionstider. Man kan därför dra slutsatsen att PhG kan extraheras fullständigt från C. tubulosa på 2 minuter, och den optimala extraktionstiden var 2 minuter.

Effekt av förhållandet mellan fast och vätska på utvinningen av PhG

Såsom visas i figur 7 diskuterades utbytena av echinakosid och akteosid under de olika förhållandena mellan fast substans och vätska. Utbytena av echinakosid och acteosid ökade från 1:3 till 1:9 och blev stabila från 1:9 till 1:24. Eftersom en liten mängd extraktionslösningsmedel inte helt kan lösa echinakosid och acteosid, reducerades massöverföringshastigheterna. Den överdrivna utvinningen av lösningsmedel orsakade onödigt avfall. Därför var det optimala förhållandet mellan fast substans och vätska 1:9.

Effekt av antalet extraktionscykler på extraktion av PhGs

Figur 8 visar att effekterna av ett antal extraktionscykler på utbytet av PhGs. Utbytena av echinakosid och acteosid ökade med det ökande antalet extraktionscykler. Emellertid ökade extraktionstiderna anmärkningsvärt med ökande extraktionscykler, och mer energi förbrukades. Det optimala antalet extraktionscykler var en.

Jämföra HSHE-metoden med andra extraktionsmetoder för att extrahera PhGs

Resultaten av HSHE-metoden i jämförelse med andra extraktionsmetoder för att extrahera PhG från C. tubulosa listas i tabell 3. HSHE är enklare och enklare än kopplingsmetoderna som den ultraljudsassisterade vattenhaltiga tvåfasextraktionen och ultraljudstekniken för mikrovågsextraktion metoder. Dessutom är extraktionstrycket för HSHE lägre än den trycksatta vätskeextraktionsmetoden, och driftsförhållandena för den förra är säkrare. Ännu viktigare är att det framgår av tabell 3 att HSHE visar den kortaste extraktionstiden och den minsta lösningsmedelsförbrukningen bland alla extraktionsmetoder. Man kan dra slutsatsen att HSHE-metoden har många fördelar såsom hög effektivitet, milda driftsförhållanden, låga förbrukningsnivåer, enkel utrustning och enkel användning för utvinning av naturprodukter.

Slutsatser

I denna studie har en effektiv och miljövänlig HSHE-metod undersökts för extraktion av PhG från C. tubulosa. Jämfört med UAE- och MAE-metoderna ger den nya HSHE-metoden ett högre utbyte av PhG under samma förhållanden. Jämfört med MAE-metoden ökade utbytet av echinakosid och akteosid med 20,5 respektive 20,8 procent. Och jämfört med UAE ökade utbytet av echinakosid och akteosid med 6,6 respektive 7,4 procent. Extraktionsparametrarna för HSHE av PhG från C. tubulosa optimerades. Under de optimerade parametrarna nådde utbytet av echinakosid och acteosid 1,366 respektive 0,519 procent, och överföringshastigheterna för echinakosid och acteosid nådde 87 respektive 94 procent. HSHE-metoden har fördelarna med hög effektivitet, milda driftsförhållanden, låga förbrukningsnivåer, enkel utrustning, enkel användning och låga kostnader. Denna forskning ger en ny metod för industriell extraktion av PhG från C. tubulosa.