Gastrointestinal epitelial medfödd immunitet—regionalisering och organoider som ny modell

Människans mag-tarmkanal är i konstant kontakt med mikrobiella stimuli. Dess barriärer måste säkerställa samexistens med de kommensala bakterierna samtidigt som de möjliggör övervakning av inträngande patogener. I centrum av interaktionen ligger epitelskiktet, som markerar kroppens gränser. Den är utrustad med en mängd olika medfödda immunsensorer, såsom Toll-liknande receptorer, för att skapa inflammatoriska svar på mikrober. Dysfunktion av detta invecklade system resulterar i inflammationsassocierade patologier, såsom inflammatorisk tarmsjukdom. Komplexiteten hos de cellulära interaktionerna, deras molekylära bas och deras utveckling förblir dock dåligt förstådda. Under de senaste åren har stamcellshärledda organoider fått ökad uppmärksamhet som lovande modeller för både utveckling och ett brett spektrum av patologier, inklusive infektionssjukdomar. Dessutom möjliggör organoider studiet av epitelial medfödd immunitet in vitro. I denna recension fokuserar vi på den gastrointestinala epitelbarriären och dess regionala organisation för att diskutera medfödd immunförnimmelse och utveckling.

Exponering för mikrobiella stimuli kan förbättra immuniteten, eftersom mikrobiella stimuli kan stimulera kroppen att producera immunceller och immunmolekyler och därigenom stimulera kroppens immunsvar. Specifikt kan exponering för mikrobiella stimuli aktivera immunceller såsom makrofager, dendritiska celler och naturliga mördarceller, påskynda spridningen och differentieringen av immunceller och förbättra immuncellers vitalitet och sjukdomsresistens. Dessutom kan mikrobiella stimuli också främja inflammatoriska svar och immunreglering och förbättra kroppens immunförsvar mot patogener. Därför kan rimlig exponering för mikrobiella stimuli främja förbättringen av mänsklig immunitet. Det kan ses att vi behöver förbättra immuniteten. Cistanche kan avsevärt förbättra immuniteten. Köttaska innehåller olika biologiskt aktiva ingredienser, såsom polysackarider, två svampar, Huang Li etc. Dessa ingredienser kan stimulera olika typer av kött i immunförsvaret. celler, vilket ökar deras immunförsvar.

Klicka på hälsofördelarna med cistanche

Nyckelord

Mag-tarmkanalen. Immunitet. Regionalisering och organoider.

Introduktion

Mag-tarmkanalen (GI) krävs för matsmältningen av mat och sträcker sig från munhålan via matstrupen, magen, tunntarmen och tjocktarmen till anus. GI-lumen koloniseras av en stor mängd kommensaler, symbionter och ibland patogener. Den mikrobiella koloniseringen följer en gradient med mindre än 103 mikrober/ml i magsäcken till 103 –107 mikrober/ml i tunntarmen och 1011–1012 mikrober/ml i tjocktarmen (granskas i [1–3]). Från körtelmagen och framåt är mag-tarmkanalen kantad av ett enda lager kolumnära epitelceller. Detta epitelskikt består av olika specialiserade celler, tätt sammankopplade av kopplingsproteinkomplex, som förstärker den fysiska barriären (Fig. 1).

Interaktionen mellan tarmmikrobiotan såväl som intagna patogener och epitelceller medieras av mönsterigenkänningsreceptorer (PRR), inklusive Toll-like receptors (TLR), nukleotidbindande oligomeriseringsdomän (NOD) -liknande receptorer (NLR) och andra cytosoliska receptorer (Fig. 2, granskad i [7, 11]). Dessa PRR spelar en nyckelroll i att känna igen mikrobassocierade molekylära mönster (MAMPs) och skadeassocierade molekylära mönster (DAMPs). Vid PRR-aktivering i epitelceller inducerar nedströms signalkaskader uttrycket av olika cytokiner och kemokiner via inflammatoriska vägar, såsom NF-KB-vägen, för att styra de professionella immuncellerna (granskas i [8, 12-16]). Förutom de klassiska PRR har ytterligare sensorer för bakterieaktivitet, såsom alfa-kinas 1 (ALPK1) nyligen upptäckts [17–19]. Inflammasomer, cytoplasmatiska komplex som består av NLR-proteiner, känner igen ytterligare molekylära mönster, såsom bakteriella metaboliter (granskas i [7, 9]).

Gastrointestinala medfödda immunsvar, inklusive PRR-avkänning, måste balansera behovet av skydd från potentiellt skadliga patogener med att kunna tolerera exponering för det olika luminala mikrobiomet. Därför förväntas uttrycket och funktionen av PRR-signalering ha en stor inverkan inte bara på patogenavkänning utan också på vävnadshomeostas (ruta 1) och inflammatoriska sjukdomar inklusive akut gastroenterit, gastrit och inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD) (recensat i [ 12, 13, 20, 21]). Även om var och en av dessa sjukdomar uppvisar helt olika patogeneser delar de en kritisk egenskap: gränssnittet mellan miljön och kroppen är avsevärt störd. Det pågår dock en debatt om huruvida förändringar i tarmepitelskiktet, i synnerhet de som påverkar dess medfödda immunfunktion, är en orsak eller en konsekvens av ovan nämnda sjukdomar.

Mest kunskap om PRR-signalering har samlats in från forskning om hematopoetiska celler. Det har varit en utmaning att särskilja funktionerna hos PRR-signalering i epitelceller från de infiltrerande immuncellerna. Stora hinder inkluderar svårigheter att isolera rena epitelceller och framkalla tillförlitliga antikroppar mot PRR. Med utvecklingen av organoider som härrör från tarmepitelstamceller finns nu en reduktionistisk experimentell modell tillgänglig som möjliggör undersökningar av det medfödda immunsvaret hos de primära epitelcellerna. Organoider definieras som stamcellshärledda, 3- dimensionella cellkulturer som har den självorganiserande kapaciteten och behåller en del av det ursprungliga organets funktion (t.ex. sekretion, filtrering, absorption, sammandragning). Eftersom organoider kan odlas antingen från vävnadsbosatta vuxna stamceller (ASC) eller från pluripotenta stamceller (PSCs), är cellerna icke-transformerade. Tillsammans täcker de två typerna av organoider en omfattande repertoar av organ som kan efterliknas (recensioneras i [4, 22, 23]). Båda teknologierna har sina fördelar (recensat i [4, 22, 23]). Till exempel har kulturer av ASC-härledda organoider en enorm expansionspotential och är relativt homogena, och PSC-härledda organoider är mer komplexa i den meningen att de kombinerar celler av mycket olika utvecklingsursprung (t.ex. epitelceller och mesenkymala celler). PSC-härledda organoider tillåter analys av utvecklingsstegen men kanske inte når den fulla nivån av differentiering i epitelskiktet som finns in vivo [24]. ASC-härledda organoider genererade från fostervävnader kan också möjliggöra studiet av mognaden av fosterepitel eftersom de åldras i kultur [24, 25].

Denna översyn kommer att belysa insikter från studier som använder organoider och diskutera potentialen hos denna teknik för studiet av epitelial medfödd immunitet. Vi fokuserar på den regionala organisationen i mag-tarmkanalen.

Regional identitet och medfödd immunsignalering i mag-tarmkanalen

När man tittar på gastrointestinala sjukdomar är det viktigt att notera att vissa av dem är begränsade till en specifik del av mag-tarmkanalen. IBD inkluderar Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC), som visar ett differentiellt och sjukdomsspecifikt inflammationsmönster: medan UC börjar i ändtarmen och finns i tjocktarmen, kan CD:n påverka alla delar av mag-tarmkanalen från munhålan till anus. Vidare kännetecknas CD av segmentell, diskontinuerlig inflammation i mag-tarmkanalen, medan UC vanligtvis beskrivs som en kontinuerlig inflammation i tjocktarmen (recensat i [26, 27]). I matstrupen, magen och tjocktarmen är cancerincidensen hög, och infektion och inflammation kan främja utvecklingen och progressionen av dessa cancerformer (recensat i [28, 29]). Däremot är malign transformation i tunntarmen mycket sällsynt (recensionerad i [30]). Den uppenbara segmentspecificiteten för dessa sjukdomar i mag-tarmkanalen förblir gåtfull, men det är frestande att spekulera i att deras regionspecifika ursprung har sina rötter i regionspecifika störningar i det hårt balanserade systemet av epitelbarriärfunktion, medfödd immunitet och slemhinneregenerering . Därför är det intressant att lyfta fram skillnader i segmenten inom GI-kanalen.

Mag-tarmkanalen består av flera anatomiskt definierade segment med mycket distinkta fysiska funktioner (granskas i [31]). Huvudfunktionen hos magen är matsmältningen av mat och eliminering av inkommande patogener av magsyra. Näringsämnen behöver inte nå epitelskiktet i magen; sålunda investerar kroppen mycket i en skyddande slembarriär, som skyddar epitelcellerna inte bara från dess syra utan också från luminalt innehåll (recensat i [32, 33]). Däremot är tunntarmens huvudsakliga funktion inte bara matsmältningen utan även upptaget av näringsämnen. I linje med detta har tunntarmen en väsentligt förstorad yta på grund av att villi sticker ut i tarmlumen, där cellytor kommer i nära kontakt med näringsämnena. Det mesta av matsmältningen sker vid den proximala tunntarmen, tolvfingertarmen och jejunum, där villi är långa och tunna. Jejunum har det högsta förhållandet av Paneth-celler som utsöndrar antimikrobiella peptider [34], som pryder det ganska lösa slemmet, och därigenom skyddar epitelskiktet och håller krypterna sterila (granskas i [35]).

Villi blir successivt kortare och bredare mot ileum (recensionerad i [36]), där återigen slemmet tar över en viktig del av skyddet: med den högsta andelen bägareceller har ileum ett tjockare slemlager och ett lägre hastighet av matsmältning och absorption än jejunum [34] (granskas i [31]). Slutligen återabsorberar tjocktarmen vatten och investerar i ett omfattande, tjockt och tvåskiktigt slemskydd för att säkert kunna hysa biljoner kommensala bakterier. Kolon har inga villi och krypterna är mindre än tunntarmens. Det finns inga Paneth-celler, och bägarens cellförhållande kan vara upp till 25 procent av epitelskiktet [37]. Således har de tre tarmsegmenten olika strategier för att upprätthålla ett säkert avstånd mellan epitelcellerna och mikrobiotan. MAMP-igenkänning och aktivering av immunvägar är ett annat lager av denna interaktion och därför är det bara rimligt att de också är strukturerade längs mag-tarmkanalen (granskas i [38]). Det förblir dock en fascinerande gåta om vad som exakt formar strukturen i PRR-organisationen.

Även om det är intuitivt att gener som är viktiga för regionala funktioner, såsom matsmältning och näringsupptag, följer rumslig kompartmentalisering längs den cephalocaudala axeln (granskas i [39]), förväntades en sådan organisation inte för epitelial medfödd immunsignalering. Tidigare studier hade rapporterat reglering av PRR-signalering som svar på stimulering med MAMP. Till exempel minskar TLR4-respons efter födseln, förmodligen på grund av exponering för LPS under förlossningen och efterföljande kolonisering av tarmen [40]. Stimulering av TLR9 med dess ligand CpG-DNA leder också till en minskning av Tlr4-uttryck och hämmar TLR4-signalering [41]. Således förväntades det att kontakt med mikroorganismerna, deras molekyler och metaboliter i mag-tarmkanalen skulle leda till tystnad av PRR-uttryck mot tarmlumen (recensat i [14]). Men motstridiga resultat, orsakade av tekniska svårigheter såsom opålitliga antikroppar riktade mot TLR, ledde till förvirring i fältet och det var oklart om en viss PRR uttrycktes eller inte (granskas i [42]). Tidiga Northern blöts för mRNA av Tlr2 och Tlr4 in ex vivo isolerade epitelceller indikerade att expressionsnivåer av dessa två Tlr-molekyler var segmentspecifika: Tlr2 uttrycktes huvudsakligen i tjocktarmen, medan Tlr4 huvudsakligen uttrycktes i mage och kolon. Författarna kallade detta " strategisk uppdelning" av dessa TLRs [43]. Nyligen genomförda studier har nu upptäckt att denna princip för segmentspecifikt uttryck sträcker sig bortom dessa två TLR, och har avslöjat en mycket komplex regional organisation av PRR-signalering som inte alltid följer den mikrobiella belastningen [44, 45].

Den första av de två studierna kom från Barton-gruppen och avslöjade flera nivåer av organisation av TLR-uttryck. Gruppen genererade fem stammar av reportermöss, vilket möjliggjorde expressionsanalys av TLR2, 4, 5, 7 respektive 9. TLR2 och 5 uttrycktes i tunntarmen och den proximala tjocktarmen, TLR4 uttrycktes i tjocktarmen och TLR7 och 9 uttrycktes inte. Reporteruttryck i organoider från dessa möss efterliknade uttrycket in vivo nära, vilket indikerar att uttrycket är oberoende av kontakt med mikrobiotan eller med immunceller [45].

Den andra studien använde en biobank av nyligen genererade mänskliga och murina organoider som täcker de olika segmenten av mag-tarmkanalen: corpus, pylorus, duodenum, jejunum, ileum och kolon. Transkriptionsanalys av organoiderna bekräftade uttrycksmönstren för de TLR som rapporterats av Barton-gruppen, men avslöjade dessutom en stor utsträckning av differentiellt uttryck av TLR, NLR, inflammasomkomponenter och andra medfödda immunitetsrelaterade gener (fig. 3 och [44) ]). Till exempel uttrycktes Nod2 huvudsakligen i magen, medan uttryck av flera inflammasomvägskomponenter som Nlrp1b, Nlrp6 och Aim2 var begränsade till tarmen. Olika receptorer uttrycktes enhetligt; till exempel detekterades Tlr3-uttryck i varje segment av den murina mag-tarmkanalen i höga mängder, medan Tlr5 uttrycktes i varje segment men i låga mängder [44]. Som ett resultat tycks varje segment ha sitt alldeles egna, specifika komplement av medfödda immunreceptorer och signalkomponenter.

Att jämföra den murina med de mänskliga gastrointestinala organoiderna visade att principen för den komplexa organisationen av PRR-signalkomponenter var densamma i båda arterna, men individuella PRR-uttrycksprofiler kunde skilja sig åt. Vissa PRR, som TLR4 och NLRP6, mönstrades på liknande sätt längs GI-kanalen hos båda arterna. TLR4 uttrycktes övervägande i magen och tjocktarmen och NLRP6-uttryck var begränsat till segmenten av tarmen. Å andra sidan visade flera PRR som TLR1 och TLR2 mönster som skilde sig åt mellan båda arterna. Medan i murina organoider ökade uttrycket av båda längs mag-tarmkanalen och var högst i tjocktarmen, hos mänskliga organoider var uttrycket högst i magen och minskade längs mag-tarmkanalen [44]. Dessutom var uttrycket av TLR5 högre i mänskliga organoider, med de högsta nivåerna observerade i magen [44].

Som nämnts ovan tillåter organoider också testning av om en viss väg är funktionell genom tillägg av liganden och efterföljande analys av nedströms målgenuttryck. Som komplement till den regionspecifika expressionsanalysen fann studien också att humana och murina organoider visar regionspecifik funktion: murina magen svarade på TLR4-liganden LPS, men inte TLR2-liganden PAM3CSK4 eller TLR5-liganden flagellin, genom att uppreglera NF- κB målgen Cxcl2. Murin jejunum uppreglerade Cxcl2 som svar på PAM3CSK4 och flagellin, men inte som svar på LPS. Dessutom uttryckte tjocktarmen Cxcl2 som svar på alla dessa 3 testade ligander [44]. Däremot uttryckte mänskliga organoider från alla regioner den humana Cxcl2-analogen IL-8 som svar på flagellin, men inte som svar på LPS och PAM3CSK [44]. Således är inte bara uttrycket utan också funktionen av PRR i tarmen mycket organiserad och segmentspecifik. Dessa experiment utfördes genom att tillsätta stimulansen till det organoida mediet, vilket endast stimulerar bassidan, eftersom den apikala sidan är vänd mot organoidernas avtätade lumen. Andra experiment visade att det finns en ännu högre nivå av organisation eftersom PRR-uttryck inom ett segment kan begränsas till specifika celltyper eller till och med subcellulära platser, såsom bara basalfacket. Dessa beskrivs mer i detalj nedan.

Varje region i mag-tarmkanalen uttrycker sin specifika uppsättning av medfödda immungener. Även om en generalisering är svår, tyder nuvarande data på att TLR uttrycks mest i magen och tjocktarmen, medan tunntarmen kännetecknas av uttrycket av inflammasomkomponenter. För närvarande är den underliggande molekylära mekanismen och den evolutionära fördelen oklara.

Vi misstänker att de fysiska och kemiska barriärerna som täcker epitelskikten i de olika tarmsegmenten kräver övervakning av specifika hot. Till exempel har magen och tjocktarmen båda ett dubbelskiktat, tjockt slemskikt med det inre slemskiktet stadigt fäst vid epitelskiktet, medan tunntarmen är täckt av ett tunt, trögflytande slemskikt [46]. De olika konstitutionerna av slemlagren beror i sin tur sannolikt på de olika funktionerna hos respektive tarmsegment (matsmältning vs näringsupptag vs vattenresorption). Det är tänkbart att slemtjockleken påverkar vilken typ av PRR som är nödvändig på specifika platser.

Specialiserade celler med immunfunktion i epitelet

Ett långvarigt koncept inom epitelial medfödd immunitet är förekomsten av celltypsspecifik medfödd immunigenkänning. Prototyper av de specialiserade epitelcellerna med försvarsfunktion är mikroveckcellerna (M) och Paneth-cellerna – nyligen kompletterade med en specialiserad bägarecell, sentinelbägarecellen. Förekomsten av sådana specialiserade celler framhäver de intrikata och redundanta systemen som säkerställer balansen mellan näringsupptag, samexistens med mikrobiotan och övervakning av möjliga inkräktare. Riktad differentiering av organoider tillåter nu också studier av dessa celler i cellkultur.

M-celler är belägna i det follikelassocierade epitelet som täcker Peyers fläckar. De har en unik morfologi med oregelbundna borstkanter och reducerade mikrovilli-strukturer. Deras roll är att transportera antigener i tarmlumen över epitelskiktet till den underliggande lymfoida vävnaden för reglering av immunsvar [47]. M-celler själva såväl som det follikelassocierade epitelet visades uttrycka flera TLRs [48] (granskas i [14]). M-celler har dock varit svåra att studera eftersom det inte finns många i epitelvävnaden och de finns bara nära den komplexa strukturen av Peyers plåster [47]. Ändå kan M-celler genereras i organoida kulturer med hjälp av riktad differentiering. För detta tillsätts receptoraktivatorn för NF-KB-ligand (RANKL) till mediet, vilket uppreglerar transkriptionsfaktorn SpiB, vilket är karakteristiskt för M-cellsdifferentiering [49]. Organoider genererade från möss som är genetiskt bristfälliga för NF-KB-subenheten RelB kan inte producera M-celler efter stimulering med RANKL, vilket indikerar att NF-KB-aktivering är avgörande för utvecklingen av M-celler [50]. I human organoid kultur, förutom RANKL, är lymfotoxin och retinsyra avgörande för att inducera differentiering mot M-celler. Dessa M-celler tar specifikt upp enteriska virus som rotavirus och reovirus, vilket indikerar korrekt fenokopiering av den naturliga M-cellfunktionen även i organoida kulturer [51]. Framtida organoidarbete kommer att behöva fortsätta för att reda ut sammankopplingen av epitelial NF-KB-signalering, M-cellsutveckling och kommunikation med immunceller.

Paneth-celler blandas med tarmstamcellerna vid basen av kryptan och har länge ansetts vara stamcellsfackets väktare eftersom de utsöndrar antimikrobiella peptider. Till exempel utsöndrar Paneth-celler alfa-defensiner, en process som har visat sig regleras av mikrobiella mönster och medfödda immunmekanismer [52, 53]. Dessutom reglerar NOD2, som först upptäcktes i kryptområdet i den murina tunntarmen [54], utsöndringen av flera alfa-defensiner av Paneth-celler, vilket i sin tur leder till aktivering av adaptiv immunitet. Paneth-celler uttrycker också TLR5 och Paneth-cellberikade organoider uttrycker särskilt höga nivåer av TLR5. RNA-sekvensering efter stimulering avslöjar att medan normala organoider i tunntarmen endast uttrycker måttliga nivåer av TLR5 nedströms målgener som svar på stimulering med flagellin, såsom NF-kB-inducerade cytokiner, är organoider som är riktade att innehålla ett stort antal Paneth-celler en mycket starkare svar, vilket indikerar att Paneth-celler är de viktigaste svararna på flagellin i tunntarmen [44, 45]. I motsats till målgenuttryck utlöses inte det mest dramatiska svaret från Paneth-celler (degranulering, extrudering och celldöd) av stimulering med TLR-ligander utan kräver snarare stimulering med det professionella immuncellshärledda cytokininterferon-gamma [55]. Dessa resultat från organoider överensstämmer med observationerna som visar Paneth-celldegranulering och extrudering efter interferon-gamma-stimulering in vivo [55]. Detta understryker elegant systemet med kontroller och balanser i epitelskiktet.

Bägareceller är viktiga för epitelialförsvar eftersom de producerar de glykosylerade mucinerna som är avgörande för bildandet av en slembarriär på epitelskiktet (recensat i [56]). Hos möss resulterar MUC2-brist i spontan inflammation och ökar infektionskänsligheten [57, 58]. Nyligen beskrevs en undergrupp av bägareceller som heter sentinel bägareceller i musens kolon. Med hjälp av vävnadsexplantat identifierade studien förtjockning av slemskiktet som svar på exponering för TLR1/2, 4 och 5 ligander, men inte för TLR9, NOD1 och NOD2 ligander [59], i överensstämmelse med en tidigare rapport av Tlr 2 ,4 och 5 uttrycks i bägareceller [60]. Författarna fastställde att svaret också berodde på närvaron av Nlrp6-inflammasomen och var oberoende av slemhinnelymfocyter med hjälp av vävnader från en rad knockout-möss [59]. En tidigare rapport visade också vikten av NLRP6-inflammasomen för slemutsöndring av bägareceller [61]. Avbildning avslöjade att specifika bägareceller belägna i de apikala regionerna av krypten endocytoserade fluorescensmärkta LPS [59]. Dessa nyligen kallade sentinel-bägarceller genomgår inte bara snabb degranulering och epitelial utdrivning efter behandling med TLR-ligander utan överför också en kalciumsignal till angränsande celler via intercellulära cytoplasmatiska bryggor bildade av gap junctions, vilket sannolikt stimulerar andra bägareceller att öka slemsekretionen [59] . Både bägareceller och Paneth-celler tillhör den sekretoriska linjen. Organoider tillåter riktad differentiering mot båda cellidentiteterna, vilket ger organoider som är kraftigt berikade i antingen bägareceller eller Paneth-celler [62]. Att jämföra transkriptomer av dessa sneda organoider hjälpte till att identifiera nyckelregulatorer för differentieringsvägen [63]. Ytterligare analys av omics-data samt funktionell analys av dessa organoider kommer att möjliggöra en bättre förståelse av båda celltypernas roll i det medfödda immunförsvaret.

Slutligen har stamceller själva också rapporterats uttrycka specifika PRRs såsom TLR4 [64, 65], som inte finns på murina tunntarmsvilli eller Paneth-celler [66]. Dessutom verkar majoriteten av Nod2-uttryck i den murina kryptan vara begränsad till stamceller [67]. Stimulering med NOD2-ligand ökade överlevnaden av stamceller och bildningen av organoider, vilket indikerar att stimulering av PRR också kan reglera tarmepitelregenerering direkt.

Utan tvekan kommer de nuvarande ansträngningarna att generera atlaser av genuttryck som täcker varje celltyp i allt mer detalj snart ge en mer komplett bild av den cellulära organisationen av medfödd immunsignalering i tarmen såväl som i hela kroppen [68–71 ].

Cellpolaritet och sidospecifika medfödda immunsvar

Slutligen är det också relevant att överväga att gastrointestinala epitelceller är mycket polariserade, med en specialiserad apikala sida vänd mot tarmens lumen med dess mikrobiota, och en basolateral sida vänd mot vävnaden. Under homeostas når MAMPs endast den apikala sidan. Men när epitelbarriären bryts kan mikroorganismer också utmana den basolaterala sidan. Det har därför antagits att epitelceller selektivt kan ge ett pro-inflammatoriskt svar endast när de stimuleras från den basolaterala sidan, för att matcha hotet som signalen utgör. Till exempel visades TLR9 inducera distinkta signalvägar när det stimuleras från den apikala eller basolaterala sidan i cancercellinjer [72] och TLR5 inducerade endast NF-KB-svarsgenen IL-8 när den stimulerades från bassidan [73 ].
Medan tidigare studier med antikroppsmärkning mot TLR:er har rapporterat specifikt uttryck endast på ena sidan (granskas i [14, 16]), bekräftade inte analys av TLR-reportermöss med färgning av en HA-tagg detta utan visade istället TLR2, 4 och 5 receptorer på både apikala och basala sidor av den proximala tjocktarmen samt vissa intracellulära TLR4 [45]. Dessa uppenbara skillnader beror sannolikt på de olika tekniska tillvägagångssätten.

Organoider tillåter nu direkt funktionell testning av sidospecifika immunsvar, eftersom den cellulära polariseringen behålls i organoider. Under standardförhållanden när organoider odlas i en extracellulär matris, är den apikala sidan vänd mot organoidens lumen och den basala sidan mot den extracellulära matrisen [74–76]. När den odlas utanför en extracellulär matris kan polariteten vända [77, 78]. När celler från organoider sås på standardcellodlingsytor, såsom odlingsskålar eller transwells, är den apikala sidan vänd mot brunnens lumen [44, 79–82].

Flera studier använde organoider för att testa den allmänna funktionen hos särskilda PRR utan att ta upp specifika skillnader mellan apikal och basal stimulering. Dessa studier inkluderade stimulansen i mediet av organoiderna, som under standardförhållanden stimulerar den basala sidan av cellen. Med hjälp av denna teknik identifierades uppreglering av NF-KB nedströms målgener efter basal stimulering med ligander av TLR4 i magen, TLR2 och 3 i tunntarmen och TLR2, 3, 4 och 5 i tjocktarmen hos möss [44, 45, 83] och till ligander av TLR2 och 5 i magen och TLR5 i tunntarmen och kolon hos människa [44]. Dessutom inducerade basal stimulering av murina kolonorganoider med TLR4-agonister celldifferentiering, särskilt mot den sekretoriska härkomsten [64], medan NOD2-agonister inducerade ökad överlevnad av stamceller [67, 84] och taurinstimulerade NLRP6-beroende uppreglering av den inflammasom nedströms målgenen IL-18 [85]. I alla dessa studier testades inte apikal stimulering.

Endast ett fåtal studier har behandlat de sidospecifika funktionerna hos PRR. Det är anmärkningsvärt att i motsats till studierna som använder polariserade cancercellinjer, hittills har ingen av studierna som använder organoider identifierat en sidospecifik aktivering av en typisk NF-KB-beroende proinflammatorisk gen. Transwell-monoskikt härledda från humana kolonorganoider uttrycker liknande nivåer av NF-KB-målgenen IL-6 när de stimuleras från den apikala eller basala sidan med ligander av TLR1/2, 3, 4, 5, 7/8 och 9 [82]. Murina magorganoider svarade också på en apikal stimulering med TLR4-liganden LPS i flera analyser, inklusive i transwells och mikroinjektion av LPS i organoidernas lumen [44]. Murina tunntarmsepitelceller uttryckte inte NF-KB-målgenen icam1 som svar på en rad ligander, oavsett om de tillsattes till intakta organoider, vilket stimulerade bassidan, eller till enstaka, dissocierade celler, vilket stimulerade alla sidor [55].

Men ser man bortom NF-KB-svaret, identifierade en nyligen genomförd studie en sidospecifik funktion av TLR3 och dess betydelse vid virusinfektion [82]. Resultat av experiment med humana kolonorganoidhärledda monolager visade att uttrycket av de kritiska virusförsvarsgenerna typ I och typ III interferon uppreglerades efter basal stimulering med TLR3-agonist, men inte efter stimulering med andra TLR-agonister. När de infekterades med ett virus var organoidernas interferonrespons på liknande sätt mycket starkare när de infekterades från bassidan jämfört med infektion från den apikala sidan. Detta var synligt i organoid-härledda monolager såväl som i organoider mikroinjicerade med viruset. Studien identifierade vidare den clathrin-sorterande adaptern AP-1B som molekylen ansvarig för det polariserade uttrycket av TLR3. På motsvarande sätt visade möss med brist på Ap-1b förvärrade immunsvar efter virusinfektion [82]. Detta bekräftar den polariserade funktionen av PRR och belyser vikten av denna nivå av reglering för att ytterligare modulera patogenigenkänning och försvar.

Än så länge finns det inget "one size fits all"-svar på polaritetsfrågan, och att lösa den platsspecifika karaktären hos PRR-signalering förblir en tekniskt utmanande uppgift för framtiden.

Tolerans som ett svar på kolonisering och som ett standardutvecklingsprogram

Mekanismerna som bidrar till organiseringen av epitelial medfödd immunitet är fortfarande oklara. Huvudkonceptet i detta avseende har varit induktionen av tolerans efter kolonisering av den sterila tarmen under födseln, det så kallade möjlighetsfönstret (recenserat i [86–88]). Detta koncept postulerar en primingperiod för det medfödda och adaptiva immunsystemet efter födseln, vilket sätter scenen för immunhomeostas och efterföljande värd-mikrobiella interaktioner.

Det neonatala immunsystemet och epitelial medfödd immunitet är unikt utrustade för att bemästra denna övergång från sterilitet till samexistens med mikrobiotan. Vid födseln är den mänskliga neonataltarmen helt mogen med tarmvilli och kryptor som innehåller Paneth-celler. Det murina neonatala tarmepitelskiktet är mer omoget och genomgår en dramatisk förändring som kan mätas på transkriptomnivån som jämför olika utvecklingsstadier [89] och är synligt i vävnadsarkitekturen och celldifferentieringen: Krypt-villus-axeln är inte bildad ännu och cellproliferation är lägre, utan cellmigration eller exfoliering. Den innehåller inte mogna Paneth-celler; emellertid producerar enterocyter den katelicidinliknande antimikrobiella peptiden (CRAMP) [90]. Panethceller uppstår när krypter bildas 2 veckor efter födseln [91]. Vid tidpunkten för avvänjning är epitelet helt bildat med krypter och villi, enterocyter, bägareceller och enteroendokrina celler; Paneth-celler har tagit över den antimikrobiella peptidproduktionen; och bägareceller har ökat produktionen av muciner för att bilda slemskiktet (recensat i [92]).

Denna åldersberoende övergång av epitelet går hand i hand med en gradvis minskning av TLR5-uttryck i tunntarmsepitelet. Samtidigt ökar uttrycket av TLR3 under neonatalperioden. Andra PRR, såsom TLR2, 4 och 9, uttrycks på liknande nivåer i neonatala och vuxna möss [45, 93].

Mekanismerna som leder till reglering av PRR-uttryck och funktion efter födseln är fortfarande oklara. Som nämnts ovan har flera studier föreslagit ett bidrag från miljön, i synnerhet mikrobiell kolonisering, till regleringen av PRR-uttryck efter födseln [40, 41] (granskas i [14]). Emellertid visade bakteriefria vs specifika patogenfria möss inga skillnader i TLR-uttryck i varken tunntarmen eller tjocktarmen, vilket indikerar att varken uppreglering av TLR3 eller nedreglering av TLR5 i denna tidiga period beror på mikrobiotan [45, 93]. Också i organoider var uttrycket av många, men inte alla, PRR-signalkomponenter redan definierat i organoider från vävnader som aldrig hade varit i kontakt med mikrobiella produkter [44]. Detta indikerar att en stor del av organisationen av de medfödda immunsignalvägarna definieras oberoende av kontakt med mikrobiotan och verkar bestämmas av standardutvecklingsprocesser, såsom de som beskrivs ovan, som formar den allmänna vävnadsidentiteten längs mag-tarmkanalen. . Detta utesluter inte en ytterligare finjustering av PRR-uttryck av miljöfaktorer under vuxen ålder.

Vikten av snabb reglering av epiteliala mikrobiella interaktioner blir tydlig när det omogna epitelet i förtid konfronteras med mikrobiell kolonisering: för tidigt födda barn är benägna att utveckla nekrotiserande enterokolit (NEC), kännetecknad av intestinal nekros, systemisk sepsis och multipel organ fel. Även om patogenesen anses vara multifaktoriell, har flera studier indikerat att den utvecklas som svar på en obalans mellan proinflammatoriska signalerings- och reparationsmekanismer i den prematura tarmen (reviderad i [94]) och ett bidrag från PRR har föreslagits [41, 65, 95 –97]. Flera studier har använt humana fetala organoider [24, 98, 99], normala murina organoider exponerade för bakterier och hypoxi till modell NEC [100], eller organoider från en murin NEC-modell såväl som från NEC-patienter [101]. Framtida studier kommer att använda dessa etablerade och nya organoida modeller för att ytterligare definiera epitelets bidrag i NEC.

Modellering av epitelberoende aspekter av IBD med organoider

Förlust av integritet av integriteten av tarmepitelet är ett avgörande kännetecken för IBD, dvs CD och UC, och tycks orsakas av ett multifaktoriellt samspel av genetisk predisposition, miljöfaktorer, förändringar av tarmmikrobiota och förändringar av det lokala och systemiska immunsvaret (recensionerad) i [27]). Nuvarande terapier riktar sig främst till de (avvikande) immunsvaren vid IBD, som är förknippade med höga frekvenser av icke-responderare och biverkningar (recensat i [27]). En förbättrad förståelse av det epitelspecifika bidraget till patofysiologin för IBD krävs för att identifiera nya terapeutiska mål som också kan ha en direkt inverkan på restaurering av tarmepitelbarriären och därmed slemhinneläkning.

För att få insikter i epitelial patologi har flera grupper etablerat levande biobanker bestående av organoider genererade från enskilda patienter med UC eller CD. Även om detta tillvägagångssätt är uppenbart, har hittills endast ett fåtal studier rapporterat resultat från organoider som härrör från denna grupp av patienter [102-104]. Detta kan förklaras av observationen att organoider från patienter med IBD är svårare att generera. Vår egen erfarenhet är att organoider som genererats från CD-patienter växer långsammare under de första passagerna och vissa prover gick förlorade - vilket var associerat med en högre grad av bakteriell kontaminering i kulturerna [105].

Karakterisering av organoider som härrör från patienter med IBD avslöjade en fenotyp med minskad storlek och spirande kapacitet, ökad celldödshastighet, luminala skräp och delvis inverterad polarisering av epitelceller [106]. Global jämförelse av organoider från UC- eller CD-patienter och friska kontroller visade att transkriptions- och metyleringsskillnader som ses i tarmepitel bibehölls in vitro [102, 103, 107]. En tidigare studie från organoider som genererats från patienter med CD föreslog också permanenta förändringar av intestinala stamceller i IBD. Detta baserades på observationen att organoider genererade från aktiva CD-lesioner bibehöll höga uttrycksnivåer av intestinala epitelstamcellsmarkörer [108]. Detta bekräftades till viss del i en nyligen genomförd studie där kolonorganoider härrörande från pediatriska IBD-patienter visade ett förlängt uttrycksmönster av antigenpresenterande gener [109].

Med fokus på förändringar i intestinal epitelbarriärfunktion, inklusive förlust av tight junctions och desmosomer, som vanligtvis finns i IBD [110], visades det att organoider från CD-patienter bibehåller denna fenotyp av junctional förändringar under odlingsförhållanden [105]. Detta var särskilt fallet när organoider genererades från platser med allvarlig inflammation [105]. En minskning av kopplingsproteiner kan också induceras i organoider från friska donatorer genom applicering av det proinflammatoriska cytokinet TNF- och/eller IFN- [106, 111]. Det fasta mönstret av förändringar av kopplingsproteiner i organoider från patienter med IBD observerades dock endast på proteinnivå men inte på mRNA-nivå [105].

Dessa observationer tyder på att flera förändringar är fixerade i organoider från IBD-patienter. Observationen att vissa, men inte alla, permanenta förändringar endast är synliga på protein, men inte på RNA-nivå, tyder på att det finns permanenta förändringar i post-transkriptionella modifieringar eller proteinnedbrytning i organoider från IBD-patienter. Detta återstår dock att utreda i detalj.

Exakt vad som inducerar de permanenta förändringarna i uttrycksmönster för det inflammerade epitelet är oklart. En effekt av mikrobiotan var länge misstänkt; dock visade en nyligen genomförd studie att effekten av mikrobiotan på epitelet går förlorad med tiden [112]. Studien jämförde flera musanläggningar eftersom de olika mikrobiomsammansättningarna av muskolonier har identifierats som störande faktorer in vivo-studier. För att klargöra denna effekt jämförde studien epitelisolat och organoidkulturer från bakteriefria möss och två separata specifika patogenfria muskolonier med olika mikrobiota. Medan det nyligen isolerade epitelet visade ett avtryck av mikrobiotaexponeringen på RNA- och proteinnivåer, förlorades denna effekt efter flera veckors odling av organoider i tunntarmen [112]. En global jämförelse av genuttryck av organoider genererade från inflammerade eller icke-inflammerade regioner hos samma IBD-patienter visade också att IBD-organoiderna i de inflammerade regionerna förlorade det inflammatoriska genuttrycket redan efter några veckor i odling. Transkriptomerna av organoiderna grupperades sedan per patient; sålunda kvarstod de permanenta skillnaderna mellan IBD och friska kontroller. Den inflammatoriska fenotypen i IBD-organoiderna kan sedan återinduceras genom tillsats av en cytokincocktail [107]. Sammantaget tyder detta på att permanenta förändringar som observerats i organoider från IBD-patienter är oberoende av kontakt med mikrobiota eller cytokiner.

Så även om det är rimligt att spekulera i att vissa av de permanenta förändringarna i tarmepitelceller från patienter med IBD kan orsakas av förändringar i medfödd immunsignalering, är bevisen för detta för närvarande knappa. Dessutom är inte alla epitelförändringar som observeras i de inflammerade regionerna i tarmen permanent bevarade i det renade epitelet, vilket indikerar viktiga bidrag från den lokala miljön. I framtiden bör nya studier med mer komplexa organoidmodeller, som även innehåller immunceller, inflammatorisk cytokinstimulering och samkulturer med mikroorganismer, hjälpa till att ta itu med denna hypotes mer i detalj.

Slutsatser, framtidsperspektiv och Outlook

Sammanfattningsvis, medan många sjukdomar i mag-tarmkanalen fortfarande är ofullständigt förstådda, pekar ökande bevis på en avgörande roll för det gastrointestinala epitelet i patogenesen av många av dem - även om dess specifika roll fortfarande är oklar.

Den begränsade kunskapen om den medfödda immunfunktionen hos det gastrointestinala epitelet har tillskrivits en brist på lämpliga experimentella modeller. Med implementeringen av organoidteknologi har ett stort steg tagits för att övervinna detta problem. Organoider som genereras från varje region i mag-tarmkanalen kommer att lägga avsevärt till den befintliga kunskapen. Som avslöjats av tidigare studier ger genereringen av organoider den avgörande fördelen att kunna observera svar från primära gastrointestinala celler i motsats till transformerade cellinjer, som mestadels genereras från maligna gastrointestinala tumörer. En av de mest fascinerande egenskaperna hos organoider är att de bibehåller specifika egenskaper hos det segment av mag-tarmkanalen de genererades från som en del av sin cellidentitet under vuxen ålder. Enligt aktuella experimentella studier är den regionala identiteten fixerad i gastrointestinala stamceller. I detta sammanhang kommer en återstående fråga att vara att bestämma exakt hur och när under utvecklingen denna inneboende programmering sker.

När man tittar på specifika koncept för hur epitelet kan reagera på eller interagera med omgivningen, har organoidteknologi nu möjliggjort belysning av det differentiella och segmentspecifika uttrycket och funktionen av PRR inom det gastrointestinala epitelet. De övergripande funktionella konsekvenserna för de komplexa regulatoriska systemen inom hela mag-tarmkanalen är fortfarande oklara och kommer att behöva åtgärdas i framtiden. För detta kommer det också att vara viktigt att samodla organoider med immunceller (granskas i [113]), celler i det enteriska nervsystemet [114] och luminala faktorer såsom bakteriella samkulturer (granskas i [115]) (Fig. 4).

En ytterligare viktig aspekt är att organoider som genereras från patientvävnad som påverkas av GI-sjukdomar såsom IBD bibehåller några av de egenskaper som ses i motsvarande vävnadsprover som de härrörde från. Detta erbjuder den unika möjligheten att ytterligare reda ut det epitel- och sjukdomsspecifika bidraget till patogenesen av GI-sjukdomar - inte bara de som involverar inflammationsinducerade förändringar utan också de som involverar förändringar i maligna sjukdomar. Båda kan visa sig involvera ett specifikt bidrag av epitelhärledd medfödd immunitet. För detta skulle ett systematiskt inrättande av "levande biobanker" vara ett viktigt steg. Som en framtidsvision skulle sådana levande biobanker kunna kopplas till redan befintliga biobanker, som för närvarande tillhandahåller enbart "döda" biomaterial. Detta skulle utgöra ytterligare ett viktigt steg inte bara för forskning utan också för att underlätta individualiserad diagnostik och terapi för patienter.

Ruta 1. Medfödd immunitet och epitelceller i mag-tarmkanalen är oklart om den observerade påverkan beror på den medfödda immunsignaleringen i epitelceller eller professionella immunceller.

För att reda ut samspelet mellan professionella immunceller och epitelceller har flera studier använt epitelspecifika knockouts, eller på senare tid, epitelorganoider. I musmodeller leder ingen av de epitelspecifika deletionerna av PRR till spontan inflammation. Möss med epitelspecifik knockout av MyD88 är dock mer mottagliga för experimentell kolit och visar allvarliga barriäravbrott, försämrade bägare- och Paneth-cellsvar [121] och minskad produktion av mucin och antimikrobiella peptider [121, 122]. Organoider i tunntarmen ger inte ett inflammatoriskt svar på flera renade PRR-ligander [55], även om detta inte kan generaliseras och beror på arten, platsen och åldern på vävnaden som organoiderna genereras från [44, 45].

Frånvaron av en spontan inflammatorisk fenotyp i epitelcellsspecifika PRR knockout-modeller stöder hypotesen att andra faktorer än en allmän inflammatorisk respons av epitelet har en inverkan på epitelial homeostas. Till exempel ökade stimulering med NOD2-agonisten muramyldipeptid (MDP) antalet organoider som växer ut ur isolerade stamceller, vilket indikerar att den medfödda immunsignaleringen stödde stamcellernas överlevnad [67, 84]. Dessutom framhäver data från möss vikten av de anti-apoptotiska effekterna av NF-KB-signalering som svar på andra stimuli, såsom TNF- [123]. Intressant nog är att hos människor är polymorfier i medfödda immungener inklusive NOD2 och TLR4 associerade med en ökad risk att utveckla IBD [124] och blockering av TNF- är för närvarande den mest effektiva behandlingen för IBD hos vissa patienter (recensat i [125]).

En bild framträder, där en låg nivå av medfödd immunstimulering är viktig för slemsekretion, barriärintegritet och epitelcellers överlevnad. Dess försämring kan tillåta translokation av tarmbakterier från lumen till subepitelvävnaden, vilket leder till inflammation.

Erkännanden

Vi tackar Ömer Kaya för hjälpen med illustrationerna och Rike Zietlow för redigering.

Författarbidrag

Idé: SB Initialt koncept: SB och Ö.K.; litteratursökning: Ö.K., NS, och SB; Ursprungligt utkast: Ö.K. Revidera, skriva om, lägga till avsnitt: NS, SB Alla författare har kritiskt reviderat det slutliga manuskriptet.

Finansiering

Open Access-finansiering aktiverad och organiserad av Projekt DEAL. Detta arbete fick stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; 3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens, Project 10, to SB), Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF; www.med.uni-wuerzburg.de/izkf /startseite) i Würzburg (Grant AD-427 till NS och SB), och DFG SPP1982 SCHL1962/5-2 till NS.

Deklarationer

Intressekonflikt

Författarna deklarerar inga konkurrerande intressen.

Fri tillgång

Den här artikeln är licensierad under en Creative Commons Attribution 4.0 internationell licens, som tillåter användning, delning, anpassning, distribution och reproduktion i vilket medium eller format som helst, så länge du ger lämplig kredit till originalförfattaren/författarna ) och källan, tillhandahåll en länk till Creative Commons-licensen och ange om ändringar har gjorts. Bilderna eller annat material från tredje part i denna artikel ingår i artikelns Creative Commons-licens om inte annat anges i en kreditgräns till materialet. Om material inte ingår i artikelns Creative Commons-licens och din avsedda användning inte är tillåten enligt lagstadgade regler eller överskrider den tillåtna användningen, måste du få tillstånd direkt från upphovsrättsinnehavaren.

Referenser

1. Goodwin CS (1984) Mikrober och infektioner i tarmen

2. Sekirov I, Russell SL, Antunes LCM, Finlay BB (2010) Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev 90:859–904

3. Simon GL, Gorbach SL (1986) Den mänskliga tarmens mikroflora. Dig Dis Sci 31:147S–162S

4. Bartfeld S, Clevers H (2017) Stamcellshärledda organoider och deras tillämpning för medicinsk forskning och patientbehandling. J Mol Med:1–10. https://doi.org/10.1007/s00109-017-1531-7

5. Barker N (2014) Vuxna intestinala stamceller: kritiska drivkrafter för epitelial homeostas och regenerering. Nat Rev Mol Cell Biol 15:19–33

6. Bartfeld S, Koo BK (2017) Vuxna gastriska stamceller och deras nischer. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 6:e261. https://doi.org/ 10.1002/wdev.261

7. Liwinski T, Zheng D, Elinav E (2020) Mikrobiomet och cytosoliska medfödda immunreceptorer. Immunol Rev 297:1–18

8. Burgueño JF, Abreu MT (2020) Epiteliala Toll-liknande receptorer och deras roll i tarmhomeostas och sjukdom. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 17:263–278

9. Christian S, Kanneganti TD (2020) Inflammasomer och den fina gränsen mellan försvar och sjukdom. Curr Opin Immunol 62:39–44

10. Ying L, Ferrero RL (2019) Rollen av NOD1 och ALPK1/TIFA-signalering i medfödd immunitet mot Helicobacter pylori. Infektion s:159–177

11. Takeuchi O, Akira S (2010) Mönsterigenkänningsreceptorer och inflammation. Cell 140:805–820

12. Peterson LW, Artis D (2014) Intestinala epitelceller: regulatorer av barriärfunktion och immunhomeostas. Nat Rev Immunol 14:141-153

13. Pott J, Hornef M (2012) Medfödd immunsignalering vid tarmepitel vid homeostas och sjukdom. EMBO Rep 13:684–698

14. Abreu MT (2010) Toll-liknande receptorsignalering i tarmepitel: hur bakteriell igenkänning formar tarmfunktionen. Nat Rev Immunol 10:131-144

15. Zhang K, Hornef MW, Dupont A (2015) Tarmepitel som väktare av tarmbarriärens integritet. Cell Microbiol 17:1561-1569

16. Yu S, Gao N (2015) Uppdelning av tarmepitelcellstullliknande receptorer för immunövervakning. Cell Mol Life Sci 72: 3343-3353

17. Zhou P, She Y, Dong N, Li P, He H, Borio A, Wu Q, Lu S, Ding X, Cao Y, Xu Y, Gao W, Dong M, Ding J, Wang DC, Zamyatina A, Shao F (2018) Alfa-kinas 1 är en cytosolisk medfödd immunreceptor för bakteriell ADP-heptos. Natur. 561:122–126

18. Milivojevic M, Dangeard AS, Kasper CA, Tschon T, Emmenlauer M, Pique C, Schnupf P, Guignot J, Arrieumerlou C (2017) ALPK1 kontrollerar TIFA/TRAF6-beroende medfödd immunitet mot heptos{{5} },7-bisfosfat från gramnegativa bakterier. PLoS Pathog 13:e1006224. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1006224

19. Zimmermann S, Pfannkuch L, Al-Zeer MA et al (2017) ALPK1- och TIFA-beroende medfödd immunrespons utlöst av utsöndringssystemet helicobacter pylori typ IV. Cell Rep 20:2384-2395

20. Abreu MT, Fukata M, Arditi M (2005) TLR-signalering i tarmen vid hälsa och sjukdom. J Immunol 174:4453–4460 174/8/4453 [pii]

For more information:1950477648nn@gamil.com