Favonoid- och fyto-oxylipinsvar i granatäppleblad (Punica Granatum L.) Del 2
Mar 26, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
1: Lipider omvandlades till fria fettsyror och fyto-oxylipiner i MeJA-behandlade granatäppleblad
Förutom flavonoider och antocyaniner, var förändringar i lipidmolekyler också uppenbara i granatäppleblad vid 72-h efter MeJA-induktion (Fig. 5a). Av de 102 differentiellt ackumulerade metaboliterna var 23 lipider, fettsyror eller fyto-oxylipiner (tabell S6). Till skillnad från monoacylglycerol (MAG)(18:4)isomer 1 som visade ökad ackumulering, sju glycerolipider, inklusive MAG(18: 1)isomer, MAG (18:3)isomer4,galaktosylmonoacylglycerol (DGMG)(18:2)isomer,DGMG(18:2)isomer2,DGMG(18:2)iso-mer3,monogalaktosylmonoacylglycerol(MGMG)(18:2)isomerer och MGMG(18:2)isomer2 minskade med 3-5 veck när MeJA applicerades på bladen (Fig. 5a; Tabell S6). Fosfolipiderna LysoPC 18: 0 och 18:1 uppvisade en över tvåfaldig ökning av MeJA-behandlade löv (tabell S6).
Exogen MeJA-applicering höjde nivåerna av JA och isoleucin (JA-Ile) med 4.3-faldigt respektive 2.8-faldigt i granatäppleblad (tabell S6). Olika icke-JAFyto-oxylipinerinklusive fettsyrahydroperoxider, epoxifettsyror, hydroxifettsyror, ketofettsyror ochacetyleniskfettsyror, särskilt ökade i MeJA-behandlade blad (Fig.5a; Tabell S6). Förbättrad ackumulering av punicinsyra, en PUFA (18:3) som finns rikligt i granatäpplefröolja, observerades också i blad behandlade med MeJA (tabell S6).
Fig. 3 Flavonoid- och antocyaninnivåer ändradesmetyljasmonate (MeJA) applikation. Metaboliter med ökad, minskad och icke-signifikant förändrad ackumulering (tvåfaldigt tröskelvärde) i MeJA-behandlade granatäppleblad jämfört med skenbehandlade kontroller, skördade 72-h efter behandling, är färgade i grönt, rött, och blå, respektive. Vätskemellanprodukter som inte detekterades i vätskekromatografi-elektrosprayjoniseringstandemmasspektrometrianalysen visas i svart. Streckade pilar indikerar flera reaktionssteg.
2: Biokemisk karakterisering av en kandidat LOX för fettsyramodifiering i MeJA-behandlade granatäppleblad
För att utforska metaboliska gener som är involverade i växlingen av fettsyrametabolism mot fyto-oxylipiner, analyserades transkriptom av sken- och MeJA-behandlade granatäppleblad med avseende på DEG som är annoterade som lipaser eller LOX. Två lipasgener Pgr004895 och Pgr001125 visade förbättrat uttryck i 24-h post-MeJA-behandlingstranskriptomerna och bekräftades för signifikant ökat uttryck genom qPCR-analys i realtid (Fig.5b). Å andra sidan visade lipaset Pgr024441 minskat uttryck i transkriptomanalysen, vilket inte stöddes av realtids-qPCR-resultatet (Fig. 5b). Intressant nog observerades förhöjt uttryck av Pgr025417, en förmodad LOX, i transkriptom av löv som samlats in vid 2-h, 6-h,24-h och 72-h efter MeJA-behandling (Fig. S1). Realtids-qPCR-analys indikerade vidare ett kontinuerligt ökat uttryck av Pgr025417, från 4-till 20-faldigt, i löv som samlats in från 2 till 72-h efter MeJA-behandling (Fig.5c).
Cistanche kan förbättra immuniteten
För att avgöra om den förmodade LOX (Pgr025417) var involverad i den ökade fyto-oxylipinproduktionen i MeJA-behandlade blad, undersöktes dess sekvens och aktivitet. När aminosyrasekvensen för Pgr025417 analyserades, hittades His-, Asn- och Ile-rester som motsvarar de som koordinerar järnatomen vid det aktiva stället för sojabönan LOX L-1(Minor et al.1996) i Pgr025417(Fig. 6a). Dessutom förutsägs PgrO25417 vara lokaliserad till kloroplasten (sannolikhet 0,9096) med signalpeptiden klyvd mellan 64 och 65 aa (Fig. 6a). Bland de 11 förmodade LOX (786 aa till 970 aa) som identifierats i det kommenterade granatäpple-genomet, förutspås 5 andra LOX: Pgr025413, Pgr025418, Pgr009839, Pgr016852 och Pgr013780 vara kännetecknade av andra växter av typ 4 växter och PGR013780 med andra kloroside 2- och 4-klor0-sid POX-grupp. (Fig. 6b). Intressant nog, medan Pgr008562, Pgr025678, Pgr018982 och PgrO18980 är klustrade med tvåhjärtbladiga typ I LOX. Pgr020032 är mer avlägset besläktad med den andra typen av ILOX (Fig. 6b). För att bestämma den enzymatiska aktiviteten hos PgrO25417 analyserades det rekombinanta proteinet (906 aa, ~102 kDa; Fig. 6c) med användning av linolsyra som substrat. Oxiderade produkter av linolsyra producerades av Pgr025417, vilket visades genom en större absorption vid 598 nm när ökade mängder rekombinant protein var närvarande i reaktionsblandningen (fig. 6d).
3: Transkriptionssvar på exogen MeJA-applicering i granatäppleblad
To understand whether the changes in HTs,flavonoids, lipids, fatty acids, and phyto-oxylipins are regulated transcription-ally, transcriptomes of MeJA-and mock-treated pomegranate leaves collected at2-h,6-h,24-h,and72-h were compared and identified 34 transcription factors(TFs) that showed differen-tial expression (Log,FCl>1, justerad P<0.05)(table 1);31="" of="" these="" tfs="" also="" exhibited="" significantly="" changed="" expression="" by="" real-time="" qpcr="" analysis="" (fig.7).="" notably,="" a="" zinc-finger="" tf="" pgr009895="" showed="" increased="" expression="" at="" three="" out="" of="" the="" four="" time="" points(2-h,24-h,and="" 72-h)(fig.7a).the="" expression="" of="" pgr002863(pcf5-like),pgr002859(bzip1)and="" pgr006935(auxin="" response="" factor)was="" increased,="" and="" pgro11269="" (myb)="" decreased="" upon="" meja="" elicitation="" at="" two="" time="" points(fig.="" 7a,="" b).both="" pgro09366(anthocyanin="" regu-latory="" c1="" protein/myb)and="" pgro03015(myb)displayed="" increased="" expression="" at="" 6-h,="" but="" decreased="" expression="" at="" 72-h="" (fig.="" 7b).the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" enhanced="" at="" only="" one="" time="" point,including="" pgr009357(2-h),pgr027831="" (2-h),pgr023581(6-h),pgr009363(6-h),pgr000147="" (6-h),="" pgr021507(6-h),="" pgr021504(6-h),pgr020147(24-h),="" pgr025715(72-h),pgr023629(72-h),pgr015728(72-h),and="" pgr004388(72-h)(table="" 1;fig.7b,c).on="" the="" other="" hand,="" the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" suppressed="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leaves="" at="" one="" time="" point,="" including="" pgr013499="" (2-h),pgr023409="" (2-h),pgr017106(6-h),pgr010911(24-h),pgr017568(72-h),pgr024750(72-h),pgr004878(72-h)pgr002084(72-h),pgr008889(72-h),pgr004532(72-h),="" pgr020131="" (72-h),and="">
För att bedöma den transkriptionella regleringen av kandidatgener som kan fungera i att modulera flavonoid- och fettsyra-/fyto-oxylipin-vägar vid MeJA-induktion, förutspåddes TF-bindningsställen i promotorregionerna av kandidatgenerna med hjälp av PlantRegMap (Tian et al. 2020) med TF: er bioinformatiskt identifierade från Eucalyptus Grandis, som är nära besläktad med granatäpple i Myrtales (tabell S7). För PgrO25417 (förmodad LOX) identifierades 80 bindningsställen av 65 TFs, inklusive rikliga bindningsställen för MYB (10 TFs.15 platser) och WRKY (11 TFs, 18 platser), men utan bindningsställen för bipolära zinkfinger-TF:er (tabell S7). Eftersom CHS och CHI är placerade vid ingångspunkten för flavonoid- och antocyaninbiosyntetiska vägar och visade minskat genuttryck i transkriptom- och realtids-qPCR-analyser (fig. S1 och 4), promotorerna för förmodade CHS(Pgr005566) och CHI(Pgr025966) analyserades också med avseende på förmodade TF-bindningsställen. För CHS finns det 104 bindningsställen av 76 TFs, med MYB (20 TFs, 23 platser) och LH (13 TFs, 23 platser) som är de vanligaste TFs (tabell S7). För CHI finns det 93 bindningsställen av 78 TFs, med bHLH (16 TFs, 23 platser) och WRKY (13 TFs, 13 platser) är de vanligaste TFs (tabell S7).
4. Diskussion
Unika metaboliska förändringar inducerade av exogen MeJA-applikation tyder på funktioner hos HT, metylerade flavoner/flavonoler och fyto-oxylipiner i granatäpplesvar på MeJA.
MeJA har en påvisad roll i att framkalla stressreaktioner hos växter (Cheong och Choi 2003). Ackumuleringen av två HT-vägintermediärer -glukogallin och Penta-galloylglukos i bladen inducerades vid 30-h efter MeJA-applicering (Fig.2b), vilket tyder på att de verkar som svar på abiotiska och biotiska påfrestningar i miljön. Detta resultat bekräftar också HTs funktion för att skydda granatäpple från abiotiska påfrestningar i vävnaden av fruktskal (Schwartz et al.2009; Habashi et al.2019). Motsvarande ökningen av ackumulering av HT-metabolit, visade shikimat- och HT-biosyntetiska väggener också ökat uttryck (Fig. 1). Tidigare biokemisk karakterisering av fyra vinrankor (Vitis vinifera) SDH-isoformer indikerade att endast VvSDH3 och VySDH4 kunde producera gallsyra från 3-dehydroshikimat (Bontpart et al. 2016). Enligt våra transkriptom- och realtids-qPCR-analyser, PgSDH3_1 och PgSDH3_2, uppvisade homologer av WvSDH3, men inte PgSDH4, en homolog av VSDH4, inducerat uttryck av MeJA (fig. S1 och 1) . Denna observation tyder på att PgSDH3_1 och PgSDH3_2 sannolikt är involverade i syntesen av HT som svar på MeJA-behandling och miljöpåfrestningar. Dessutom stödjer förstärkt uttryck av PgUGT8423 och PgUGT84A24, som kodar för enzymer som katalyserar det engagerade steget av HT-biosyntes, genom MeJA-applikation ytterligare rollen av HT i stressrespons.
Vid 72-h efter MeJA-induktion hittades ett övergripande undertryckande av flavonoider och antocyaniner i granatäppleblad (Fig.3; Tabell S6), vilket strider mot den ökade ackumuleringen av dessa föreningar som observerats i många andra växter (Pandey et al. al.2016; De Geyter et al.2012; Shafiq et al.2011; Flores och Ruiz del Castillo 2014; Portu et al. 2015). Tre metylerade flavoner och flavanoler: di-O-metylquercetin, säljande 5-O-hexosid och kryso-riol O-hexosyl-O-hexosid ackumulerades på en högre nivå trots minskningen av icke-metylerade biosyntetiska prekursorer (Fig.3; Tabell S6). Mono- och di-O-metylerat quercetin utsöndras från trikomer av solanaceous arter och har föreslagits fungera i växtförsvar, möjligen på ett artspecifikt sätt (Wollenweber och Dörr 1995; Roda et al. 2003). Det visades också att glykosider av chrysoberyl, luteolin och apigenin avskräckte utfodring av vattenlevande växtätare på Potamogeton lucens (pondweed) blad in vitro-analyser (Erhard et al.2007). Den inducerade ackumuleringen av metyleradeflavoner/flavonoleri granatäppleblad tyder på att de kan spela en roll i MeJA-framkallad stressrespons och har implikationer för försvaret mot sårskador, patogener och växtätare i denna trädart.
Förutom HT, flavonoider och antocyaniner, inkluderade ytterligare anmärkningsvärda metaboliska förändringar mobiliseringen av fria fettsyror från lipider och biosyntesen av fytooxilipiner 72-h efter MeJA-applicering (Fig.5a). Den trefaldiga ökningen av punicinsyra(18:3, cis-9,trans-11, cis-13) vid MeJA-induktion antyder en potentiell roll för denna PUFA med ett trekonjugerat dubbelbindningssystem i stresssignalering eller direkt kemiskt försvar av granatäppleplantor (tabell S6). Den samtidiga minskningen av MAG, MGMG och DGMG tyder också på att punicinsyra vanligtvis kan konjugeras till dessa glycerolipider i granatäppleblad (Fig. 5a; Tabell S6). Av fyto-oxylipinerna kan ökningen av JA och JA-Ile i MeJA-behandlade granatäppleblad bero på demetylering av den exogent applicerade MeJA för att bilda JA, som därefter omvandlas till JA-Ile (tabell S6) (Stuhlfelder et al. .2004). Det kan också tyda på att MeJA direkt kan reglera biosyntesen av JA och dess derivat i granatäpple. Flyktiga föreningar som härrör från fyto-oxylipiner rapporteras vara involverade i signalering av svar på sår- och patogenattacker (Lim et al.2017). Nyligen genomförda studier har också avslöjat direkta antimikrobiella roller för icke-JA Fyto-oxylipiner, även om den mekanistiska grunden för sådana funktioner fortfarande är oklar (Deboever et al. 2020). Den inducerbara produktionen av fyto-oxylipiner i granatäpple bekräftar tidigare observationer i andra växter. Det återstår att bestämma om dessa fyto-oxylipiner är biocida eller fungerar för att stimulera ett medfött immunsvar i granatäpple.
Den modifierade flavonoid- och antocyanin-, men inte fyto-oxylipin-metabolismen vid MeJA-induktion är åtminstone delvis reglerad på transkriptionsnivån
I överensstämmelse med den generellt minskade ackumuleringen av flavonoider och antocyaniner, gener som kodar för CHS och CHI, visade två enzymer placerade vid ingångspunkten för flavonoid- och antocyaninbiosyntesen minskat uttryck i MeJA-behandlade blad (Fig.4). Spännande nog var att en granatäpplehomolog(PgrO09366) av majs MYB TF antocyaninreglerande protein C1 initialt uppreglerades i MeJA-behandlade blad vid 6-h men sedan nedreglerades i MeJA-behandlade blad vid 72-h(Tabell 1) Fig. 7b). En granatäpplehomolog (PgrO10911) av majsen MYB TF P nedreglerades i MeJA-behandlade blad vid 24-h (tabell 1; Fig.7c). Som visats i studier på majs aktiverar Cl flera gener i flavonoid- och antocyaninbiosyntes, såsom CHS(C2), dihydroflavonolreduktas(A1), antocyanidin 3-O-glukosyltransferas(BZ1) och leukoanthocyani-din dioxygenas( A2) (Lesnick och Chandler 1998; Sainz et al. 1997; Quattrocchio et al. 1993). P, å andra sidan, kontrollerar uttrycket av A1, men inte BZ1 (Grotewold et al. 1994). I majs arbetar C1 (MYB TF) tillsammans med R(bHLH TF) för att reglera uttrycket av biosyntetiska gener för antocyanin( Mol et al. 1998; Goff et al. 1992). Pgr024750, en bHLH TF, nedreglerades också i MeJA-behandlade löv vid 72-h och kunde vara en potentiell partner till granatäpple C1-homologen (tabell 1; Fig.7c). Vidare identifierades bindningsställen för MYB och bHLH TFs i promotorregionerna för förmodade granatäpple CHS och CHI genom bioinformatikanalys (tabell S7). Sammantaget tyder dessa resultat på att den totala minskningen av flavonoider och antocyaniner åtminstone delvis uppnås genom transkriptionell kontroll av de biosyntetiska generna i tidiga steg.
En minskning av flera glycerolipider observerades i MeJA-behandlade blad (Fig. 5). Granatäpplehomologer (GenBank-accessionsnummer: XP_031374952 och XP_031374953) av Arabidopsis Wrinkled1 (ArWRI1), en TF från APETALA2(AP2)-familjen som anses vara en "master"-regulator för växtlipidbiosyntes (Cernac och Benning 2004), uttryckt på liknande sätt i mock- och MeJA-behandlade löv (data visas inte). Funktionell karakterisering av TF: er som svarar på MeJA-induktion (tabell 1; Fig. 7) skulle potentiellt kunna avslöja en reglerande roll för lipidmetabolism i granatäppleblad.
Granatäpplet LOX(Pgr025417) med kontinuerligt ökat uttryck efter exogen MeJA-applicering, katalyserade fettsyraoxidation och förutspåddes lokaliseras till kloroplasten (fig. 5c och 6). Därför är Pgr025417 troligen involverad i JA-biosyntes som äger rum i detta subcellulära utrymme (Fig. 6). Av de 11 förmodade LOX i granatäpple är 5 cytosoliska (typ I) och 6 är kloroplastiska (typ II) (Fig. 6b). Eftersom icke-JA Fyto-oxylipiner syntetiseras i cytosolen (Ponce de Le6n et al.2015), kan en eller flera av typen ILOX vara ansvariga för att omvandla PUFA till icke-JA Fyto-oxylipiner vid MeJA-induktion. Med tanke på att LOX(Pgr025417) med en ihållande ökning av genuttryck i MeJA-behandlade löv är lokaliserad i ett subcellulärt fack som skiljer sig från icke-JA fyto-oxylipiner, är enzymerna som ansvarar för att producera MeJA-inducerade icke-JA-fyto-oxylipiner sannolikt inte modulerad transkriptionellt.
Exogen MeJA-applikation inducerade transkriptionssvar i granatäppleblad
En nyligen genomförd studie i Arabidopsis avslöjade att ett komplext regulatoriskt nätverk berikat med MYC(bHLH), etylenresponsfaktor (ERF) och MYB-familjen TFs var involverat i det tidiga MeJA-inducerade transkriptionssvaret (Hickman et al. 2017). Granatäpplehomologer av ERF TFs, inklusive Pgr013499(2-h),PgrO00147(6-h), och PgrO21504 (6-h), och homologer av MYB TFs, inklusive PgrO09357 (2-h) ),Pgr009366(6-h),Pgr003015(6-h), och Pgr011269 (6-h), var bland TF:erna med varierat uttryck i MeJA-behandlade löv som samlades in vid tidiga tidpunkter (Tabell 1; Fig. 7). Som diskuterats ovan visade granatäpplehomologer av majsflavonoid- och antocyaninregulatoriska proteiner C1 och P (MYB TFs), och en bHLH-TF minskat uttryck och kunde potentiellt kontrollera den totala minskningen av flavonoider och antocyaniner. Dessutom innehåller promotorregionen för LOX (PgrO25417) bindningsställen för WRKY, MYB och bZIP TFs (tabell S7), vilket tyder på att de skulle kunna regleras av de differentiellt uttryckta TF:er som tillhör dessa TF-familjer som svar på MeJA-ansökan .
5: Jämförande genuttryck och metabolitanalys av MeJA-behandlade löv underlättar förhöret av olika fenoliska vägar i frukter
Att förstå metaboliska och transkriptionella svar från granatäppleblad på MeJA-applikation är helt klart relevant för att förbättra växthälsa och produktivitet (dvs. fruktproduktion). Dessutom ger det jämförande genuttrycket och metabolitanalysen av MeJA-behandlade löv också en möjlighet att belysa regleringen av HT-, flavonoid- och antocyaninvägar som finns i både blad- och fruktvävnader (Bar-Ya'akov et al.2019) ). De fenoliska föreningarna HTs, flavonoider och antocyaniner bidrar i hög grad till de hälsofrämjande aktiviteterna hos granatäpplefrukter, men kontrollen av deras produktion och ackumulering har inte undersökts i granatäpple (för flavonoider och antocyaniner) eller någon växtart (för HTs) ). Till exempel, tidigare studier på MeJA-applicerade granatäpplefrukter bestämde nivåerna av antocyaniner och flavonoider i frukter efter skörd, utan att undersöka uttrycket av strukturella eller regulatoriska gener relaterade till dessa metaboliter (Koushesh Saba och Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020 ). Å andra sidan avslöjade den aktuella studien TFs (t.ex. MYB TFs) som visade differentiellt uttryck i MeJA- och skenbehandlade löv med uttrycksmönster som liknar de för HT-, flavonoid- och antocyaninbiosyntetiska gener (Fig. 7; Tabell 1) . Dessa TF: er är potentiellt involverade i regleringen av HT-, flavonoid- och antocyaninvägar vilket motiverar ytterligare undersökning i framtiden.
Det är värt att notera att vår studie avslöjade en specifik ökning av metylerade flavonoider och generella minskningar av andra flavonoider i granatäppleblad behandlade med MeJA, vilket tyder på en potentiell roll för metylerade flavonoider för att försvara granatäppleblad mot patogener (Fig. 3; Tabell S6). Den tidigare rapporten om granatäpplefrukter behandlade med MeJA visade förbättrad flavonoidackumulering, även om endast det totala flavonoidinnehållet bestämdes utan att kvantifiera individuella flavonoidmolekyler (Koushesh Saba och Zarei 2019). Som sådan behövs en mer djupgående analys av granatäpplefrukter behandlade med MeJA för att möjliggöra en sida vid sida jämförelse av flavonoidförändringar i blad- och fruktvävnader. I motsats till ökade antocyaniner i granatäpplefrukter efter MeJA-applicering (Garcia-Pastor et al.2020), minskade nivån av antocyaniner i MeJA-behandlade blad (Fig.3; Tabell S6). Denna skillnad kan bero på de distinkta roller som antocyaniner spelar i blad- och fruktvävnader vid patogenattacker. Faktum är att den differentiella ackumuleringen av antocyaniner i blad och frukter understryker behovet av att undersöka MeJA-svar i olika granatäpplevävnader.
6: Avslutande kommentarer
Vår studie avslöjade unika metaboliska förändringar i HTs, flavonoider, antocyaniner och fyto-oxylipiner i granatäppleblad utlösta av exogen MeJA-applikation. Transkriptom- och biokemiska analyser antydde att även om undertryckande av flera flavonoider och antocyaniner förekommer åtminstone delvis på transkriptionsnivå, är ökad biosyntes av icke-JA-fytooxilipiner sannolikt inte kontrollerad transkriptionellt. Detta arbete inleder ytterligare undersökningar om den regulatoriska arkitekturen av HT-, flavonoid- och antocyaninmetabolism, orkestreringen av metaboliska svar i granatäppleblad till MeJA-applikation, såväl som den roll som metaboliter med inducerad ackumulering spelar i signalering och/eller direkt kemiskt försvar.
Författarbidrag uttalande LC och LT skapade studien. LC och WS utförde experiment. LC, WS och LT analyserade data. LC, WS och LT skrev manuskriptet. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.
Tilläggsinformation Onlineversionen innehåller kompletterande material tillgängligt på https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9.
Tack Vi tackar kollegor vid Panzhihua Academy of Agricultural and Forestry Sciences för att de försett oss med granatäpplefrön som används i denna studie. Vi tackar också Dr. Binjie Ge vid Shanghai Chenshans botaniska trädgård för hjälp med identifiering och registrering av kupongexemplaret.
Finansiering Detta arbete stöddes av vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghais kommun under anslag 14DZ2260400 och Special Fund for Scientific Research av Shanghai Landscaping and City Appearance Administrative Bureau under anslag G172403 och G182403.
Tillgänglighet av data och material De transkriptomdatauppsättningar som genereras och analyseras under den aktuella studien finns tillgängliga i Sequence Read Archive (SRA) vid NCBI under accessionsnumret PRJNA600139., Metabolitprofileringsdataseten som genereras och analyseras under den aktuella studien ingår i denna publicerade artikeln och dess tilläggsfiler.
Den här artikeln är extraherad från Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9
