Bestämning av fem komponenter i Rehmannia Glutinosa och fastställande av HPLC-fingeravtryck

Abstrakt:Metoden för bestämning av innehållet i fem komponenter iRehmannia glutinosa, nämligenrehmannoside D, leonurin,echinakosid,cistancheside Aochverbascoside, etablerades, och högpresterande vätskekromatografi (HPLC) fingeravtryck av Rehmannia glutinosa etablerades för att tillhandahålla en vetenskaplig grund för kvalitetskontrollen av Rehmannia glutinosa. Shiseido CAPCELL PAK C18-kolonnen användes, med acetonitril-0,1 % myrsyralösning som mobil fas, gradienteluering, kolonntemperatur på 30 grader, variabel våglängdsbestämning och flödeshastighet på 1,0 ml/min. HPLC-fingeravtrycket för Rehmannia glutinosa analyserades av "Kinesisk medicin kromatografiskt fingeravtryckslikhet utvärderingssystem (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), RSD för precisionstest, repeterbarhetstest och stabilitetstest var 0.12%~1.58%, och den genomsnittliga provåtervinningshastigheten var 96.5% ~98,6%; det etablerade Rehmannia glutinosa HPLC-fingeravtrycket identifierade 23 vanliga toppar, och likheten mellan Rehmannia glutinosa-provet och kontrollfingeravtrycket var 0.904~0,950. Resultaten tyder på att den etablerade innehållsbestämningsmetoden och HPLC-fingeravtrycket är lämpliga för utvärdering av Rehmannia glutinosa kvalitet och identifiering av rå Rehmannia glutinosa och kokt Rehmannia glutinosa, med hög noggrannhet och god reproducerbarhet, och kan ge tekniskt stöd för kvalitetskontroll av Rehmannia glutinosa medicinska material.

Nyckelord:Rehmannia glutinosa; innehållsbestämning; fingeravtryck; kvalitetsutvärdering

NY Ört CISTANCHE MEDECHINACOSIDA,CISTANCHESIDE AOCHVERBASCOSIDE

Rehmannia glutinosaär den färska eller torkade rotknölen från Scrophulariaceae-växten Rehmannia glutinosa Libosch. På grund av olika bearbetningsmetoder är den huvudsakligen uppdelad i färsk rehmannia, rå rehmannia och kokt rehmannia [1-2]. De huvudsakliga produktionsområdena är Henan, Shanxi, Shaanxi, etc. mark. Bland dem har rå rehmannia glutinosa effekterna att rensa bort värme och kyla blod, ge näring till yin och främja vätskeproduktion, och används främst för att behandla värme i blodet, varma gifter och fläckar, etc.; kokt rehmannia glutinosa ger näring till blod och yin, fyller på essens och fyller på märg, och används främst för att behandla blodbrist, kloros, etc. Hjärtklappning, rastlöshet, etc.[1-2]. De två har olika egenskaper och smaker, men båda tillhör lever- och njurmeridianerna. Rehmannia glutinosa innehåller komplexa kemiska komponenter, huvudsakligen inklusive iridoider, jononer, fenyletanolglykosider, flavonoider, etc. [3-5].

Efter att Rehmannia glutinosa har bearbetats med olika bearbetningsmetoder, varierar typerna, innehållet och proportionerna av kemiska komponenter i varje bearbetad produkt mycket, vilket resulterar i betydande skillnader i dess farmakologiska aktivitet [6-10]. enligt

Relaterade studier[11-12] visar att i processen där Rehmannia glutinosa ändras från "rå" till "kokt", minskade innehållet av kemiska komponenter som catalpol, moderört, stachyos och aminosyror avsevärt, och innehållet av fruktos, 5-hydroximetylfurfural, etc. Innehållet av , isorebaskosid, etc. ökade signifikant. För närvarande använder kvalitetskontrollen av rå och kokt rehmannia glutinosa huvudsakligen innehållet av catalpol och rehmanniaside D som utvärderingsindikatorer. Utvärderingssystemets indikatorer är relativt enkla, vilket gör det svårt att heltäckande kontrollera kvaliteten på rehmannia glutinosa. Dessutom har studier visat att innehållet av rehmannia glutinosa D förändras före och efter bearbetning. Den är liten och har dålig specificitet när det gäller att karakterisera sammansättningsförändringarna efter bearbetning och graden av bearbetning [12-13].

Därför, för att utvärdera kvaliteten på Rehmannia glutinosa mer omfattande, etablerade denna studie sambandet mellan rehmanniaside D och Yimu i Rehmannia glutinosa.

Bestämningsmetoder för innehållet av fem vanliga komponenter, inklusive glukosid, echinaceaside, cistankeosid A och verbascoside, och etablerade ett HPLC-fingeravtryck av Rehmannia glutinosa för att analysera innehållet av huvudkomponenterna i Rehmannia glutinosa från olika produktionsområden och före och efter bearbetning, för att tillhandahålla information för kvalitetskontroll av Rehmannia glutinosa. Teknisk support.

Instrument, reagens och testläkemedel

Agilent 1260 högpresterande vätskekromatograf (detektor är en diodgrupp); elektronisk analytisk balans med variabelt intervall (METTLER TOLEDO); digital ultraljudsrengörare (Shanghai Ultrasonic Instrument Factory, KH-500DE). Metanol (Sinopharm Group) är analytisk kvalitet; acetonitril (Merck) är av kromatografisk kvalitet; vatten är Watsons vatten på flaska. Rehmannia glutinosa D referensämne (batchnummer RFSD8401909016, renhet 98,0 %), leonurus glykosid referensämne (batchnummer RFS-Y22002208010, renhet 98,0 %) och cistancheside A referensämne (batch) nummer RFS-R05002009014, renhet 96,0 %) köptes alla från Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd.; echinacoside-referenssubstans (batchnummer 111670-201907, renhet 91,8 %) och verbascoside-referenssubstans (batchnummer 11530-201914, renhet 95,2 %) köptes alla från China Food and Drug Inspection Institutes. Rehmannia-prover (SX1~SX4, HN1 och HN2) samlades från olika produktionsområden (se tabell 1), av vilka SX4 och HN2 ångades av SX1 respektive HN1, och SX2 och SX3 samlades in från samma produktionsområde. Alla prover identifierades som autentiska av Song Pingshun, chefsläkare för kinesisk medicin vid Gansu Provincial Institute of Drug Control.

Tabell 1 Information om sperma från Rehmanniae-prover

2.1 Kromatografiska förhållanden

Kolonnen Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm×4,6 mm, 5 μm) användes, acetonitril användes som mobil fas A och 0,1 % myrsyralösning användes som mobil fas B Gradientelueringsbetingelserna var: 0-3 min, 1%A; 3-9 min, 1%A→5%A; 9-24 min, 5%A→35%A; 24-35 min, 35%A→65%A; 35-40 min, 65 %A→90 %A. Variabel våglängdsdetektion (0-24 min, 203 nm; 24-40 min, 330 nm). Injektionsvolymen var 15 μL av referenslösningen och 20 μL av provlösningen.

2.2 Beredning av lösning

2.2.1 Beredning av referenslösning

Ta lämpliga mängder av ovanstående fem referensämnen, tillsätt 70% metanol för att framställa en blandad referenslösning med en masskoncentration på 0,4 mg/ml.

2.2.2 Beredning av testlösning

Väg ca 1,0 g Rehmannia-pulver (passerat genom sikt nr 2), väg noggrant, lägg i en konisk kolv med propp, tillsätt noggrant 25 mL 70 % metanol, försegla, väg, ultraljudsbehandla (effekt 300) W, frekvens 50 kHz) i 30 minuter, låt den svalna till rumstemperatur, väg igen, fyll på den förlorade massan med 70 % metanol, filtrera och ta filtratet för att erhålla.

2.3 Metodologisk utredning

2.3.1 Specificitetsutredning

Ta den blandade referenslösningen under "2.2.1" och testlösningen (prov SX1) under "2.2.2", och injicera och mät enligt de kromatografiska förhållandena under "2.1". Resultaten visar att kromatogrammet för Rehmannia-provet visar en kromatografisk topp med samma retentionstid som referensstandarderna för Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche deserticola A och Verbascoside (se figur 1), vilket indikerar att denna metod har stark specificitet.

2.3.2 Linjär sambandsundersökning

Tillsätt 70 % metanol till den blandade referenslösningen, späd 5 gånger, 10 gånger, 25 gånger, 50 gånger, 100 gånger respektive 250 gånger, och injicera och mät enligt de kromatografiska förhållandena under "2.1". Standardkurvorna ritades med masskoncentrationen för varje referens som den horisontella axeln (x) och motsvarande kromatografiska topparea som den vertikala axeln (y). Resultaten visas i tabell 2, vilket indikerar att varje komponent har ett bra linjärt samband inom motsvarande masskoncentrationsintervall.

1. rehmanniosid D; 2. leonurid; 3. echinakosid; 4. kastanosid A;5. akteosid

Figur 1 Kromatogram av specificitetsundersökning

Tabell 2 Linjärt samband mellan 5 komponenter i Semen Rehmanniae

2.3.3 Precisionsutredning

Ta testlösningen (prov SX1) under "2.2.2" och utför injektionstestet enligt de kromatografiska förhållandena under "2.1". Injicera provet 6 gånger kontinuerligt, registrera topparean för varje komponent och beräkna topparean RSD för rehmannia glutinosa D, moderörts glykosid, echinacea glykosid, cistanche glykosid A och verbascoside i testprovet till 0. 46 %, 0,12 %, 0,85 %, 0,48 % respektive 0,82 %, vilket indikerar att instrumentet har god precision.

2.3.4 Upprepningsstudie

Sex prover av samma Rehmannia-rotprov (SX1) preparerades parallellt enligt metoden i "2.2.2" och injicerades och bestämdes enligt de kromatografiska förhållandena i "2.1". RSD för innehållet av rehmannia rotglykosid D, moderörtsglykosid, echinaceaglykosid, cistancheglykosid A och verbascoside i de sex proverna var 0.46%, 0.69%, 1.42%, {{ 12}},48 % respektive 1,58 %, vilket indikerar att metoden har god repeterbarhet.

2.3.5 Stabilitetsstudie

Ta testlösningen (prov SX1) under "2.2.2" och injicera och mät enligt de kromatografiska förhållandena under "2.1" vid 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 1{{ 15}} h, 12 h, 18 h respektive 24 h. RSD för toppområdena för rehmannia glutinosa D, moderörtsglykosid, echinakosid, cistancheglykosid A och verbascoside var 0.94%, 1.04%, 0.73% , 0,83 % respektive 0,71 %, vilket indikerar att testlösningen har god stabilitet inom 24 timmar.

2.3.6 Provåtervinningshastighet

{{0}},5 g Rehmannia-rotprov (SX1) med känt innehåll av 5 komponenter vägdes noggrant in i en konisk kolv med propp, och 6 parallella portioner tillsattes och 5 referenslösningar med vissa koncentrationer tillsattes respektive. Proverna preparerades enligt metoden under "2.2.2", och proverna injicerades och mättes enligt de kromatografiska förhållandena under "2.1". Återvinningsgraden beräknades och resultaten visas i tabell 3. Den genomsnittliga provåtervinningsgraden för varje komponent var 96,5%~98,6% och RSD var 0,73%~1,52%, vilket indikerar att metoden har god noggrannhet.