Ganoderma Lucidum vattenextrakt som inducerar PHGPx för att hämma membranlipidhydroperoxider och reglera oxidativ stress baserat på encelligt djurtranskriptom

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

I detta experiment användes Tetrahymena thermophila som experimentmaterial. T. thermophila är ett fritt levande ciliat som finns allmänt i globala akvatiska ekosystem och liknar metazoanceller i struktur och funktionell komplexitetl5. Upptäckten av ribozynnel6 och telomerasel7 i Tetrahymena gav ett stort uppsving i forskningen om anti-aging-mekanismer, som belönades med två Nobelpris18. På grund av sin korta tillväxtcykel, lätta odling och tydliga genetiska bakgrund, T. termofil skulle kunna tillhandahålla dubbel forskning in vivo och in vitro i en experimentell design. T. thermophila har framgångsrikt använts i läkemedelsscreening och farmakologiska mekanismer20. Ännu viktigare, information om den molekylära utvecklingen av T. thermophila glutationperoxidasfamiljen har avslöjats9-2. Informationsprofilen för T.cistanche genghis khanthermophila GPX-gener kan erhållas från Tetrahymena Functional Genomics Database(TetraFGD)(http://tfgd.ihb.ac.cn/) och TGD(http://ww. ciliate.org)22.Tio av de tolv förmodade GPX har identifierats som fosfolipidhydroperoxidglutationperoxidas (PHGPx) i Tetrahymena-genomets jämförande databas. PHP, ett selenberoende GPX, kan specifikt reducera fosfolipidhydroperoxid för att skydda lecitinliposomer och biofilmer från oxidativ skada23.PHGPxin T. thermophila har en genomsnittlig molekylmassa på cirka 21,7 kDa22, vilket liknar molekylmassan (20-22 kDa) av PHGPx-monomerproteinet som beskrivs i däggdjur24. Dessutom visade ett stort antal rapporter att GPX-uttrycket för Tthermophila var kvantitativt annorlunda och beroende av stresskällan (oxidant, apoptosinducerare eller metall)2122 och exponeringstid20-24

Klicka här för att veta mer

Genom att jämföra effekterna av det vattenhaltiga extraktet och huvudmonomererna av G. lucidum på tillväxtkurvan och den maximala densiteten för T. thermophila, erhöll denna studie det bästa anti-aging G. lucidum-extraktet. Anti-aging-mekanismen hos G. lucidum, särskilt bestämningen av åtgärdstypen för GPX-familjen, undersöktes på molekylär, cellulär och individuell nivå. Resultaten av denna studie förväntas bidra till klinisk tillämpning av G. lucidum-produkter.

Material och metoder

Ganoderma lucidum vattenextrakt och monomerer. Med hänvisning till rapporten om Cuong maldes 25,20 g torkad G. lucidum (Changbai Mountain Senbao Specialty Store, Jilin) ​​och extraherades i 1000 ml ddHO. Det vattenhaltiga extraktet uppsamlades genom centrifugering, koncentrerades till 100 ml genom vakuumtorkning och lagrades vid -20 grad tills användning.

G. lucidum polysackarid, Ganoderic Acid A, Ganoderal A och G. lucidum ergosterol köptes från Chengdu Must Biotechnology Co.,Ltd. Dessa tre standarder löstes i metanol enligt den enhetliga designen och sattes till SPP-medium. Cellodling och läkemedelsbehandling. Tetrahymenathermophila (SB210) tillhandahölls av Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, IPR Kina. T. thermophila odlades i en 28 graders inkubator. SPP-mediet innehöll 2 procent (vikt/volym) proteospepton, 0,1 procent jästextrakt (Oxoid), 0,2 procent glukos och 0,003 procent sekvestren. Enligt den enhetliga utformningen (kompletterande tabeller S1 och S2), G. lucidum vattenhaltigt extrakt, G. lucidum polysackarid, Ganoderic Acid A, Ganoderal A och G. lucidum ergosterol sattes till odlingsmediet. Kontrollgruppen ersattes med samma volym dubbeldestillerat vatten, med 3 parallella prover i varje grupp. Efter att ha gått in i den logaritmiska fasen togs prover varannan timme fram till nedgångsfasen. Tätheten hos T. thermophila räknades av blodcellsräkningstavlan och förhållandet mellan densiteten hos T. thermophila och tiden ritades.

Transkriptionsanalys. Experimentet utfördes med en 24-brunnsplatta och varje brunn bestod av 900 μL SPP. I den experimentella gruppen tillsattes 100 μL 200 mg/ml G. lucidum vattenhaltigt extrakt. Kontrollgruppen behandlades med 100 μL ddH O istället. Tre parallella prover sattes i varje grupp.cistanche livslängdKontrollgruppen och experimentgruppen var båda i logaritmisk fas (20 timmar), och nedgångsfasen (27 timmar) samlades in för den transkriptomiska analysen. Varje grupp duplicerades biologiskt och alla prover utsattes för en heltranskript mikroarrayanalys (Biomarker Technologies, Peking, Kina). Genuttrycksprofilen detekterades av en Affymetrix 3'IVT Expression Array. För att minska effekten av uttrycket av värdegener användes RPKM Större än eller lika med 5 och FC(Fold Change) Större än eller lika med 2 som kriterier för screening differentiellt uttryckta gener (DEGs)KOBAS användes för att realisera väganalysen av GeneOntology (GO) och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Anrikningsvägen bestämdes av det korrigerade P-adj-värdet Mindre än eller lika med 0,05. Transkriptomresultaten verifierades med kvantitativ omvänd transkriptions-PCR(RT-qPCR) (Metod se tilläggsfil). Sedan etablerades nätverket för protein-proteininteraktion (PPI) baserat på STRING-databasen, och den centrala genen screenades med hjälp av CytoHubla för att identifiera den centrala noden i Cytoscape-programvaran.

Silverfärgning och observation av transmissionselektronmikroskopi (TEM). Förfarandet för silverfärgning var enligt Foissners metod26. thermophila observerades under ett oljemikroskop. Ultrastrukturen av T. thermophila observerades med TEM. Cellerna behandlade med G. lucidum vattenhaltigt extrakt och kontrollgruppen samlades upp genom centrifugering vid 600 xg under 2 min. Celler prefixerades i 2,5 procent glutaraldehyd och hölls vid 4 grader i 8 timmar. Proverna tvättades med PBS (pH 7,5) tre gånger, centrifugerades vid 3000 xg i 5 minuter och fixerades sedan med 1 procent osmiumtetraoxid (4 timmar). Därefter utfördes dehydrering med användning av gradientaceton på 15 procent till 100 procent. Därefter inbäddades cellerna i Embed 812(TAAB)-harts med låg viskositet. Efter härdning skars ultratunna sektioner (60-80 nm) av en ultratunn skivare. Ultrastrukturen observerades med transmissionselektronmikroskop (JEOL JEM-1010, Japan).

Bestämning av cellskada. Intracellulär lROS detekterades av den känsliga fluorescerande sonden 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetat(DCFH-DA)27. Aktiviteten av malondialdehyd (MDA) bestämdes av kommersiella kit tillhandahållna av Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu, Kina). Metoden för att bestämma förmågan att eliminera hydroxylradikaler (·OH) var enligt beskrivningen av Takemura28. Förmågan hos det vattenhaltiga G. lucidum-extraktet att eliminera OH-fri radikal uttrycktes som den optiska densiteten för den experimentella gruppen minus den optiska densiteten för kontrollgruppen.

Cistanche kan anti-aging

PHGPx-aktivitet. Nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH)/NADP* förhållandet och glutation/glutationdisulfid (GSH/GSSG) förhållandet bestämdes med användning av NADP*/NADPH Quantification Kit (S0179, Beyotime), GSH/GSSG Assay Kit (S0053, Beyotime). analyser utfördes enligt tillverkarens protokoll.

Resultat

Effekterna av G. lucidum vattenextrakt och G. lucidum monomerer på tillväxten av T. ther-mochila. Som tidigare studier7, G. lucidum polysackarid var huvudkomponenten i G. lucidum vattenhaltigt extrakt i detta experiment enligt spektrofotometeridentifiering (tilläggsbild S1). De aktiva substanserna i G. lucidum vattenhaltigt extrakt analyserades också med GC-MS. Det totala jondiagrammet för det vattenhaltiga extraktet av G. lucidum visade att ll komponenter fanns i det vattenhaltiga extraktet (kompletterande fig. S2). Bland föreningarna i vattenextraktet G. lucidum (kompletterande tabeller S3 och S4), G. lucidum acid A, Ganoderal A och G. lucidum ergosterol valdes ut enligt deras retentionstid och matchningsgrad.

För att jämföra effekterna av G. lucidum vattenextrakt och dessa huvudmonomerer på tillväxten av T. thermophila, tillsattes G. lucidum vattenextrakt och G. lucidum monomers lösning till odlingsmediet av T. thermophila. Resultaten visades i figur 1. Den maximala densiteten för kontrollgruppen var 6×104 celler/ml vid 24 timmar. Celltätheten för G. lucidum vattenextraktgruppen från 12 till 20 timmar var nästan densamma som för kontrollgruppen, men från 20 till 25 timmar var den signifikant högre än celltätheten för kontrollgruppen.cistanche nzSamtidigt förlängdes den logaritmiska fasen med 1 timme, den maximala densiteten var 1,15 × 105 celler/ml. Även om den maximala densiteten för G. lucidum-polysackaridgruppen var högre än den för kontrollgruppen med 9,7 x 104 celler/ml, var den lägre än G. lucidum-vattenextraktgruppen. Den maximala densiteten för G. lucidum acid A, Ganoderal A och G. lucidum ergosterol översteg inte den för kontrollgruppen, vilket visade att de lösta alkoholerna i dessa monomerer inte var gynnsamma för tillväxten av T. thermophila. Man kunde dra slutsatsen att det vattenhaltiga extraktet av G. lucidum som innehåller en mängd olika aktiva substanser kan främja tillväxten av T. thermophila mer än dess monomerer.

Anti-aging effekt av G. lucidum vattenextrakt. Med ökande odlingstiden var ljusintensiteten hos ROS i nedgångsfasen (Fig. 2b) högre än den i den logaritmiska fasen (Fig. 2a). Efter tillsats av det vattenhaltiga G. lucidum-extraktet, även om fluorescensintensiteten för nedgångsfasen (fig. 2d) fortfarande var förstärkt jämfört med den för den logaritmiska fasen (fig. 2c), var den signifikant lägre än den för kontrollgruppen. MDA-halten i kontrollgruppen var också högre i nedgångsfasen än i den logaritmiska fasen (Fig.2e). Samtidigt var rensförmågan hos OH i nedgångsfasen lägre än den i den logaritmiska fasen (Fig. 2e). Balansen mellan oxidation och reduktion gick förlorad och kroppen åldrades. Efter tillsats av det vattenhaltiga extraktet av G. lucidum var MDA-halten lägre än i kontrollgruppen (vänster kolumn i fig. 2e), och mängden OH som avlägsnats av celler i den logaritmiska fasen och nedgångsfasen var högre än den i kontrollgrupp (höger kolumn i fig. 2e). Tillväxten av T[ thermophila kan jämföras med åldrandeprocessen hos flercelliga organismer genom dess cellulära skada. När ROS och MDA ackumulerades hämmades tillväxten och densiteten av T. thermophila reducerades. Tillsatsen av G. lucidum vattenhaltigt extrakt kan upprätthålla redoxbalansen i T. thermophila och uppnå anti-aging effekter.

Analys av differentiellt uttryckta gener och verifiering med RT-qPCR. Jämfört med kontrollgruppen förändrades uttrycket av 11 519 gener i den logaritmiska fasen av T. thermophila signifikant efter tillsats av G. lucidum vattenhaltigt extrakt till SPP. Bland dem var 6201 gener uppreglerade och 5318 gener nedreglerades.cistanche penis storlekUttrycket av 8772 gener förändrades signifikant under nedgångsfasen, bland vilka 4721 gener uppreglerades och 4051 gener nedreglerades. I tidigare studier i vårt laboratorium har

anti-aging effekt av G. lucidum på Stylonychia återspeglades i antioxidantindexet, så 10 gener (kompletterande tabell S5) relaterade till antioxidanter valdes slumpmässigt ut bland DEG, och riktigheten av RNA-seq-data verifierades av RT- qPCR. Expressionsmönstren för dessa 10 gener i den logaritmiska fasen och nedgångsfasen överensstämde med trenden för RNA-sekvensdata (kompletterande Fig. S3). Resultatet visade att RNA-sekvensdata var tillförlitliga och kunde användas för efterföljande analys.

GO-anrikning och KEGG-väganalyser. DEG i den logaritmiska fasen var involverade i 14 biologiska processer (BP) med 6 typer av molekylära funktioner (MF) och de fanns i alla cellkomponenter (CC) (Fig. 3a). DEG i nedgångsfasen var involverade i 12 BP med 4 typer av MF och de fanns i 12 CC. Det mest involverade BP i de två faserna var den metaboliska processen, MF var bindande och CC var membran. Bland den metaboliska processen, bindning och membran, stod de uppreglerade generna för 70 procent i logaritmfasen (Fig. 3b) och 75 procent i nedgångsfasen (Fig. 3c). Dessa resultat visar att det vattenhaltiga G. lucidum-extraktet kan främja upprätthållandet av cellmembranintegriteten i båda faserna.

KEGG-väganrikningsanalys utfördes för att ytterligare analysera DEG mellan de två faserna. I den logaritmiska fasen koncentrerades 94 vägar, bland vilka 68 procent av de totala generna var involverade i metabolismen. I nedgångsfasen berikades 91 vägar, bland vilka metabolismen fortfarande var den största vägen, som stod för 68 procent. De 20 bästa vägarna i den logaritmiska fasen (fig. 3d) och nedgångsfasen (fig. 3e) användes för att rita ett bubbeldiagram och visade att oavsett betydelsen eller antalet involverade gener, effekten av G.cistanche pulverlucidum vattenhaltigt extrakt främst fokuserat på glutationmetabolismvägen. I den logaritmiska fasen berikades 38 differentiellt uttryckta gener i denna väg, vilket motsvarar 45 procent. I nedgångsfasen berikades 43 differentiellt uttryckta gener på denna väg, vilket motsvarar 50 procent.

Protein-protein interaktion (PPI) nätverk av DEG. Belysningen av DEG i glutationmetabolismvägen och insikt i deras interaktioner med andra proteiner kommer att hjälpa till att ytterligare utforska den potentiella regleringsmekanismen för G. lucidum vattenextrakt. Både den logaritmiska fasen (Fig.4a) och nedgångsfasen (Fig.4b) hade de viktigaste effekterna på GPX1, GPX2, GPX7 och GPX11. Genom frågan från TetraFGD-databasen tillhörde dessa GPX-enzymer PHGPx (kompletterande tabell S6). Därför spelar antioxidantenzymer, särskilt PHGPx, en viktig roll för att främja tillväxten av T. thermophila via inducering av G. lucidum vattenhaltigt extrakt.

GPS-aktivitet och funktionsverifiering. Aktiviteten hos PHGPx avser hastigheten för NADPH-absorptionsminskning2". NADPH/NADP*-värdet i kontrollgruppens nedgångsfas var lägre än det i den logaritmiska fasen (Fig. 5a). Resultatet antydde att aktiviteten för PHGPx minskade med ökningen av odlingstiden. Efter tillsats av G. lucidum vattenhaltigt extrakt var NADPH/NADP plus-värdet i nedgångsfasen fortfarande lägre än det i den logaritmiska fasen, men högre än båda faserna i kontrollgruppen. Detta resultat indikerade att det vattenhaltiga G.lucidum-extraktet kunde främja aktiviteten av PHGPx.

PHP kan specifikt katalysera reduktionen av fosfolipidhydroperoxid genom reducerat glutation (GSH), för att effektivt omvandla toxisk lipidperoxid (PL-PUFA-OOH) till icke-toxiska fleromättade fettsyror (PL-PUFA-OH)30. Förändringen av GSH/GSSH-förhållandet kan återspegla förändringen av PL-PUFA-OOH och PL-PUFA-OH På grund av minskningen av PHGPx-aktivitet (fig. 5a) minskade också förhållandet mellan GSH/GSSH i kontrollgruppen med ökningen av odlingstiden (fig. 5b). Efter tillsats av vattenhaltigt G.lucidum-extrakt ökades emellertid förhållandet GSH/GSSH i logaritmfasen och nedgångsfasen. Den intracellulära toxiska PL-PUFA-OOH i experimentgruppen omvandlades till icke-toxisk PL-PUFA-OH, vilket var mer än kontrollgruppens. Observation av mikroskopisk morfologi och ultrastruktur. Den skyddande effekten av G. Luci-dum vattenhaltigt extrakt på membranet visualiserades genom ammoniaksilverfärgning och TEM. Genom att jämföra den logaritmiska fasen för kontrollgruppen (fig. 6a) och nedgångsfasen för kontrollgruppen (fig. 6c), fann man att cellmorfologin hos T. thermophila var allvarligt deformerad med förlängningen av odlingstiden, och kärnan var suddig, vilket tyder på att cellerna verkade vara i ett åldrande tillstånd. I G. lucidum vattenextraktgrupp var emellertid cellernas morfologi och integritet väl skyddade i den logaritmiska fasen (fig. 6e) och nedgångsfasen (fig. 6g). Ultrastrukturella förändringar i cellerna observerades med TEM. Åsen och konturen av mitokondrierna var suddiga i nedgångsfasen (fig. 6d) jämfört med den logaritmiska fasen (fig. 6b) i kontrollgruppen. Mitokondriers sönderfall ökade med förlängningen av odlingstiden. Tillsatsen av G. lucidum vattenhaltigt extrakt förbättrade morfologin hos mitokondrierna i den logaritmiska fasen (fig. 6f) och nedgångsfasen (fig. 6h). G. lucidum vattenhaltigt extrakt garanterade mitokondriernas funktion, vilket är nära relaterat till membranets integritet. Det bör noteras att i den logaritmiska fasen visade mitokondrierna i experimentgruppen morfologiska förändringar (Fig. 6f, h), men membranets integritet påverkades inte.

Diskussion

Användningen av G.lucidum-extrakt har en lång historia både inom traditionell kinesisk medicin och Östasien. Ett stort antal studier har visat deras effektivitet. Tidigare rapporter fann att G. lucidum vattenhaltigt extrakt innehöll inte bara G. lucidum polysackarider utan även Glucidum triterpenoider. Enligt tidigare rapporter är Ganoderma-syra, Ganoderma-aldehyd och Ganoderma ergosterol huvudingredienserna i G. lucidum triterpene 3. De verkar med olika reparationsfunktioner för celler (tabell 1). Ganoderma lucidum vattenextrakt innehåller en mängd olika aktiva substanser, som integrerar funktionerna hos de andra fyra aktiva substanserna, som inte bara kan motstå oxidation utan också bevara membranintegriteten. I den här studien,

det tillväxtbefrämjande av det vattenhaltiga G. lucidum-extraktet på T. thermophila verifierade detta inklusionsförhållande. Genom analys av G. lucidum vattenhaltigt extrakt med totaljonflödeskromatografi (kompletterande fig. S2) kunde det konstateras att upplösningstiden för olika aktiva substanser var olika. Så det vattenhaltiga G. lucidum-extraktet blir ett komplext organiskt lösningsmedel med förlängning av koktiden. Vi tror att de aktiva substanserna i vattenextraktet G.lucidum kan verka vid olika tidpunkter, vilket resulterar i en synergi. Detta bör vara en ytterligare studie i framtiden.

Analysen av T. thermophila transkriptom undersökte effekten av G. lucidum vattenhaltigt extrakt på genuttryck under tillväxt. Efter behandling med vattenhaltigt G. lucidum-extrakt visade sig PHGPx vara en viktig inverkan på celldensitet och generationstid. Detta resultat bekräftade att det vattenhaltiga extraktet av G. lucidum verkade på den selenberoende typen av GPX-familjen. PHP är ett multifunktionellt selenoprotein som är brett distribuerat i kroppen och som inte bara kan delta i antioxidantreaktioner utan också direkt minskar lipiderna i membranet för att skydda membransystemets integritet40. Jämfört med andra GPX har PHGPx en mindre volym och större hydrofobicitet. Många rapporter har visat att PHGPx-överuttryck i celler kan motstå cellrespons på endogen (t.ex. åldrande) fl och exogen (t.ex. miljö) peroxidationsskada 2-45.PHP är det enda enzymet som direkt kan minska PL-PUFA- OOH av membranet till motsvarande hydroxylföreningar, vilket möjliggör avslutande av peroxidation och skyddar det biologiska membranet från peroxidationsskador4647. Ökningen av innehållet av PL-PUFA-OOH var orsaken till skadan på cellmembranet i kontrollgruppen under nedgångsfasen, vilket blev en ond cirkel och accelererade cellåldern. I denna studie har innehållet av ROS och MDA (Fig.2) av T.thermophila i kontrollgruppen ökade med ökningen av odlingstiden. Membranet visade sig vara allvarlig deformation i nedgångsfasen genom den morfologiska observationen. När G. lucidun vattenhaltigt extrakt tillsattes uppreglerades emellertid uttrycket av PHGPx. Således omvandlades PL-PUFA-OOH på membranet till icke-toxisk PL-PUFA-OH, och stabiliteten hos membranstrukturen förbättras både i den logaritmiska fasen och nedgångsfasen. Enligt observationen av membranet genom ammoniaksilverfärgning och TEM kunde man dra slutsatsen att det vattenhaltiga G.lucidum-extraktet penetrerade cellmembranet under tillväxtprocessen. Denna reparationseffekt på cellmembranet skulle kunna få de aktiva substanserna i vattenextraktet G. lucidum att komma in i cytoplasman och skydda membranstrukturen i kärnan och mitokondrierna för att främja metabolismen av T. thermophila och uppnå anti-aging effekter. Som resultaten av lKEGG-anrikningen visar är ett stort antal differentiella gener koncentrerade i de metaboliska vägarna. Dessa resultat indikerade att det vattenhaltiga extraktet av G. lucidum var fördelaktigt för metabolismen av glutation och eliminering av giftiga peroxider som produceras av cellåldring.

I allmänhet främjade det vattenhaltiga extraktet av G. lucidum uttrycket av det selenberoende enzymet PHGPx i GPX-familjen. Förbättringen av PHGPx-aktivitet kunde inte bara minska det oxidativa stresssvaret in vivo utan också specifikt och effektivt minska lipidavsättningen av det biologiska membranet och bibehålla membranets integritet (Fig. 7). Följaktligen kommer de aktiva substanserna i det vattenhaltiga G. lucidum-extraktet in i cellerna genom det intakta membranet och främjar deras ämnesomsättning. Detta skapade en god cykel för att uppnå effekten av anti-aging.

Denna artikel är extraherad från Scientifc Reports|(2022) 12:3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z