Genkloning, funktionell identifiering, strukturell och uttrycksanalys av sackarossyntas från Cistanche Tubulosa

Abstrakt:Sackarossyntas spelar en avgörande roll i växtsockrets metabolismväg genom att katalysera produktionen av uridindifosfat (UDP)-glukos, som fungerar som en bioaktiv glykosyldonator för olika metaboliska processer. I denna studie klonades en sackarossyntasgen vid namn CtSus frånCistanche tubulosa, en traditionell kinesisk medicin känd för sina rikainnehåll av olika glykosider, baserat på transkriptomanalysresultat. Den öppna läsramen för CtSus var 2 418 bp lång och kodade för 805 aminosyror. Sekvensanalys avslöjade konserverade domäner associerade med växtsackarossyntasfamiljen vid både de N-terminala och C-terminala regionerna av CtSus-proteinet. Filogenetisk analys visade att CtSus har ett nära evolutionärt samband medsackarossyntaserfrån andra växter inom samma ordning. Funktionell identifiering av CtSus utfördes genom helcellskatalyskoppling med UGT71BD1, ett karakteriserat glykosyltransferasenzym. Resultaten visade att införandet av CtSus signifikant ökade omvandlingshastigheten för glykosylering katalyserad av UGT71BD1. Det lösliga uttrycket av CtSus i Escherichia coli uppnåddes ytterligare med användning av pCold™ TF-expressionsvektorn. Enzymatisk analys in vitro indikerade aktiviteten av CtSus för att katalysera bildningen av UDP-glukos i närvaro av sackaros och UDP. Realtidsresultat av kvantitativ polymeraskedjereaktion visade att uttrycksmönstren för CtSus-genen i olika delar av C. tubulosa och suspensionscellkulturerna av C. tubulosa under torkastress korrelerade med ackumuleringsmönstren som observerades för fenyletanolglykosider. Dessutom undersöktes nyckelaminosyror och deras interaktioner mellan enzym och substrat baserat på förutsägelse av proteinstruktur och molekylära dockningsresultat. Sammantaget identifierar våra fynd en sackarossyntas CtSus som ansvarar för tillförseln av den aktiva glykosyldonatorn UDP-glukos under biosyntesen av glykosidprodukter i C. tubulosa och har också tillhandahållit ett genelement som kan användas i teknisk stamkonstruktion för produktion av glykosidprodukter.

Nyckelord: Cistanche tubulosa; sackarossyntas; glykosider; UDP-glukos; enzymatisk katalys

DICHEN CISTANCHE ODLAR BASER I YUTIAN,HOTAN, XINJIANG

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wightär en flerårig örtartad parasitisk växt av släktet Cistanche i familjen Orobanchaceae. Det är ett traditionellt sällsynt och dyrbart kinesiskt medicinskt material, hemma i Xinjiang och Inre Mongoliet. Den är söt, salt och varm till sin natur, och har funktionerna somtonifierande njure yang, gynnar essens och blod, och fukta tarmarna ochlindra förstoppning. Det är känt som "öken ginseng" [1] Modern forskning har funnit detCistanche tubulosainnehålleren mängd olika kemiska komponentersåsomfenyletanoidglykosider, iridoid eter terpeneroch deras glykosider, lignaner och deras glykosider, oligosackaridestrar, polysackarider, polyoler, oligosackarider, steroler och deras glykosider, monoterpenoidglykosider, sockerarter, aminosyror och flyktiga oljor [2,3], särskilt glykosidföreningar är de viktigaste aktiva ingredienserna. Bland dem har fenyletanoidglykosidföreningar det högsta innehållet i det ursprungliga medicinska materialet och har ett brett utbud av farmakologiska aktiviteter såsom neuroprotection och anti-aging [4]. Biosyntesen av de ovan nämnda glykosidföreningarna involverar flera steg av glykosyleringsreaktioner, som katalyseras avglykosyltransferaser i växter, ochtillhandahållande av aktiva glykosyldonatorerär avgörande i denna process. Vanliga aktiva sockerdonatorer i organismer inkluderar uridindifosfat (UDP), tymidindifosfat (TDP) och guanosindifosfat (GDP). Bland dem är UDP-glukos den vanligaste aktiva glykosyldonatorn i växter. Det kan inte bara kännas igen direkt av glukosyltransferas för att katalysera glukosylöverföringsreaktionen, utan kan också användas som en prekursor för att delta i syntesen av andra typer av glykosyldonatorer. Till exempel kan UDP-glukos användas som ett substrat för att generera UDP-ramnos under katalys av 4,6-dehydratas, 3,5-isomeras och 4-reduktas[5]; UDP-glukos kan användas som ett substrat för att katalysera syntesen av UDP-xylos genom UDP-glukosdehydrogenas och UDP-xylossyntas; UDP-xylos kan ytterligare katalyseras av UDP-xylosepimeras för att generera UDP-arabinos[6]; UDP-glukos och UDP-galaktos är diastereomerer och kan omvandlas till varandra genom epimeras[7,8]. Därför har syntesen av UDP-glukos ett viktigt inflytande på tillgången på aktiva glykosyldonatorer i växter och glykosyleringsmodifieringen av sekundära metaboliter.

Syntesen av UDP-glukos i växter kan uppnås genom syntasvägen, fosforylasvägen och kinasvägen. Bland dem kan sackarossyntas direkt katalysera reaktionen mellan UDP och sackaros för att generera UDP-glukos och fruktos, såväl som den omvända reaktionen [9]. I en bred mening tillhör sackarossyntas underfamiljen glykosyltransferas-4, som inkluderar en mängd olika glykosyltransferaser, såsom sackarossyntesfosfatas, trehalossyntas och trehalosfosforylas [10]. Sackarossyntas identifierades först i vetegroddar [11]. Sedan dess har forskare identifierat hundratals sackarossyntasgener från en mängd olika växter som mungböna (Vigna radiata), ris (Oryza sativa), majs (Zea mays), sojaböna (Glycine max) och persika (Amygdalus persica). De är involverade i flera metaboliska processer i växter, inklusive sackarostransport och distribution, stärkelsesyntes, cellulosasyntes och cellväggssammansättning, biotisk och abiotisk stress, etc., och spelar en viktig reglerande roll vid allokering av växters kolkällor [12]. Dessutom, baserat på studiet av fysiologiska funktioner, använde forskare också det erhållna sackarossyntaset som ett genelement för enzymatisk syntes av glykosidföreningar och uppnådde idealiska resultat. Till exempel, Masada et al. [13] samuttryckte sackarossyntasgenen AtSus-1 från Arabidopsis thaliana och glykosyltransferasgenen CaUGT2 från Catharanthus roseus in vitro, och använde ett dubbelt enzymsystem i en pott för att katalysera glykosyleringsreaktionen av curcumin, vilket ökade utbyte av curcuminglykosid med 7 gånger. Samtidigt var mängden UDP-glukosdonator som användes endast en tiondel av den initiala mängden.

Bungaruang et al. [14] konstruerade ett kopplat katalytiskt system med sackarossyntas GmSuSy från sojaböna och glykosyltransferas OsUGT från ris. De uppnådde glykosyleringsmodifiering av nothofagin genom att endast tillsätta en liten mängd UDP (1,0 mmol·L-1) och sackaros. Jämfört med enkel enzymkatalys av OsUGT ökade produktionen av glykosyleringsprodukter med tre storleksordningar, från μmol·L-1 till mol·L-1.

Riken och mångfalden av glykosidföreningar i Cistanche tubulosa tyder på att det bör innehålla ett kraftfullt sackarossyntas relaterat till glykosyleringsmodifieringen av sekundära metaboliter, men detta enzym har inte rapporterats i växter av släktet Cistanche. I denna artikel användes Cistanche tubulosa, ett medicinskt material som ingår i farmakopén, som material. Genom transkriptomanalys och jämförande transkriptomanalys av olika delar användes molekylärbiologiska tekniker för att bryta och identifiera en sackarossyntasgen CtSus. Bioinformatikanalys, helcellsbiotransformation, prokaryot uttryck och rening, in vitro enzymkatalytisk aktivitetsanalys och genuttrycksanalys i olika delar av Cistanche tubulosa och växtvävnadsodlingssystem under torkastress utfördes för att utforska funktionen av CtSus och dess korrelation med biosyntesen av glykosidföreningar i Cistanche tubulosa, vilket lägger en grund för studiet av den biosyntetiska vägen för glykosidföreningar i Cistanche tubulosa.

Material och metoder

Material Färska Cistanche tubulosa-växter samlades in från Hotan City, Xinjiang, Kina, och biologisk identifiering utfördes av professor Tu Pengfei vid Peking University; systemet Cistanche tubulosa suspensionscellodling etablerades av vår forskargrupp i ett tidigt skede [15]; E. coliFast-T1 köptes från Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E. coli BL21 (DE3) köptes från Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pCold™ I och pCold™ TF-vektorer köptes från Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; UDP-glukoskontroll köptes från Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd., och aesculin- och resveratrolsubstrat köptes från Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

DICHEN CISTANCHE ODLAR BASER I HOTAN, XINJIANG

RNA-extraktion och cDNA-syntes RNA extraherades enligt instruktionerna från OMEGA RNA Plant Kit (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). Agarosgelelektrofores och Nanodrop 2000 spektrofotometer användes för att detektera renheten, koncentrationen och integriteten hos RNA. De kvalificerade RNA-proverna omvänt transkriberades med hjälp av omvänd transkriptionssatsen TransScript® OneStep gDNA-borttagning och cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) för att syntetisera den första kedjan av cDNA.

Utvinning av sackarossyntasgener och kloning av CtSus-gener Aminosyrasekvensen för det funktionellt identifierade Arabidopsis thaliana sackarossyntaset AtSus1 (GenBank accessionsnummer: AED92894.1)[16] användes som mall. Sackarossyntasgener screenades från transkriptomdata från C. tubulosa genom lokal Blastp-sekvensanpassning, kombinerat med transkriptomgenannotering, FPKM-analys (genuttrycksöverflöd) och jämförande transkriptomdataanalys. Specifika primrar designades baserat på kandidatgensekvensinformationen tillhandahållen av andra generationens transkriptomdata från C. tubulosa (tabell 1). C. tubulosa cDNA användes som mall och PCR-amplifiering av målgenen utfördes med användning av ett högtroget PCR-enzym (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). PCR-amplifieringsprodukten renades med hjälp av FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) och klonades sedan enligt snabbkloningssatsen (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) kopplades till pCE2 TA/Blunt-Zero-kloningsvektorn enligt bruksanvisningen, överfördes till Fast-T1-kompetenta celler och odlades över natten vid 37 grader. Plasmiden extraherades och skickades till Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. för sekvensering.

Tabell 1 Nukleotidsekvens för primrar som används i denna studie. qPCR: Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid

Bioinformatisk analys av sackarossyntas CtSus från Cistanche tubulosa

Onlineprogramvaran ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) användes för att analysera proteinets fysikalisk-kemiska egenskaper; onlineprogramvaran TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) användes för att förutsäga proteinets transmembranstruktur; onlineprogramvaran SOPMA (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) användes för att förutsäga proteinets sekundära struktur; onlineprogramvaran SMART (http://smart.embl.de/) användes för att förutsäga den konserverade domänen av proteinaminosyrasekvensen; programvaran DANMAN användes för att jämföra aminosyrasekvenserna för CtSus med de för sackarossyntaser från andra arter; Det fylogenetiska trädet konstruerades genom klusteranalys med användning av grannsammanfogningsmetoden med programvaran MEGA11, med en bootstrap-repetition på 1,000 gånger.

Expressionsanalys av CtSus i olika delar av Cistanche tubulosa och under torkastress

Realtidsfluorescenskvantitativa PCR-primers för CtSus och den interna referensgenen DNAj designades med hjälp av DNAMAN-programvara [17] (tabell 1). Den relativa uttrycksnivån för CtSus-genen i suspensionsceller av Cistanche tubulosa i olika delar av Cistanche tubulosa och under torkstress analyserades med realtidsfluorescenskvantitativ PCR. Kvantitativ PCR-analys av fluorescens i realtid utfördes med hjälp av TransStart® Top Green qPCR SuperMix Kit (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). Amplifieringsprogrammet antog en tvåstegsmetod: 94 grader i 30 s; 94 grader i 5 s, 60 grader i 30 s, upprepat i 40 cykler; den kördes på Bio-Rad CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratory, Hercules, CA, USA). 2–ΔΔCT-metoden användes för att analysera det relativa uttrycket av CtSus-genen i olika experimentella grupper. GraphPadPrism 9 användes för signifikansanalys och för att rita ett stapeldiagram.

Konstruktion av prokaryot expressionsvektor och heterolog expression av CtSus-genen Baserat på gensekvenseringsresultaten designades specifika primrar innehållande vektorhomologiarmar och restriktionsställen (tabell 1) för PCR-amplifiering. Målgenen CtSus konstruerades till pET-28a, pET-24b, pCold™ I och pCold™ TF-expressionsvektorer med användning av sömlös kloningsteknik med ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). Plasmiderna från de framgångsrikt konstruerade rekombinanta expressionsvektorerna extraherades och transformerades in i Escherichia coli expressionskompetent cell Transetta (DE3). Cellerna odlades i LB flytande medium innehållande 50 µg·mL-1 kanamycinsulfat (med pET-28a och pET-24b som uttrycksvektorer) eller 1{{ 22}}0 µg·mL-1 ampicillin (med pCold™ I och pCold™ TF som uttrycksvektorer) och 50 ug·mL-1 kloramfenikol, respektive, vid 37 grader och 200 r·min{{ 15}} med skakning tills A600-värdet för bakterielösningen nådde 0.4-0.6. Tillsätt isopropyl-beta-Dtiogalaktopyranosid (IPTG) vid en slutlig koncentration av 0,5 mmol·L-1 för att inducera proteinuttryck. Inkubera i en skakapparat med konstant temperatur vid 23 grader (med pET-28a och pET-24b som expressionsvektorer) eller 15 grader (med pCold™ I och pCold™ TF som expressionsvektorer), 180 r· min-1 i 16 timmar (med pET28a och pET-24b som expressionsvektorer) eller 24 timmar (med pCold™ I och pCold™ TF som expressionsvektorer), samla sedan in bakterierna genom centrifugering.

Lysbuffert (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0,5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } imidazol, 3 % glycerol, 100 mmol·L-1 fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mg·mL-1 lysozym, pH 7,4) tillsattes och cellerna bröts sönder under 8 minuter och centrifugerades. Supernatanten och fällningen togs respektive. Supernatanten adsorberades av HisTrap FF-affinitetskolonn (Cat 17531901, Cytiva) fylld med Ni Sepharose 6 Fast Flow-fyllmedel för att adsorbera målproteinet innehållande His-taggen. Efter eluering med olika koncentrationer av imidazol togs varje fraktion för SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores) detektion. Fraktionerna innehållande målproteinet kombinerades, koncentrerades genom centrifugering och avsaltades med ultrafiltreringsrör (Millipore) och lagrades i buffert [innehållande 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 ditiotreitol, 3 % glycerol] för efterföljande enzymatiska katalysreaktioner in vitro.

CtSus helcellskatalys pCold™ I-CtSus-plasmiden och expressionsplasmiden pET-28a-UGT71BD1[18] av glykosyltransferaset UGT71BD1, som hade identifierats av forskargruppen tidigare, transformerades samtidigt till den uttryckskompetenta E. coli Transetta (DE3). Positiva rekombinanta bakterier innehållande både CtSus- och UGT71BD1-gener selekterades och inokulerades i LB-medium (tillväxtmedium) innehållande 50 ug·mL-1 kanamycinsulfat, 100 ug ·mL-1 ampicillin och 50 ug·mL-1 kloramfenikol i ett förhållande av 1:100 (V/V). Kulturen odlades vid 37 grader tills bakterielösningens A600-värde var 0.4-0.6, och sedan tillsattes IPTG vid en slutlig koncentration av 1 mmol·L-1. Odlingen fortsatte vid 15 grader och 180 r·min-1 under 24 timmar. Kulturen centrifugerades vid 4 grader och 4 000 r·min-1. Samla cellerna. Inokulera de uppsamlade cellerna i M9-medium (fermenteringsmedium) i ett förhållande av 40 ml odlingsmedium per gram bakterier och tillsätt 75 μmol·L-1 sackaros och 25 μmol·L-1 aesculetin (1) eller resveratrol (2)-substrat till reaktionsgrupperna. Fortsätt skaka kulturen i 24 timmar, centrifugera vid 4000 × g, 4 grader i 30 minuter, tillsätt metanol för att ultraljudsbryta fällningen, tillsätt 2 gånger volymen metanol till supernatanten, centrifugera vid 4000 × g, 4 grader i 30 minuter, ta supernatanten och kombinera, indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck, återupplös i metanol, filtrera genom 0,22 μm filtermembran och detektera reaktionsprodukten med Agilent 1260 högpresterande vätskekromatograf. CAPCELL PAK C18-KOLONN (250 mm×4,6 mm, 5 µm) användes som analyskolonn, 0,1 % myrsyravatten (A) och metanol (B) användes som den mobila fasen, och elueringsgradienten var: {{61 }} min, 30 %-90 % B; 25-27 min, 90 %-100 % B; 27-33 min, 100 % B. Masspektrometriparametrarna var positiva och negativa jonlägen och automatiska flerstegs MS1, MS2 och MS3 fullskanningar.

Detektering av CtSus enzymkatalytisk aktivitet in vitro. Det rekombinanta proteinet erhållet genom ovannämnda HisTrap FF kolonnaffinitetskromatografi utsattes för avlägsnande av terminal etikett med användning av Faktor Xa. Enzymnedbrytningssystemet var enligt följande: det rekombinanta proteinet justerades till en koncentration av 1 mg·mL-1 och 1 μL Faktor Xa sattes till 50 μL av det rekombinanta proteinet i en buffert av 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol·L-1 NaCl och 2 mmol·L-1

CaCl2 vid 23 grader i 6 timmar. Reaktionssystemet var 100 μL. Produkten från enzymuppslutningssystemet utsattes för sekundär proteinseparation genom HisTrap FF-affinitetskromatografi för att erhålla målproteinet med tagborttagning för efterföljande enzymkatalysreaktioner in vitro. Enzymreaktionssystemet var som följer: 10 mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sackaros, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug CtSus-protein, Tris-HCl (pH 7.0) kompletterat med 100 μL, reagerat i ett vattenbad vid 30 grader i 6 timmar, och efterbehandlings- och HPLC-analysmetoderna utfördes enligt beskrivningen i referens [19].

Tredimensionell strukturförutsägelse och molekylär dockningsanalys av CtSus-protein AlphaFold2 användes för att förutsäga den tredimensionella strukturen av CtSus-protein [20]. Ligandmolekylen hydrerades och laddades med användning av AutoDock Tools 1.5.6 programvara. Substratbindningsfickan erhölls genom inriktning med mallproteinet AtSus1 (PDBID 3S28). Sidokedjorna av aminosyraresterna runt kaviteten sattes att vara flexibla.

Rutnätsrutan sattes till 40 × 40 × 40 Å3, och rutnätsavståndet var 0,375 Å. Molekylär dockning utfördes i AutoDock Vina [21]. PyMOL 2.0-programvaran användes för att visualisera modellen med den bästa affiniteten (kcat·mol-1

).

Statistisk analys GraphPad Prism 9 användes för statistisk analys. De experimentella data uttrycktes som medel ± standardavvikelse. t-testet användes för jämförelse mellan två grupper, och envägsvariansanalys användes för jämförelse mellan flera grupper. Skillnaden ansågs vara statistiskt signifikant när P < 0.05.