Gomisin N hämmar melanogenes genom att reglera PI3K/Akt och MAPK/ERK signalvägar i melanocyter

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt: Gomisin N, har en av lignanföreningarna som finns i Schisandra Chinensis visat sig ha antioxidativa, anti-tumörframkallande och antiinflammatoriska aktiviteter i olika studier. Här rapporterar vi för första gången den anti-melanogena effekten av Gomisin N hos däggdjur celler såväl som i zebrafiskembryon. Gomisin N reducerade signifikant melaninhalten utan cellulär toxicitet. Även om det inte var kapabelt att modulera svampens katalytiska aktivitettyrosinasin vitro,Gomisin Nnedreglerade uttrycksnivåerna för nyckelproteiner som fungerar imelanogenes. Gomisin N nedreglerad melanokortin 1-receptor (MC1R), adenylylcyklas 2, mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF), tyrosinas,tyrosinas-relaterat protein-1(TRP-1) och tyrosinasrelaterat protein-2 (TRP-2). Dessutom uppvisade Gomisin N-behandlade Melan-A-celler ökade p-Akt- och p-ERK-nivåer, vilket innebär att aktiveringen av PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna kan fungera för att hämmamelanogenes. Vi validerade också att Gomisin Nreducerade melaninproduktionen genom att undertrycka uttrycket av MITF,tyrosinas, TRP-1 och TRP-2i mus- och mänskliga celler samt i utveckling av zebrafiskembryon. Tillsammans drar vi slutsatsen attGomisin Nhämmar melaninsyntesen genom att undertrycka uttrycket av MITF och melanogenicenzymer, troligen genom att modulera PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna.

Nyckelord:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogenes; blekning av huden

cistanche har hudblekningsfunktion

1. Introduktion

Melanin är ett pigment som finns i de flesta djurorgan inklusive hud, hår, ögon, inneröra, ben, hjärta och hjärna [1,2].Melanogenesär en komplex process där flera signalvägar är involverade. Melanokortin 1-receptorn (MC1R) är en nyckelregulator imelanogenes, signalerar genom dess ligander såsom melanocytstimulerande hormon (MSH) och adrenokortikotropiskt hormon (ACTH) [3]. Hudmelanin biosyntetiseras av melanocyter i epidermis och överförs sedan till keratinocyter, där de spelar viktiga roller för hudskydd genom att absorbera UV-strålning från solljus och avlägsna reaktiva fria radikaler [4,5]. Melaninsyntes och överföring i huden och hårfolliklarna regleras av tillgången på dess prekursorer [6]. L-tyrosin och L-dihydroxifenylalanin (L-DOPA), viktiga substrat för melanogena enzymer, fungerar också som hormonliknande regulatorer vid melanogenes [7]. Å andra sidan leder överproduktionen av melanin till oönskade hudproblem som fräknar och melasma [8,9]. Melanogenes kan påverka beteendet hos normala och maligna melanocyter genom att modulera de elastiska egenskaperna hos cellerna [10]. Även om receptorerna för serotonin och melatonin som uttrycks i kutana celler spelar en nyckelroll för att upprätthålla cellulär homeostas, kan den överdrivna produktionen av melanin via okontrollerade hormonella förändringar orsaka patologiska tillstånd i huden [11].

Det har således gjorts omfattande ansträngningar för att klarlägga molekylära mekanismer som kontrollerar melanogenes som det primära steget för behandling av hyperpigmentära hudsjukdomar. Dessutom olika typer avblekning av hudenmedel som hämmar melaninsyntesen har identifierats från växtextrakt och icke-växtextrakt och används kommersiellt i kosmetika [12,13]. De mest använda vitmedel inkluderar hydrokinon, mekinol, arbutin, kojinsyra, askorbinsyra och retinosyra [12,14]. Det finns emellertid olika begränsningar för deras användning vid behandling av akuta eller kroniska symptom på hyperpigmentering hos människor. Till exempel kan hydrokinon, även om det länge har använts för depigmentering sedan 1960-talet, orsaka hudirritation och kontaktdermatit [15,16]. Det leder också till DNA-skador genom att öka produktionen av reaktiva syrearter och utvecklingen av exogen ochronos i däggdjursceller [17,18]. Andra välkändatyrosinashämmare som kojinsyra och askorbinsyra har inte bara dålig hudpenetration, stabilitet och blekningseffekt utan kan också orsaka cytotoxicitet, dermatit och erytem vid långvarig användning [19,20]. I detta avseende finns det ett ökande behov av att utveckla säkrare och mer effektiva blekningsmedel för behandling av humanhudshyperpigmentering. Naturliga örter som används i traditionell medicin kan tillhandahålla alternativa källor för att identifiera nya blekningsmedel som kontrollerar viktiga steg imelanogenesmed färre eller inga biverkningar [21].

Schisandra chinensis, även känd som nordligt finsmaksbär, finns naturligt i nordöstra Kina, östra Ryssland, Japan och Korea [22]. Denna växt har länge använts för behandling av nattblindhet, hudbrännskador, aseptisk inflammation och leversjukdomar inom traditionell orientalisk medicin [23,24]. S. chinensis fruktextrakt och dess lignanföreningar har visat sig ha olika farmakologiska effekter i murina cellinjer. Till exempel har Schisandra A och C antioxidativa effekter, medan Schisandra B har anti-fibrotisk, antiinflammatorisk, antioxidant och anti-apoptotisk aktivitet [25]. En annan lignanföreningGomisin N(Figur 1A) har rapporterats undertrycka oxidativ stressinducerad apoptos genom att hämma frisättningen av cytokrom C från mitokondrier till cytoplasman, klyvningen av kaspas 3 och PARP och Ca2 plus-inducerad mitokondriell permeabilitetsövergång i H9c2 råttkardiomyocyter [7,8]. Intressant nog har flera studier med musmodeller och mänskliga hudcellinjer avslöjat den terapeutiska potentialen hos S. chinensis för behandling av hudsjukdomar. Lee et al. rapporterade att metanolextraktet av S. chinensis-frukt lindrade kontaktdermatitsymptom genom att minska produktionen av pro-inflammatoriska cytokiner såsom TNF- och IFN- när de applicerades lokalt [8,24]. Kang et al. visade att Schisandra Fructus vattenextrakt hämmade IκB-aktivering och därigenom undertryckte produktionen av TNF-, IL-6 och GM-CSF i den mänskliga mastcellinjen HMC-1 [26]. Dessa fynd fick oss att postulera att S. chinensis lignans kan påverka hudcellsfunktioner mer brett. I denna studie försökte vi undersöka de förmodade rollerna hosGomisin N, en av de viktigaste lignanföreningarna i S. Chinensis, vid regleringmelanogenes, och utvärderar därigenom dess potentiella användning som akosmeceutiskt medel. Här rapporterar vi detGomisin Nhämmar melaninbiosyntesen utan celltoxicitet i mänskliga celler och musceller, såväl som i zebrafiskembryon.

2. Resultat

2.1. Effekter av Gomisin N på melaninbildning och cellviabilitet

För att verifiera effekterna av Gomisin N påmelanogenes, behandlade vi musmelanocyter med olika koncentrationer avGomisin Ni 72 timmar, och sedan bedömde förändringar i melanininnehåll. Gomisin-behandling minskade melaninhalten både i den normala melanocytcellinjen Melan-A och i B16F10-melanomceller på ett dosberoende sätt utan celltoxicitet (Figur 1B, C). Vi observerade att Gomisin N hämmade -MSH-inducerad melaninproduktion i B16F10-celler, vilket var jämförbart med resultaten som erhölls genom PTU-behandling [27] (Figur 1C). För att utvärdera om minskningen av melanin påGomisin Nbehandling beror på minskad aktivitet av tyrosinas, vi utförde en L-DOPA-färgningsanalys i normala humana epidermala melanocytceller (NHEM). Som visas i figur 1E uppvisade NHEM-celler behandlade med Gomisin N minskade nivåer av L-DOPA jämfört med obehandlade celler. Den hämmande effekten av Gomisin N på melaninproduktionen var dock inte signifikant i humanmelanom MNT-1-celler (Figur 1D) .

2.2. Effekter av Gomisin N på Tyrosinasaktivitet

Att undersöka omGomisin Nhämmartyrosinasaktivitet in vitro använde vi svamptyrosinas och B16 melanomcellysat. Kojic acid, en välkänd tyrosinashämmare, användes som en positiv kontroll. När den behandlades med svamptyrosinas, medan Kojic syra signifikant minskade den enzymatiska aktiviteten, inducerade Gomisin N ingen förändring i omvandlingen av L-DOPA till dopakrom (Figur 2A). Men när den behandlades med B16-melanomceller resulterade Gomisin N i en minskning ityrosinascellysatets aktivitet på ett dosberoende sätt (Figur 2B). Dessutom, vid samtidig behandling med -MSH inB16-celler,Gomisin Nvände ökningen av dopakrombildningen stimulerad av -MSH (Figur 3C). Noterbart föreföll Gomisin N vara mer effektivt än Kojic syra för att hämma celluläratyrosinasaktivitetav B16-celler efter -MSH-stimulus. Dessa fynd antyder att den hämmande effekten av GomisinN på melaninproduktion som observerats i mus- och humanceller (Figur 1) inte beror på dess funktion att direkt inhibera den katalytiska aktiviteten av tyrosinas. Det är dock fortfarande möjligt att Gomisin Nreglerar uttrycket av tyrosinas eller andra proteiner som spelar nyckelroller imelanogenes.

2.3. Effekter av Gomisin N på inaktiveringen av MC1R-signalvägen

Vi försökte belysa den underliggande mekanismen som är ansvarig för den hämmande effekten av GomisinN på melaninproduktionen. Det resonerade viGomisin Nkan reglera signalproteiner som är involverade imelanogenesoch därigenom hämma melaninsyntesen. Melanokortin 1-receptor (MC1R) är en melanocytisk G-proteinkopplad receptor som fungerar som en nyckelregulator i melaninsyntesen. Aktiveringen av MC1R med dess ligand -MSH eller adrenokortikotropiskt hormon (ACTH) leder till en ökning av adenylylcyklas, vilket i sin tur uppreglerar intracellulära cAMP-nivåer [2,3]. Följaktligen ökas transkriptionsnivån av MITF via proteinkinas-C (PKA)/responsive element-bindende protein (CREB)-vägen [2,28]. För att utvärdera den reglerande effekten av Gomisin N på MC1R-signalvägen kontrollerade vi expressionsnivåerna för MC1R och dess nedströms signalmolekyler efter behandling av Melan-A-celler med Gomisin N. Vi observerade att Gomisin N signifikant nedreglerade proteinnivåerna för både MC1R och adenylylcyklas 2 på ett dosberoende sätt (Figur 3A–C). Som förväntat,Gomisin N-behandlade celler uppvisade också minskade proteinnivåer av MITF och dess kända mål tyrosinas, TRP-1 och TRP-2 (Figur 3A, D–G). Dessa fynd tyder på att Gomisin N hämmar melanin-producerande enzymer genom att inaktivera MITF via MC1R-signalvägen.

2.4. Effekter av Gomisin N på fosforyleringen av Akt och ERK1/2 i Melan-A-celler

PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna är kända för att vara involverade i melanogenes genom transkriptionellt eller post-transkriptionellt reglerande MITF [29,30]. För att utvärdera om GomisinN påverkar dessa signalvägar, bedömde vi fosforyleringsstatusen för Akt och ERK1/2 byWestern blot-analys. Som visas i figur 3H–J, högdosbehandling (30 µM) avGomisin Navsevärt förbättrade fosforyleringen av både Akt och ERK. Dessa data indikerar att den hämmande effekten av Gomisin N påmelanogenesär sannolikt associerad med P13K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna.

2.5. Gomisin N hämmade melanogenes i zebrafisk embryon

Vi syftade sedan till att undersöka om Gomisin N är effektivt för att hämmamelanogenesin vivo. I slutändan behandlade vi embryon från zebrafisk med Gomisin N i 72 timmar vid koncentrationer av 1, 10, 20 och 30 µM och mätte sedan expressionsnivåer av melanogena proteiner. Vi observerade att Gomisin N-behandling hämmade melaninbildningen vid utveckling av zebrafiskembryon.Gomisin N-behandlade embryon visade en minskning av melaninhalten på ett koncentrationsberoende sätt jämfört med den obehandlade kontrollen (Figur 4). Vi fann också att proteinnivåerna avtyrosinas, MITF, TRP-1 och TRP-2 minskade med Gomisin N-behandling (Figur 5). Dessa resultat visar att Gomisin N hämmar melanogenes in vivo genom att reglera transkriptionsfaktorn MITF och dess måltyrosinas, TRP-1 och TRP-2.

2.6. Gomisin N reverserade Rapamycin-inducerad melanogenes i humant MNT-1

Även om Gomisin N signifikant hämmademelanogenesi Melan-A- och B16-celler såväl som embryon från inzebrafisk, observerade vi inte dess effekt på humana MNT-1-melanomceller. Vi förväntade oss att effekten av Gomisin N skulle kunna detekteras i MNT-1-celler under det tillstånd där melanogenes uppregleras av en lämplig stimulans. Rapamycin har visat sig inducera melanogenes genom att öka tyrosinasaktivitet och proteinnivåer av MITF, tyrosinas, TRP-1 och TRP-2 [31], delvis genom aktivering av autofagi [32]. Vi övervakade nivåerna avtyrosinas, MITF,TRP-1 och TRP-2 i MNT-1-celler genom Western blot-analys, efter samtidig behandling med Gomisin N andrapamycin. Rapamycinbehandling inducerade signifikant MITF-, TRP-1- och TRP-2-nivåer men hade ingen effekt påtyrosinasnivåer (Figur 6). Behandling med Gomisin N vände dock signifikant effekterna av rapamycin på MITF, TRP-1 och TRP-2 på ett koncentrationsberoende sätt. Den omvända effekten avGomisin Nmot rapamycin var mer lovande vid koncentrationen 20 och 30 µM än 10 µM. Dessa resultat tyder på att Gomisin N hämmarmelanogenesi humana MNT-1 melanomceller genom att reglera transkriptionsfaktorn MITF och dess mål TRP-1 och TRP-2.

3. Diskussion

Melaninets huvudsakliga funktion är att skydda hudceller mot UV-strålning [33–35]. Hyperpigmentering, resultatet av en överproduktion av melanin i huden, orsakar oönskade kosmetiska bekymmer och är förknippad med dermatit och hudcancer. Flera rapporter har föreslagitmelanogenessom ett viktigt mål för behandling av metastaserande melanom [36,37]. Således finns det ett ökande behov av att utveckla anti-melanogena medel som reglerar melanogenes utan cellulär toxicitet [38]. Det finns flera vägar involverade i hudmelanogenes [39,40]. Vid ligandbindning ökar MC1R aktiviteten av adenylylcyklas, vilket därefter ökar intracellulära nivåer av cAMP [41,42]. Den cAMP-beroende aktiveringen av PKA / CREB-vägen har allmänt rapporterats för att uppreglera transkriptionella nivåer av MITF, och därigenom förbättra melaninsyntesen [43]. MITF fungerar som en huvudregulator för de tre stora melanogena enzymerna tyrosinas, TRP-1 och TRP-2i ryggradsdjur [3,21,44]. Dessa enzymer är transmembranproteiner som finns i melanocyternas melanosomalmembran. Tyrosinase reglerar det hastighetsbegränsande steget inmelanogenesgenom att omvandla L-tyrosinas till L-DOPA [23]. TRP-1 och TRP-2 spelar också viktiga roller i melaninsyntesen, även om deras funktioner inte är helt klarlagda.

I denna studie visade Gomisin N, en lignanförening av S. chinensis depigmenterande aktivitet utan celltoxicitet. Gomisin N hämmade melaninsyntesen i odlade däggdjurscellinjer såväl som i zebrafiskembryon. Gomisin N verkade vara mer effektiv än den positiva kontrollen PTU som hämmade melaninproduktionen i Melan-A-celler (Figur 1B). Gomisin N minskade melaninhalten på ett koncentrationsberoende sätt. Jämfört med den obehandlade kontrollgruppen, 10 µM avGomisin Nminskade melaninhalten med cirka 40 procent, utan celltoxicitet. Den anti-melanogena aktiviteten för 10-µM Gomisin N var jämförbar med den för 100-µM PTU i Melan-A-celler. På liknande sätt verkade Gomisin Nap vara mer potent än PTU i -MSH-aktiverade B16F10-celler, där effekterna av 5- och 10-µM Gomisin N var jämförbara med effekterna av 10- och {{12 }}µM PTU, respektive (Figur 1C).NHEM-celler behandlade med Gomisin N uppvisade minskade nivåer av L-DOPA, vilket tyder på att GomisinN hämmartyrosinasaktivitet i odlade celler (Figur 1E). Dessa fynd ledde oss till att ytterligare undersöka den underliggande mekanismen genom vilken Gomisin N hämmar melanogenes.

Vi undersökte omGomisin Nmodulerar direkt den katalytiska aktiviteten avtyrosinasin vitro. Till skillnad från Kojic syra, visade Gomisin N inte hämmande effekter på svamptyrosinasaktivitet (Figur 2A). Den cellulära tyrosinasaktiviteten i B16-melanomcellysat nedreglerades emellertid signifikant av Gomisin N både med och utan -MSH-behandling (Figur 2B, C). Inhibering av cellulär tyrosinasaktivitet av Gomisin N vid -MSH-stimulans visade sig vara mer signifikant än den för den positiva kontrollen Kojic-syra (Figur 2C).

Vi postulerade att den anti-melanogena funktionen av Gomisin N kan uppstå genom transkriptionell eller post-transkriptionell reglering av tyrosinas och tyrosinas-relaterade proteiner (TRP). kvantitet och kvalitet på melaninproduktionen i melanocyter. Förväntat, vi observerade att Gomisin N minskade nivåerna av MC1R och adenylylcyklaser 2 i Melan-A-celler (Figur 3A–C). Vidare,Gomisin Nnedreglerade uttrycket av MITF och dess målproteiner inklusive tyrosinas, TRP-1 och TRP-2 (Figur 3A,D–G). Dessa resultat tyder på att de reducerade nivåerna av melaninhalt vid Gomisin N-behandling är ett resultat av deaktiveringen av MC1R-vägen.

Å andra sidan kan PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna fosforylera MITF och därigenom post-transkriptionellt modulera dess aktivitet [45]. Den totala effekten av aktiveringen av PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna imelanogenesär kontroversiellt. Både PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna aktiveras konstitutivt i humana melanom på grund av ackumulerade mutationer [46]. C2-ceramidmedierad depigmentering i Mel-Ab-celler är känd för att inträffa genom en minskning av p-Akt-nivåer [47]. Det finns flera naturliga föreningar som aktiverar melanogenes genom att uppreglera p-ERK-nivåer i B16-melanomceller [28]. Däremot finns det också bevis för att förhöjda p-ERK- och p-Akt-nivåer hämmar melaninsyntesen [28,48]. Komplexitetsinregleringen av melanogenes kan delvis förklaras av det faktum att fosforylering förbättrar transkriptionsaktiviteten hos MITF, men samtidigt inducerar ubiquition-proteosomberoende nedbrytning av MITF [26,49-51]. Våra data visade att både p-Akt- och p-ERK-nivåer uppreglerades i Gomisin N-behandlade Melan-A-celler (Figur 3H-J). Detta innebär att PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna kan bidra till hämningen av melaninproduktionen.

Vi validerade ytterligare den anti-melanogena aktiviteten av Gomisin N i zebrafisken in vivo-modellen. Gomisin N-behandlade zebrafiskembryon visade en signifikant minskning av melaninpigmentering (Figur 4). Dessutom minskade Gomisin N markant nivåerna avtyrosinas, MITF, TRP-1 och TRP-2 vid utveckling av zebrafiskembryon. Dessa fynd tyder tillsammans på detGomisin Ninducerar depigmentering genom att nedreglera uttrycket av MITF och melanogena enzymer in vivo. Den anti-melanogena aktiviteten av Gomisin N bekräftades ytterligare i humana melanom MNT-1-celler stimulerade av rapamycin. Även om Gomisin N endast resulterade i små förändringar i melanininnehållet i MNT-1-celler (Figur 1D), var det effektivt för att vända rapamycin-inducerad uppreglering av MITF, TRP-1 och TRP-2 i ett koncentrationsberoende sätt (Figur 6A,C–E). Sammantaget är den reglerande effekten avGomisin Npå MITF och melanogena enzymer hittades reproducerbart i mus- och mänskliga celler såväl som i zebrafiskembryon.

För att sammanfatta antyder detta arbete att Gomisin N kan ha en hög potential som romanblekning av hudenombud. Gomisin N verkar hämmamelanogenesgenom att undertrycka uttrycket av MITF via MC1R-vägen, istället för att direkt modulera den katalytiska aktiviteten hostyrosinasoch TRPs. Även om detaljerade mekanismer återstår att belysa, är Gomisin N-inducerad depigmentering sannolikt associerad med aktiveringen av PI3K/Akt- och MAPK/ERK-vägarna (Figur 7).

4. Material och metoder

4.1. Material

RPMI1640 köptes från Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), fetalt bovint serum (FBS) och penicillin-streptomycin (PS) köptes från Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Melanocyttillväxtmedium köptes från PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetat(TPA), Kojinsyra, 1-fenyl-2-tiourea (PTU), svamptyrosinas, 3,{{ 9}}dihydroxi-l-fenylalanin(L-DOPA), -MSH, dimetylsulfoxid (DMSO) och paraformaldehyd köptes från SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Nföreningen tillhandahölls av Chul Young Kim (Hanyang University, Ansan, Korea). Rapamycin köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

4.2. Cell kultur

Musmelanomcellinjen B16F10 tillhandahölls från Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Murina melanocyt Melan-A-celler [52] var en generös gåva från Dr. Byeong Gon Lee (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin) -si, Korea). Humana MNT-1 melanomceller tillhandahölls generöst av Aeyeong Lee (Collage of Medicine vid Dongguk University, Goyang-si, Korea). Primära normala humana epidermala melanocyter (NHEM) köptes från PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Melan-A-celler odlades i RPMI 1640-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) kompletterat med 10 procent FBS, 1 procent PS och 200 nM TPA. DMEM kompletterat med 10 procent FBS och 1 procent PS användes för att upprätthålla Melan-A-celler och NHEM-celler. Alla celler inkuberades vid 37 ◦C i en 5-procentig CO2-inkubator.

4.3. Mätning av melanininnehåll

Melan-A-celler såddes i en 24-brunnsplatta (1 × 105 celler/brunn), behandlad medGomisin Noch inkuberades sedan i 72 timmar. Efter 72 timmar mättes melaninhalten som tidigare beskrivits [53]. Kortfattat, efter att odlingsmediet avlägsnats, tvättades cellerna tre gånger med PBS. Därefter sattes natriumhydroxidlösning (1 ml, 1 N) till varje brunn för att lösa upp melanin. Absorbansen vid 405 nm mättes med användning av en mikroplattläsare. Denna analys upprepades med B16F10-celler (2 × 104 celler/brunn) och MNT-1-celler enligt samma metod.

4.4. Western blot-analys

Melan-A-celler såddes i 100 mm skålar (1 × 106 celler/skål) och behandlades med 1, 5 eller 10 µMGomisin Ni tre dagar vid 37 ◦C. Celler tvättades med PBS och skördades sedan med användning av en skrapa. Frigjorda celler sattes i 1 ml PBS och centrifugerades vid 75 00 rpm under 5 min. Efter avlägsnande av den övre lösningen lyserades cellpellets med lysbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 procent SDS, 150 mM NaCl, 1 procent NP-40, 0,02 procent natriumazid, 0,5 procent natriumdeoxicholat, 100 µg/ml PMSF, 1 g/ml aprotinin) i 24 timmar vid 4 ◦C. Totala proteiner extraherades med hjälp av en ultracentrifug vid 12, 000 rpm under 30 minuter vid 4◦C. Proteininnehållet mättes med användning av Bradford-analysen. Proteiner (30 µg) separerades med användning av en 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforesgel (SDS-PAGE) och överfördes till anitrocellulosamembran. Membranet blockerades i 1 timme med 5 procent skummjölk i Tris-buffrad saltlösning med Tween-20 (TBST), och inkuberades sedan i 12 timmar vid 4 ◦C med primära antikroppar riktade mot -tubulin (Santa Cruz, CA, USA ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), tyrosinas (Cell Signaling), ERK(Cell Signaling), phospho-ERK (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), phospho-AKT (Cell Signaling), MC1R ( Santa Cruz), adenylylcyklaser 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) och TRP-2 (Santa Cruz). Efter avlägsnande av primära antikroppar tvättades membranen tre gånger med TBST och inkuberades med sekundära antikroppar (kanin-anti-get-IgG-HRP; mus-anti-kanin-HRP, Santa Cruz) under 1 h. Membranen behandlades med förstärkt kemiluminescensreagens med användning av ChemiDoc XRS plus-avbildningssystemet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Densitometrisk analys av banden utfördes med hjälp av programvaran Image MasterTM 2D Elite (version 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Tyrosinasaktivitetsanalys

För att uppskatta den hämmande effekten av Gomisin N på svamptyrosinasaktivitet, tyrosinas inkuberades med 1, 5 eller 10 µMGomisin Neller den positiva kontrollen Kojic acid. Varje prov löstes i metanol. L-DOPA (8,3 mM) och svamptyrosinas (125 U) späddes i 80 mM fosfatbuffert (pH 6,8). 40 µL av varje prov och 120 µL L-DOPA blandades i en 96-brunnsplatta, följt av tillsats av 40 µL utspätt svamptyrosinas. Plattorna inkuberades sedan under 15 minuter och absorbansen mättes vid 490 nm med användning av en mikroplattläsare.

Tyrosinasaktivitet i B16 melanomcellysat mättes med eller utan -MSH-behandling, som tidigare beskrivits av Ohguchi et al. [54], med små modifieringar. Cellysat framställdes såsom beskrivits ovan i Western Blot-analysdelen. Totalt antal proteiner i supernatanten mättes med Bradford-analys med användning av bovint serumalbumin som standard [55]. En lika stor mängd proteiner späddes ut och användes för tyrosinasaktivitetsanalysen.

hämma tyrosinasaktivitet

4.6. L-DOPA-färgning i NHEM-celler

NHEM-celler såddes i en {{0}}brunnsplatta och inkuberades i 72 timmar med Gomisin N. Celler fixerades med 4 procent paraformaldehyd under 40 min, följt av behandling med 0,1 procent Triton X{ {6}} under 2 min. L-DOPA (0,1 procent) sattes till varje brunn, följt av inkubation under 2 timmar. Efter avlägsnande av lösningen tvättades cellerna två gånger med PBS. Bilderna fotograferades med mikroskop.

4.7. Zebrafiskexperiment

Zebrafiskembryon erhölls från Zebrafish Resource Bank (Daegu, Korea). Embryon behandlades med Gomisin N i 72 timmar. Den depigmenterande effekten avGomisin Npå zebrafisk observerades embryon under stereomikroskopet. För Western blot-analys lyserades Gomisin N-behandlade embryon med användning av lysbuffert, från vilken totala proteiner framställdes enligt ovan.

5. Slutsatser

Vårt resultat stöder uppfattningen att Gomisin N har en hög potential för användning som ett funktionellt livsmedel ochblekning av hudenombud.Gomisin När en av de viktigaste lignanföreningarna i S. Chinensis. I fakta. Chinensis är ett örtmedicin som används för att bota många mänskliga sjukdomar. Ytterligare epidemiologiska studier är dock nödvändiga för att bevisa säkerheten för Gomisin N på huden. Följaktligen kommer in vivo-studier och kliniska prövningar att tydligare kunna visa effektiviteten av GomisinN. Sammanfattningsvis föreslår denna studie detGomisin Nkan vara ett potentiellt hypopigmentärt medel och naturligtblekning av hudenkandidat för kosmetikaindustrin.

cistanche förbättra blekning

Referenser

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Effekten av epidermalt melanin på objektiva mätningar av mänsklig hudfärg. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signaleringsvägar i melanogenes. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melaninpigmentering i däggdjurshud och dess hormonella reglering. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Melaninets roll som skydd mot fria radikaler i huden och dess roll som friradikalindikator i hår. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Melaninhalt i melanommetastaser påverkar resultatet av strålbehandling. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentering av hårsäckar.J. Undersök. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tyrosin och L-dihydroxifenylalanin som hormonliknande regulatorer av melanocytfunktioner. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Nyligen framsteg i melasmapatogenes. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. The biology of hyperpigmentationsyndromes. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Rollen av melaninpigment i melanom. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Det kutana serotoninerga/melatoninerga systemet: Säkrar en plats under solen. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals for Hyperpigmentation: Vad är tillgängligt? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; et al. Reglering av mänsklig hudpigmentering och reaktioner på ultraviolett strålning. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Postinflammatorisk hyperpigmentering: En översyn av epidemiologin, kliniska funktioner och behandlingsalternativ i färgad hud. J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR En översikt över de modulerande effekterna av oljesyra i hälsa och sjukdom. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Undersökning och mekanism för huddepigmentering och ljusningsmedel. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hydrokinon-inducerad genotoxicitet och oxidativ DNA-skada i HepG2-celler. Chem. Biol. Påverka varandra. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hydrokinon: Miljöföroreningar, toxicitet och mikrobiella svar. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Hudblekningspreparat och hydrokinonkontroversen. Dermatol. Ther. 2007, 20 308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Förtvålad nattljusolja minskar melanogenesen i B16-melanomceller och minskar UV-inducerad hudpigmentering hos människor. Lipider 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Naturprodukter och traditionell medicin: Att vända på ett paradigm. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Pharmacology of Schisandra Chinensis Bail: En översikt över rysk forskning och användningsområden inom medicin. J. Etnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Gynnsamma effekter av Schisandrin B på hjärtfunktionen hos mössmodell av hjärtinfarkt. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Effekter av SchisandraChinensis Turcz. frukt på kontaktdermatit inducerad av dinitrofluorbensen hos möss. Mol. Med. Rapport 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Så jag.; Jeon, JH De skyddande effekterna av Schisandra Chinensis fruktextrakt och dess lignaner mot hjärt-kärlsjukdom: En översyn av de molekylära mekanismerna. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Så, HY; Choo, YK; Kweon, OH; et al. Effekter av Schisandra Fructus vattenextrakt på cytokinfrisättning från en humanmastcellinje. J. Med. Mat 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Hämning av L-tyrosin-inducerad mikrokärnproduktion av fenyltiourea i humana melanomceller. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Melanogenes-inducerande effekt av cirsimaritin genom ökningar av mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor och tyrosinaseexpression. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmedierar den cAMP-beroende aktiveringen av extracellulära signalreglerade kinaser (ERK) i melanocyter.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Cyclic AMP en nyckelbudbärare i regleringen av hudpigmentering. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Induktion av melanogenes av rapamycin i humana MNT-1 melanomceller. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Mikrotubuli-associerad proteinlätt kedja 3 är involverad i melanogenes via reglering av MITF-uttryck i melanocyter. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Hörsel, VJ, Jr. Genetiska störningar av pigmentering. Adv. Brum. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -melanocytstimulerande hormon undertrycker oxidativ stress genom ap53-medierad signalväg i humana melanocyter. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomer en överblick. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogenes påverkar den totala och sjukdomsfria överlevnaden hos patienter med melanom i stadium III och IV. Brum. Patol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN. Melanogenes roll i regleringen av melanombeteende: Melanogenes leder till stimulering av HIF-1-uttryck och HIF-beroende åtföljande vägar. Båge. Biochem. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Hämmande effekt av Gastrodia elata-extrakt på melanogenes i HM3KO-melanomceller. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Pris, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP-kinas kopplar transkriptionsfaktorn Mikroftalmi till c-Kit-signalering i melanocyter. Naturen 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Pris, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DElineage-specifik signalering i melanocyter. C-kit-stimulering rekryterar p300/CBP till mikroftalmi.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene-produkt som en signalomvandlare i cAMP-inducerad differentiering av melanocyter. J. Cell Biol. 1998, 142,827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.;Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Begränsad dimerisering av leucinblixtlås och specificitet för DNA-igenkänning av melanocytmästarregulatorn MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Från gener till droger: Riktade strategier för melanom. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Hämmande effekter av resveratrol på melaninsyntes i ultraviolett B-inducerad pigmentering i marsvin. Biomol. Ther. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibering av melanogenes av gallsyra: Möjlig involvering av signalvägarna PI3K/Akt, MEK/ERK och Wnt/-catenin i B16F10-celler. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK och PI3K/PTEN/AKT-signalering vid Malignt Melanom Progression and Therapy. Dermatol. Res. Öva. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Moon, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide hämmar cellproliferation genom AKT/PKB-inaktivering och minskar melaninsyntesen i Mel-Ab-celler. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CH Nedreglering av melaninsyntes genom att ha A och dess tillämpning på in vivo blixtmodell. J.Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF vid melanom: Mekanismer bakom dess uttryck och aktivitet. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Sphingosine-1-fosfat minskarsmelaninsyntes via ihållande ERK-aktivering och efterföljande MITF-nedbrytning. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Jaha, ET; Medrano, EE Reglering av mikroftalmiassocierade transkriptionsfaktor MITF-proteinnivåer genom association med theubiquitin-konjugerande enzym hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR En linje av icke-tumörframkallande musmelanocyter, syngena med B16-melanomet och som kräver en tumörpromotor för tillväxt. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenes hämmar andning i B16-F10-melanomceller medan det ökar innehållet i mitokondriella celler. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol som en potenttyrosinashämmare från släktet Gnetum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Hämning av tyrosinasaktivitet och melaninpigmentering av 2-hydroxityrosol. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]