Glukos utövar en anti-melanogen effekt genom indirekt inaktivering av tyrosinas i melanocyter och en ekvivalent med mänsklig hud

Abstrakt:

Sockerarter finns överallt i organismer och är välkända kosmetiska ingredienser för att återfukta huden med minimala biverkningar. Glukos, ett enkelt socker som används som energikälla av levande celler, används ofta i hudvårdsprodukter. Flera rapporter har visat att socker och sockerrelaterade föreningar har anti-melanogena effekter på melanocyter. Den underliggande molekylära mekanismen genom vilken glukos hämmar melaninsyntesen är dock okänd, även om glukos används som blekning såväl som som en fuktgivande ingrediens i kosmetika. Här fann vi att glukos signifikant minskade melaninhalten i -melanocytstimulerande hormon (MSH)-stimulerade B16-celler och mörkt pigmenterade normala humana melanocyter utan tecken på cytotoxicitet.

Dessutom visade topisk behandling av glukos dess blekningseffektivitet genom fotografering, Fontana-Masson (F&M)-färgning och multifotonmikroskopi i en pigmenterad 3D-hudmodell, MelanoDerm. Glukos förändrade dock inte genuttrycket eller proteinnivåerna av större melanogena proteiner i melanocyter. Även om glukos kraftigt minskade den intracellulära tyrosinasaktiviteten i melanocyter, minskade den inte svamptyrosinasaktiviteten i ett cellfritt experimentellt system. Glukos metaboliserades dock till mjölksyra, vilket kraftfullt kan undertrycka tyrosinasaktivitet. Således drog vi slutsatsen att glukos indirekt hämmar tyrosinasaktivitet genom omvandling till mjölksyra, vilket förklarar dess anti-melanogena effekter i melanocyter.

Tyrosinas är ett enzym som kan bryta ner tyrosin i protein och omvandla det till tyrosinoxidationsprodukter, såsom tyrosinfenol och andra ämnen. Detta enzym finns brett i människokroppen, särskilt i tarmkanalen, där det är involverat i matsmältningen och absorptionen av mat. Samtidigt fann man i forskningen att cistanche kan minska aktiviteten av tyrosinas och därmed bleka huden.

Klicka på vad som är cistanche

Nyckelord:

melanogenes; socker; glukos; tyrosinas; ekvivalent med mänsklig hud

1. Introduktion

Melanogenes är processen för melaninproduktion och är avgörande för hudens skydd. Melanin absorberar ultraviolett (UV) ljus och skyddar huden från de skadliga effekterna av UV-ljus och fria radikaler [1]. Men eftersom överdriven produktion av melanin orsakar hyperpigmentering som fräknar och lentigo, vilket kan anses vara oestetiskt, har mycket forskning ägnats åt att hitta effektiva depigmenterande ingredienser för kosmetika eller läkemedel [2–4].

Socker är ett kraftfullt fuktbevarande medel för att återfukta huden och används som en kosmetisk ingrediens för att återfukta huden med minimala biverkningar. Dessutom påverkar sockerarter och sockerrelaterade ämnen melanogenesen [5,6]. Glykosylering av tyrosinas, ett nyckelenzym som är involverat i melaninsyntesen, kan förändras, hämmar dess katalytiska aktivitet och påskyndar dess nedbrytning [7]. Rollen av socker i melanogenes har belysts av studier som undersöker effekten av glykosylering på pigmenteringsfenotypen hos melanocyter och rollerna för sockerrester på den katalytiska aktiviteten av tyrosinas [5–7]. Vissa studier har rapporterat att sockerderivat kan hämma tyrosinasmognad, vilket påverkar dess glykosylering. Till exempel stör N-acetylglukosamin (NAG), en aminohexos som produceras fysiologiskt genom tillägg av en aminogrupp till glukos, tyrosinasglykosylering, vilket resulterar i depigmenterande effekter i marsvinshud och människohud [8].

Dessutom har nyare studier visat att sockerrelaterade föreningar hämmar tyrosinasuttryck eller -aktivering samt förändrar dess glykosylering. Till exempel utvärderade vi blekningseffekten av galakturonsyra (GA), en sockersyra som är en oxiderad form av galaktos och huvudkomponenten i pektin. Galakturonsyra utövar en blekande effekt genom reglering av tyrosinasaktivitet och uttryck i B16 murina melanomceller och en human hudekvivalent [9]. I en annan rapport visade en ny typ av cyklisk oligosackarid, känd som cyklisk nitrosylnigeros (CNN), en svag men signifikant direkt hämmande effekt på den enzymatiska aktiviteten av tyrosinas, vilket tyder på en möjlig mekanism för hypopigmentering [10]. I likhet med tyrosinasmognad genom korrekt glykosylering, kan uttrycket eller aktiviteten av CNN vara ett mål för anti-melanogena medel [11]. Men många anti-melanogena medel har allvarliga biverkningar, såsom vitiligo [12,13]. Det finns därför ett stort intresse för säkrare depigmentära föreningar.

Här undersökte vi de anti-melanogena effekterna av glukos på B16 murina melanomceller och normala humana melanocyter. Dessutom undersökte vi vävnadsfärg och epidermal status med hjälp av vävnadssektionsfärgning av en human hudekvivalent. Baserat på våra resultat föreslår vi att glukosens blekande effekt är beroende av mjölksyraproduktion, vilket resulterar i tyrosinasinaktivering.

2. Resultat

2.1. Anti-melanogen effekt av glukos i B16 och NHM

För att undersöka den anti-melanogena effekten av glukos använde vi två typer av melanocyter, B16-melanomceller (en murin melanomcelllinje) och normala humana melanocyter (NHM). Först bestämde vi om glukos var giftigt för B16-celler. Glukos visade ingen cytotoxicitet vid koncentrationer upp till 100 mM i B16-celler, som visas i figur 1A. Baserat på cytotoxicitetsdata behandlades B16-celler med olika koncentrationer av glukos i 72 timmar i närvaro av det -melanocytstimulerande hormonet (MSH), en inducerare av melanogenes. Som visas i figur IB nedreglerade glukos tydligt och signifikant det intracellulära melanininnehållet på ett dosberoende sätt. Kojic acid (KA) användes som en referensförening för anti-melanogenes eftersom den ofta används som en kosmetisk ingrediens som gör huden ljusare [1,3,4]. Färgen på lysaten i glukosbehandlade celler var ljusare än färgen på kontrollcellerna (Figur 1C).

Dessutom bekräftade vi att mängden melanin som utsöndrades i odlingsmediet minskade och färgen på mediet ljusnade (Figur 1D). Därefter undersökte vi den anti-melanogena effekten av glukos på mörkt pigmenterade NHM. Glukos vid koncentrationer upp till 100 mM var inte cytotoxiskt under upp till fyra 4 dagar (Figur 1E). När melaninhalten bestämdes efter glukosbehandling av NHM i 4 dagar fann vi att melaninhalten minskade på ett dosberoende sätt (Figur 1F). Sammantaget indikerar dessa resultat att glukos undertrycker melaninsyntesen i melanocyter.

2.2. Vitande effekt av glukos på en 3D-hudmotsvarighet

För att ytterligare definiera den anti-melanogena förmågan hos glukos använde vi en pigmenterad 3D-hudmodell, MelanoDerm. Som beskrivs i avsnittet Material och metoder applicerades glukos topiskt på MelanoDerm under 18 dagar, och cellviabiliteten bestämdes med CCK-8-analys. Såsom visas i figur 2A observerades ingen vävnadscytotoxicitet efter glukosbehandling under 18 dagar. Vävnadsfärgförändringar bedömdes genom fotografering. Såsom visas i figur 2B var glukosbehandlad vävnad ljusare till färgen än fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-behandlad vävnad. Dessutom avslöjade hematoxylin- och eosin- (H&E)-färgning att glukos inte inducerade vävnadskollaps, medan fontana-masson (F&M)-färgning visade att glukos minskade antalet hyperpigmenterade melanocyter (som visas med pilar) i basalskiktet (Figur 2C) .

För att ytterligare undersöka förändringar i melanininnehåll jämförde vi autofluorescenssignalerna för melanin i melanocytskikten av PBS- och glukosbehandlade vävnader med hjälp av två-fotonexcitationsfluorescens (TPEF) mikroskopi, som visas i figur 2D. En analys av dessa bilder visade att melaninvolymen minskade med cirka 36 procent och TPEF-signalintensiteten för melanin i det melanocytrika området minskade med cirka 38 procent i glukosbehandlade vävnader jämfört med PBS-behandlade vävnader.

Figur 2. Effekt av glukos på human hudekvivalent, MelanoDerm. (A) Viabiliteten hos ekvivalenter av mänsklig hud behandlade med glukos. (B) Mänskliga hudekvivalenter (MelanoDerm; n=3) behandlades topiskt med glukos i 18 dagar och fotograferades sedan. ∆L-värdet anger graden av ljushet jämfört med PBS-behandlad vävnad. (C) H&E och F&M färgning av vävnadssnitt. Objektglasen fixerades i en formaldehydlösning och bäddades in i paraffinvax för färgning (skalstång, 5{{10}} µm). Svarta pilar indikerar pigmenterade melanocyter. (D) Melaninavbildning (200 × 200 × 60 µm3) av humana hudekvivalenter utfördes med användning av TPEF-mikroskopi. Pseudofärgade (röda) signaler indikerar melanin (skalastapel, 50 µm). Graferna visar kvantifieringen av melaninvolym och TPEF-signaler. Data uttrycks som medelvärdet ± SD för minst tre oberoende mätningar (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. Effekt av glukos på uttrycket av melanogena proteiner i melanocyter

Därefter, för att klargöra depigmenteringsmekanismen för glukos i melanocyter, utvärderade vi dess effekt på uttrycket av melanogena enzymer som tyrosinas och Tyrp-1 i B16-celler och NHM. B16-celler behandlades med glukos under de angivna tiderna i närvaro av -MSH. Sedan bestämdes proteinnivåer av tyrosinas och Tyrp-1 med Western blot-analys (Figur 3A). Expressionsnivåerna av tyrosinas och Tyrp-1 minskade inte av glukos vid någon tidpunkt. Vidare påverkades inte transkriptnivåer av tyrosinas av glukos i -MSH-stimulerade B16-celler (Figur 3B). I likhet med B16-celler hämmades inte proteinnivåer av tyrosinas, Tyrp-1 och MITF av glukos (Figur 3C) i NHM-celler behandlade med glukos, och mRNA-nivåer av tyrosinas och Tyrp-1 var inte heller minskat, men snarare något ökat av glukos (Figur 3D).

Figur 3. Effekt av glukos på uttrycket av melanogena proteiner i B16-celler och NHM. (A, B) B16-celler behandlades med -MSH under den angivna tiden i närvaro eller frånvaro av 20 mM glukos. Sedan utfördes Western blot (A) och qRT-PCR (B) analyser. (C) NHMs behandlades med de angivna koncentrationerna av glukos i 48 timmar. Sedan utfördes Western blot-analysen. (D) NHMs behandlades med den angivna tiden i närvaro av 50 mM glukos. Sedan utfördes qRT-PCR-analyser. Data uttrycks som medelvärdet ± SD för minst tre oberoende mätningar.

2.4. Effekt av glukos på tyrosinasaktivitet

För att ytterligare definiera verkningsmekanismen för glukos testade vi om det hade en hämmande effekt på svamptyrosinasaktivitet. Som visas i figur 4A fann vi att glukos inte hade någon hämmande effekt på svamptyrosinasaktivitet, vilket indikerar att glukos inte direkt påverkar tyrosinasaktiviteten. Vi utförde sedan en total intracellulär tyrosinasaktivitetsanalys med användning av glukosbehandlade cellysat från både B16-celler och NHM. Intressant nog hämmades intracellulär tyrosinasaktivitet på ett dosberoende sätt i glukosbehandlade B16-celler i närvaro av -MSH (Figur 4B). I NHM hämmade glukos också intracellulär tyrosinasaktivitet (Figur 4C). Dessa data stöder möjligheten att glukos indirekt inaktiverar tyrosinas i melanocyter.

Figur 4. Effekt av glukos på tyrosinasaktiviteten. (A) Effekt av glukos på svamptyrosinasaktiviteten i ett cellfritt system. (B, C) Cellulär tyrosinasaktivitetsanalys. (B) B16-celler behandlades med de angivna koncentrationerna av glukos under 24 timmar. Sedan utfördes analysen av cellulär tyrosinasaktivitet, såsom beskrivs i metodavsnittet. (C) NHMs behandlades med 50 mM glukos under den angivna tiden. Sedan utfördes analysen av cellulär tyrosinasaktivitet, såsom beskrivs i metodavsnittet. Den cellulära tyrosinasaktiviteten normaliserades av det totala proteininnehållet. Data uttrycks som medelvärdet ± SD för minst tre oberoende mätningar (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.5. Tyrosinasinaktivering genom produktion av mjölksyra i glukosbehandlade melanocyter

Glukos omvandlas till den cellulära metaboliten laktat, som är mjölksyran i lösning och som har rapporterats vara effektiv vid behandling av pigmentskador [14,15]. Därför antog vi att glukos omvandlas till mjölksyra i melanocyter och att ökade nivåer av mjölksyra hämmar melanogenes genom tyrosinasinaktivering. För att utvärdera denna hypotes bedömde vi först produktionen av mjölksyra i media från glukosbehandlade melanocyter. Som förväntat uppreglerade glukos signifikant mjölksyrahalten i B16-cellsodlade medier (Figur 5A). Dessutom, eftersom mjölksyra är känd för att direkt hämma tyrosinasaktivitet [15], utvärderade vi om mjölksyra undertryckte svamptyrosinasaktivitet. Såsom visas i figur 5B inhiberade mjölksyra dramatiskt svamptyrosinasaktivitet, till skillnad från glukos. Dessa resultat tyder på att omvandlingen av glukos till mjölksyra har en anti-melanogen effekt via tyrosinasinaktivering av mjölksyran.

Figur 5. Produktion av laktat genom glukos och effekt av mjölksyra på tyrosinasaktiviteten. (A) Laktatproduktion i glukosbehandlade B16-celler. (A) B16-celler behandlades med de angivna koncentrationerna av glukos under 3 dagar. Sedan utfördes en laktatanalys med användning av det odlade mediet, såsom beskrivs i metodavsnittet. (B) Effekt av mjölksyra på svamptyrosinasaktiviteten i ett cellfritt system. Data uttrycks som medelvärdet ± SD för minst tre oberoende mätningar (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001) .

3. Diskussion

Socker eller sockerhärledda material används ofta som kosmetiska ingredienser för hudskydd och fysiologisk kontroll. Till exempel ökar raffinos mTOR-oberoende autofagi och minskar celldöd i UVB-bestrålade keratinocyter, vilket indikerar att det naturliga medlet raffinos har potentiellt värde för att begränsa fotoskada [16]. Trehalos och sackaros är nya aktivatorer av autofagi i humana keratinocyter genom en mTOR-oberoende väg [17]. Dessa fynd ger ny insikt i den sockermedierade regleringen av autofagi i keratinocyter. När det gäller glukos visades topikal glukos inducera claudin-1 och filaggrinexpression i en musmodell av atopisk dermatit och keratinocytodling, vilket indikerar att det har en antiinflammatorisk effekt genom att reparera hudbarriärfunktionen [18]. Dessutom hämmar glukos proliferation och förbättrar differentieringen av hudkeratinocyter [19]. Därför reglerar glukos olika aspekter av epidermal fysiologi, såsom hudbarriärfunktioner och keratinocytvätskenivåer.

Sockerarter kan fungera som depigmenterande medel via flera olika mekanismer som involverar tyrosinas. Till exempel hämmar vissa medel tyrosinasmognad, medan andra medel inducerar hämning av tyrosinasgenuttryck eller aktivitet [5,8-10]. Men få studier har undersökt mekanismerna bakom depigmenteringseffekterna av glukos.

För att bestämma effekten av glukos på melanogenes fokuserade vi tidigare på lever X-receptorer (LXR), som är ligandaktiverade nukleära receptorer som spelar en central roll i lipidmetabolism och kolesterolhomeostas [20]. Vi fann att lever X-receptoraktivering hämmar melanogenes genom accelerationen av extracellulär signalreglerad kinas (ERK)-medierad mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF) nedbrytning [21]. Dessutom är glukos en endogen LXR-ligand [22]. Således antog vi att glukos har anti-melanogena effekter på grund av aktiveringen av en LXR-beroende väg. Men som visas i figur 3C förändrade glukos inte expressionsnivåerna av tyrosinas eller MITF, även om LXR-aktivering minskade expressionsnivåerna av dessa proteiner i melanocyter.

Därför drog vi slutsatsen att glukos hade depigmenterande effekter på melanocyter oberoende av LXR-aktivering.

Glukos är det huvudsakliga substratet för energiproduktion, och det hydrolyseras via seriereaktioner av flera enzymer, så kallade glykolys. Många studier har visat att glykolys endast har en slutprodukt, mjölksyra, oavsett om det är under aeroba eller anaeroba förhållanden. Under aeroba förhållanden (O2) används laktat som substrat för mitokondriellt laktatdehydrogenas (MLD). LDH omvandlar det till pyruvat som går in i trikarboxylsyracykeln (TCA). Under anaeroba förhållanden (N2) ackumuleras laktat i cytosolen. Därför börjar glykolysvägen med glukos som sitt substrat och slutar med produktionen av laktat som sin huvudsakliga slutprodukt [23]. Dessutom har David et al. mätte fraktionen av glukos som omvandlades till mjölksyra eller pyruvat i den normala humana melanocyten [24]. De flesta av metaboliterna av glukos var mjölksyra snarare än pyruvat.

Mjölksyra är en alfahydroxisyra (AHA); dessa syror används i stor utsträckning i kosmetiska formuleringar som ytliga peelingsmedel [25]. Dessutom undertrycker mjölksyra melaninbildningen genom att direkt hämma tyrosinasaktivitet, en effekt oberoende av dess sura natur, vilket innebär att mjölksyrans effekter på pigmentskador inte bara beror på accelerationen av epidermal cellomsättning utan också direkt hämning av melaninbildningen i melanocyter [15]. Således resonerade vi att glukos kan utöva sin anti-melanogena effekt via mjölksyraproduktion eftersom glukos kan omvandlas till mjölksyra. Som förväntat fann vi att glukosbehandling resulterade i mjölksyraproduktion i melanocyter (Figur 5A).

Dessutom bekräftade vi att mjölksyra kraftfullt och direkt hämmade tyrosinasaktivitet (Figur 5B). Usuki et al. upptäckte också att mjölksyra minskade intracellulär tyrosinasaktivitet i B16-celler och humana HM3KO-celler [15]. I rapporten påverkades inte mRNA och proteinnivåer av tyrosinas och Tyrp-1 av mjölksyra. Tillsammans indikerar dessa data att glukos ökar mjölksyraproduktionen och att denna mjölksyra direkt hämmar tyrosinasaktivitet utan att påverka genuttrycksnivåerna, vilket indikerar att glukos har en anti-melanogen effekt i melanocyter via indirekt tyrosinasinaktivering beroende på mjölksyraproduktion. Ytterligare experiment är dock nödvändiga för att validera mjölksyrans och glukosens roll vid depigmentering.

Samlade data från denna studie ger preliminära bevis som stöder användbarheten av topisk glukos som en effektiv blekning såväl som ett fuktgivande reagens som säkert kan användas i kosmetika och medicinska formuleringar.

4. Material och metoder

4.1. Material

D-glukos, -MSH, kojinsyra (KA), L-tyrosin, L-DOPA och mjölksyra köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Antikroppar mot tyrosinas och aktin köptes från Abcam (Cambridge, Storbritannien). Antikropp mot Tyrp-1 köptes från Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Antikropp mot MITF köptes från Proteintech (city, IL, USA).

4.2. Cellkultur och viabilitetsanalys

Vi köpte B16 murina melanomceller, Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) och fetalt bovint serum (FBS) från American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). B16-celler odlades i DMEM innehållande 4500 mg/L högt glukos (ATCC 30-2002) enligt rekommendation från tillverkaren (ATCC) kompletterat med 5 procent FBS, och inkuberades vid 37 ◦C i en fuktad atmosfär innehållande 95 procent luft och 10 procent CO2. Mörkt pigmenterade primära NHM köptes från Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, USA). Celler odlades i Medium 254 (#M254500) kompletterat med Human Melanocyte Growth Supplement (#S0025) och inkuberades vid 37 ◦C under en 5-procentig CO2-atmosfär. För experiment användes primära NHM mellan passager 4 och 7. Viabiliteten för odlade celler utvärderades med hjälp av ett cellräkningskit-8 (CCK-8) enligt beskrivningen av tillverkaren (DOJINDO, Tokyo, Japan).

4.3. Mätning av melanininnehåll

Melaninhalten bestämdes enligt beskrivningen i tidigare rapporter [2–4]. Kortfattat behandlades B16-celler med de angivna koncentrationerna av glukos i närvaro av -MSH (200 nM) under 72 timmar. NHMs behandlades med de angivna koncentrationerna av glukos under 4 dagar. Därefter tvättades alla celler med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och löstes i 1 N NaOH vid 60 ◦C under 1 timme. Cellysat överfördes till en 96-brunnsplatta och absorbansen mättes vid 405 nm. Värdena normaliserades baserat på proteinkoncentrationerna i varje provbrunn.

4.4. Svamptyrosinasaktivitetsanalys

Vi undersökte de direkta effekterna av de angivna koncentrationerna av glukos på svamptyrosinasaktivitet. Kortfattat blandades 100 µL fosfatbuffert innehållande glukos med svamptyrosinas (10 enheter/brunn) och kombinerades med 50 µL 0,03 procent L-tyrosin eller L-DOPA i destillerat vatten. Sedan inkuberades blandningen tillsammans vid 37 ◦C under 10 minuter och absorbansen mättes vid 405 nm. Kojic acid (KA), ett välkänt antityrosinasmedel, användes som referensförening.

4.5. Intracellulär tyrosinasaktivitetsanalys

Kortfattat behandlades B16-celler eller NHM med de angivna koncentrationerna av glukos under de angivna tiderna. Därefter tvättades cellerna med PBS och lyserades genom inkubering i 50 mM fosfatbuffert (pH 6,8) innehållande 1 procent Triton X-100 och 0,1 mM fenylmetyl-sulfonylfluorid. Cellulära lysat centrifugerades sedan vid 12,000 rpm vid 4 ◦C under 20 min. Supernatanten innehållande cellulärt tyrosinas uppsamlades och proteinhalten bestämdes för normalisering. Det cellulära extraktet inkuberades med L-DOPA i fosfatbuffert och dopakrombildning övervakades genom att mäta absorbansen vid 405 nm inom 30 minuter.

4.6. RNA-isolering och realtidskvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR)

För att bestämma det relativa mRNA-uttrycket av utvalda gener, isolerades totalt RNA med TRIzol (Invitrogen, CA, USA), enligt tillverkarens instruktioner, och 4 µg RNA omvänt transkriberades till cDNA med användning av RT-premix (Bioneer, Seoul, South Korea). Kvantitativ PCR utfördes med ett ABI 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qRT-PCR-primeruppsättningarna för tyrosinas och Tyrp-1 köptes från Applied Biosystems och TaqMan Gene Expression Assay-kit (Applied Biosystems) användes för amplifiering. Målgenuttrycket normaliserades till det för hushållningsgenen som kodar för ribosomalt protein laterala stjälksubenhet P0 (RPLP0). Relativ kvantisering utfördes med den jämförande ∆∆Ct-metoden enligt tillverkarens instruktioner.

4.7. Western Blotting

Celler tvättades två gånger med kall PBS och lyserades sedan i iskall modifierad RIPA-buffert (Cell Signaling Technology, MA, USA) innehållande proteashämmare (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Den totala proteinkoncentrationen bestämdes och proteinerna löstes upp med SDS-PAGE på 4–12 procent gradient Bis-Tris-geler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), överförda till nitrocellulosamembran (Thermo Fisher Scientific). Efter överföring blockerades membranen i en 5-procentig blockeringslösning. Membran inkuberades med primära antikroppar vid 4 ◦C i 24 timmar, tvättades med Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,1 procent Tween-20 (TBST), och exponerades för peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur. Membran sköljdes tre gånger med TBST. En kemiluminescerande signal utvecklades med hjälp av Western blotting ECL-reagens (GE Healthcare, Hatfield, Storbritannien).

4.8. Tredimensionell (3D) ekvivalent för mänsklig hud

Vi använde MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA) som en vävnadsmodell för mänsklig hud. Denna livskraftiga, rekonstituerade, 3D-hudekvivalent härrörde från svarta donatorer och innehåller normala melanocyter och keratinocyter. MelanoDerm odlades vid luft-vätskegränssnittet i EPI-100-NMM-113-medium (MatTek Corp, Ashland, MA, USA). Före glukosbehandling tvättades vävnader med 1 ml PBS för att avlägsna kvarvarande föreningar. Glukos löstes i PBS. Slutkoncentrationen av glukos var 2 procent. Kontrollprovet behandlades endast med PBS. Glukos applicerades på MelanoDerm dagarna 1, 4, 6, 8, 11, 13 och 15. Efter 18 dagar fixerades MelanoDerm-vävnader i 4 procent buffrad formaldehyd, bäddades in i paraffin, skars till en tjocklek av 3 µm och utsattes för till H&E- och F&M-färgning. Vävnadsprovernas livsduglighet bedömdes med hjälp av ett cellräkningskit-8 (CCK-8) enligt beskrivningen av tillverkaren (DOJINDO, Tokyo, Japan). Pigmenteringen av MelanoDerm utvärderades genom att jämföra förändringen i L*-värdet.

4.9. Två-Photon Excitation Fluorescence (TPEF) Imaging

För att visualisera fördelningen av melanin i 3D-hudmotsvarigheten utförde vi TPEF-avbildning, som beskrivs i våra tidigare rapporter [3,4]. Kortfattat fixerades varje MelanoDerm-preparat i 4 procent formalin i 24 timmar vid 4 ◦C och tvättades sedan med PBS/0,1 procent BSA (bovint serumalbumin, Merck, Branchburg, NJ, USA). TPEF-bilderna förvärvades från basalskiktet för att mäta intracellulärt melanin i melanocytskiktet. Relativa TPEF-signalintensiteter för melanin i mätvolymen kvantifierades med hjälp av Image-Pro Premier 3D-programvara (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

4.10. L-laktatanalys

B16-celler såddes vid 1,0 × 105 celler per brunn i en 12-brunnsplatta. Efter behandling med glukos i 3 dagar kvantifierades extracellulära laktatnivåer med användning av ett kolorimetriskt analyskit för L-laktat (Abcam, ab65331, Cambridge, Storbritannien) enligt tillverkarens protokoll.

4.11. Statistisk analys

Data uttrycks som medelvärden ± SD (standardavvikelser), och statistisk signifikans bestämdes med Students t-test. Ett p-värde < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Författarbidrag:

Konceptualisering, H.-JK, JL och CSL; Datakurering, SHL; Utredning, SHL; Metodik, SHL, I.-HB och E.-SL; Supervision, JL och CSL; Skriva – originalutkast, SHL och CSL; Skrivning—granskning och redigering, JL Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:

Denna forskning finansierades av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierad av utbildningsministeriet (bidragsnummer: 2018R1D1A1B07049402).

Intressekonflikt:

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Förkortningar

-MSH -melanocytstimulerande hormon

Tyrp-1 tyrosinasrelaterat protein 1

MITF mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor

NHMs normala humana melanocyter

TPEF två-foton excitationsfluorescens

LXR lever X-receptor

AHAs alfahydroxisyror

H&E hematoxylin och eosin

F&M Fontana-Masson

Referenser

1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Undersöker rollen av melanin i UVA/UVB och väteperoxid-inducerad cellulär och mitokondriell ROS-produktion och mitokondriell DNA-skada i humana melanomceller. Fri radikal. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Ett nytt adamantylbensylbensamidderivat, AP736, undertrycker melanogenes genom hämning av cAMP-PKA-CREB-aktiverad mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor och tyrosinasexpression. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Åh, SG; et al. Antimelanogen effekt av Melasolv (3,4,5-Trimethoxycinnamate Thymol Ester) i melanocyter och tredimensionell human hudekvivalent. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Mannosylerytritollipider hämmar melanogenes genom att undertrycka ERK-CREB-MITF-Tyrosinassignalering i normala humana melanocyter och en tredimensionell human hudekvivalent. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Utvecklingen av sockerbaserade anti-melanogena medel. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogeneshämmare. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. Ando, ​​H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Hearing, VJ Metoder för att identifiera hämmare av melaninbiosyntes via kvalitetskontroll av tyrosinas. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MIN; Yoon, TJ Störning av tyrosinasglykosylering av N-acetylglukosamin och dess depigmenterande effekter i marsvinshud och mänsklig hud. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Depigmenteringseffekt av galakturonsyra genom tyrosinasreglering i B16 murina melanomceller och en tredimensionell human hudekvivalent. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Effekter av en icke-cyklodextrin cyklisk kolhydrat på musmelanomceller: Karakterisering av en ny typ av hypopigmenterat socker. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Nya tyrosinashämmare från naturresurser – deras beräkningsstudier. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: En uppdaterad recension om biologiska, kemiska och kliniska aspekter. Pigment. Cell. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Olika effekter av fem depigmentära föreningar, rhododendron, hallonketon, monobenzon, rucinol och AP736 på melanogenes och livsduglighet hos humana epidermala melanocyter. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Glukosmetabolism i däggdjurscellkultur: Nya insikter för att justera vintage-vägar. Trender. Biotechnol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]

15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Den hämmande effekten av glykolsyra och mjölksyra på melaninsyntes i melanomceller. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Raffinose ökar autofagi och minskar celldöd i UVB-bestrålade keratinocyter. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehalos, sackaros och raffinos är nya aktivatorer av autofagi i humana keratinocyter genom en mTOR-oberoende väg. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Topical Glucose inducerar Claudin-1 och Filaggrin-expression i en musmodell av atopisk dermatit och i keratinocytkultur, utövar antiinflammatoriska effekter genom att reparera hudbarriärfunktionen. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Glukoseffekter på hudkeratinocyter: Implikationer för diabeteshudkomplikationer. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Nukleära receptorer i makrofagbiologi: Vid korsningen av lipidmetabolism och inflammation. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Son, ED; Park, YH; Lim, KM Lever X-receptoraktivering hämmar melanogenes genom accelerationen av ERK-medierad MITF-nedbrytning. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Kärnreceptorn LXR är en glukossensor. Nature 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Carbohydrate; IntechOpen: London, Storbritannien, 2017; s. 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Jämförande metabolisk flödesprofilering av melanomcellinjer: bortom Warburg-effekten. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Dubbla effekter av alfa-hydroxisyror på huden. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com