Guy JM Cameron, et al

Akut njurskada(AKI) kan vara dödlig och är en väldefinierad riskfaktor för utveckling avkronisknjuresjukdom. Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2s) är medfödda producenter av typ -2 cytokiner och är kritiska regulatorer av homeostas i perifera organ. Men vår kunskap om deras funktion injureär relativt begränsad. Nya bevis tyder på att ökat ILC2-tal genom systemisk administrering av rekombinant interleukin (IL)-25 eller IL-33 skyddar mot njurskada. Medan ILC2 kan induceras för att skydda mot ischemisk eller kemiskt inducerad AKI, är effekten av ILC2-brist eller utarmning på njurskadans svårighetsgrad okänd. För det första, fenotypen och platsen för ILC2s injureutvärderades under homeostatiska förhållanden.NjureILC2s uttryckte konstitutivt höga nivåer av IL-5 och var lokaliserade i omedelbar närhet av den renala vaskulaturen. För att testa den funktionella rollen för ILC2s injure, användes en experimentell modell av njurischemi-reperfusionsskada (IRI) och skadans svårighetsgrad bedömdes i vildtyp, ILC2-reducerad, ILC2-defekt och ILC{{4} }utarmade möss. Överraskande nog fanns det inga skillnader i histopatologi, kollagenavsättning eller mRNA-uttryck av skadeassocierade (Lcn2), inflammatoriska (Cxcl1, Cxcl2 och Tnf) eller extracellulära matrisfaktorer (Col1a1, Fn1) efter IRI i frånvaro av ILC2s. Dessa data tyder på att frånvaron av ILC2s inte förändrar svårighetsgraden avnjurskada, vilket tyder på möjlig redundans. Därför kompenserar sannolikt andra mekanismer av typ 2-förmedlad immuncellsaktivering i frånvaro av ILC2. Därför är det osannolikt att en förlust av ILC2 ökar känsligheten för eller svårighetsgraden av AKI.

Nyckelord:ILC2, grupp 2 medfödd lymfoid cell, IL-5, IL-13,njure, njur-, IRI, ischemi-reperfusionsskada

För mer information vänligen kontakta:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

INTRODUKTION

Akut njurskada(AKI) och dess associerade patologier har djupgående effekter på människors hälsa (1). En vanlig orsak till AKI är njurischemi, som främst påverkar det tubulära epitelet på grund av den höga mitokondriella tätheten och metaboliska aktiviteten i dessa celler (2); recenserad i Devarajan (3) och Bonventre och Yang (4). Akut tubulär nekros försämrar avfallsutsöndringen, förändrar vatten- och elektrolytbalansen och orsakar robusta inflammatoriska svar; recenserad i Bonventre och Yang (4). Inflödet av neutrofiler och monocyter bidrar till skadan, men andra medfödda immunceller kan underlätta återgången till homeostas (5); recenserad i Friedewald och Rabb (6). Medfödda lymfoida celler (ILC) är ett nytt tillägg till denna familj och delas in i 3 grupper baserat på de transkriptionsfaktorer som krävs för deras utveckling och av effektorcytokiner de producerar (7). Grupp 2 ILC (ILC2s) är potenta producenter av typ 2 cytokiner, främst interleukin (IL)-5 och IL-13 (8, 9). Dessa celler främjar också vävnadsåtervinning efter förolämpning i flera organ och har olika funktioner in vivo (10). Till exempel, efter luftvägsvirusinfektion med influensavirus, koordinerar ILC2:er reparation av luftvägsepitelet genom att producera tillväxtfaktorn amfiregulin (AREG) (11). På senare tid har ILC2s undersökts i modeller av njurskada inklusive ischemi-reperfusionsskada (IRI) och nefrotoxisk kemikalieinducerad skada med doxorubicin eller cisplatin (12–16). Renal IRI uppnås vanligtvis genom att tillfälligt begränsa blodflödet till njuren i 20–30 minuter, modellera trauma från transplantation eller kirurgiskt ingrepp (17–21). Sammantaget visar dessa studier att in vivo administrering av rekombinanta muscytokiner som aktiverar ILC2s, nämligen IL-25 eller IL-33, är tillräcklig för att minska svårighetsgraden av tubulär epitelcellskada (12–16). Liknande resultat har uppnåtts med adoptiv överföring av ex vivo aktiverade ILC2s (12, 15). Även om ILC2s artificiellt kan induceras att föröka sig och skydda mot de skadliga konsekvenserna av experimentell njurskada, är effekten av ILC-brist2- ofullständigt förstådd. Faktum är att andra immunceller, som har komplexa interaktioner med ILC2, såsom regulatoriska T-celler (Treg) och alternativt aktiverade makrofager (AAM; även känd som M2) är avgörande för denna återskyddande effekt (22–25). I denna studie försökte vi ytterligare karakterisera ILC2s i njurarna, deras placering i detta organ och bestämma deras funktionella roll i IRI med hjälp av en funktionsförlustmetod. Här hittade vi detnjureILC2 uttrycker konstitutivt IL- 5 och är primärt belägna i närheten av njurkärlen, inom adventitia. Dessutom visar vi att en minskning, brist eller utarmning av ILC2s hade minimal inverkan på IRIs svårighetsgrad. Även om aktivering av ILC2s och den associerade förstärkningen av lokal typ 2-immunitet tidigare har visat sig minska de skadliga konsekvenserna av AKI, visar våra resultat att jämförbar skada inträffar i frånvaro av ILC2s, vilket tyder på att ILC2s kan vara överflödiga i IRI när andra kompenserande immunförsvar celler såsom T-celler är närvarande.

MATERIAL OCH METODER

Möss

Åtta till tolv veckor gamla hane av vildtyp (WT; C57BL/6JAusb), vehikel (saltlösningsbehandlad Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), ILC2-reducerad (Roraflfl/ plus Il7rcre/ plus ), ILC{{ 8}}brist (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), ILC2- utarmad (difteritoxoidbehandlad [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), och IL-5/IL-13 dubbla reportermöss (Il5venus/plus Il13td tomat/plus) möss erhölls från Australian Bioresources (Moss Vale, Australien). Il5td tomatCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker möss erhölls från Jackson Labs (ref # 030926 och 007914). Alla möss som genomgick operation hölls under specifika patogenfria, fysiska inneslutningsförhållanden 2, i individuellt ventilerade burar. Möss exponerades för normal rumsluft i en steriliserad miljö under operationen. Möss fick acklimatisera sig i 1 vecka innan experiment startade och hölls på en 12-h dag/natt-cykel med tillgång till standardlaboratoriemat och vatten ad libitum.

Flödescytometri och t-SNE-analys

Njuraroch lungor uppsamlades från reportermöss. Encellssuspensioner framställdes enligt beskrivningen i "Framställning av encellssuspensioner från muslunga med kollagenas D-behandling" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, Tyskland). Celler blockerades med Fc-block (renad anti-mus CD16/32; Biolegend, San Diego, USA) under 30 minuter och färgades med fluorescenskonjugerade antikroppar mot målcellsytantigener (kompletterande tabell 1). Färgnings- och tvättningssteg utfördes med BSA-färgningsbuffert (BD Biosciences, North Ryde, Australien). Prover togs på en BD LSR Fortessa X20 flödescytometer. Flödescytometridata analyserades med FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, USA). Den t-fördelade stokastiska granninbäddningen (t-SNE) utfördes på ILC2s (CD45 plus Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1] IL7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow enkelceller). Med hjälp av pluginet för slumpmässig nedsampling normaliserades antalet händelser i varje prov för att vara lika med det lägsta, avrundat nedåt till närmaste 10 händelser. Alla populationer kombinerades till en .fcs-fil genom att sammanfoga de nedsamplade populationerna. t-SNE-analysen utfördes på det sammanlänkade provet som innehöll de gated populationerna från alla njur- och lungprover kombinerade. För detta utvärderades de kompenserade kanalerna som inte användes för gating under följande t-SNE-inställningar: Iteration 1000, Perplexity 20, Eta 224. Histogram användes för att visa det differentiella uttrycket av cellyteantigener och cytokiner i lungan ochnjure

Immunofluorescens Il5td tomatoCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker-möss avlivades och perfuserades intrakardialt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan 4 procent paraformaldehyd (PFA) i PBS. Njurar avlägsnades och hölls i färsk 4 procent PFA i 24 timmar vid 4◦C och tvättades sedan i PBS. Trehundra mikrometersektioner preparerades med användning av en vibratom. Därefter inkuberades vävnadssnitt i permeabiliseringsbuffert (PBS/0,2 procent Triton X-100/0,3M glycin) och blockerades sedan i PBS/0,2 procent Triton X- 100/5 procent åsneserum vid 4◦C över natten. Proverna tvättades i PBS/0,2 procent Tween-20 en gång och inkuberades sedan med primära antikroppar utspädda i PBS/0,2 procent Tween-20/3 procent åsneserum i rumstemperatur till nästa dag. Därefter tvättades proverna i PBS/0,2 procent Tween-20 i 30 min, 3–4 gånger, och inkuberades sedan med sekundära antikroppar utspädda i PBS/0 0,2 procent Tween-20/3 procent åsneserum i rumstemperatur i 6–8 timmar. Proverna tvättades i PBS/0,2 procent Tween-20 under 1 dag och dehydrerades sedan i en stigande etanolserie (20, 30, 50, 70, 95, 100 procent), 10 minuter varje steg . Slutligen rensades njursektioner genom blötläggning i metylsalicylat (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australien) och monterades sedan i färskt metylsalicylat på ett konkavt täckglas eller kammare. Bilderna togs med Nikon A1R laserskanningskonfokal inklusive 405, 488, 561 och 650 laserlinjer för excitation och bildåtergivning med 16X/0,8 eller 25X1,1, NA Plan Apo långa arbetsavståndsvattenmål. Z steg förvärvades var 6:e ​​m. Bilder bearbetades med ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) och Bitplane Imaris mjukvara v8 (Andor Technology PLC, Belfast, N. Ireland). Ytrekonstruktioner av aktinmärkta blodkärl med alfasläta muskler utfördes med Imaris och pseudofärgades baserat på deras karakteristiska arkitektur och volym för att visualisera stora artärer och vener. Följande antikroppar och spädningar användes: Living Colors anti-DsRed Rabbit Polyclonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), get polyklonal anti-alfa-slätmuskelaktinantikropp (1:200; Abcam, Cambridge, Storbritannien ), eFluor 660 LYVE1 monoklonal antikropp (1:300, klon ALY7, eBioscience), armenisk hamster anti-mus CD3-antikropp (1:100, klon 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 åsna anti-get IgG (H plus L), Alexa Fluor R 555 åsna anti-kanin IgG (H plus L) Alexa Fluor R 647 get anti-hamster IgG (H plus L) korsadsorberad (1:400, ThermoFisher Scientific).

Ensidig ischemi-reperfusionsskada

Kirurgisk anestesi inducerades av 4 procent isofluraninandning och upprätthölls med kontinuerlig 1–1,5 procent isofluraninhalation genom en näskon. Under hela proceduren hölls mössen på en kirurgisk plattform som hölls vid 37 ± 1◦C av en digital termostatstyrd värmematta. Nefrektomi av höger njure utfördes hos alla djur. För att inducera unilateral ischemi klämdes kärlen i den vänstra njuren nära njurstammen i 29-min med en icke-traumatisk steril vaskulär klämma (Coherent Scientific; Hilton, Australien) som applicerade tillräcklig kraft för att förhindra att blodkarlen till och frånnjureutan irreversibel skada på kärlen. Enhetlig och snabb reperfusion avnjureobserverades efter avlägsnande av den vaskulära klämman i alla möss. Muskel- och hudsår stängdes med en 5/0 vikrylsutur (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Australien), huden förseglades sedan med dermalt lim (Provet, Charlestown, Australien) för att skydda såret och förhindra infektion. Kontrolldjur utsattes för en skenoperation med identisk anestesitid och fick endast en kontralateral nefrektomi. För effektiv smärtlindring fick mössen 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant 30 minuter före operationen och sedan 0,05–0,1 mg/kg var 8–12:e timme, såsom krävs. Djuren avvänjdes vanligtvis från analgesi 4 dagar efter operationen utan några tecken på smärta eller ångest som definierats av ansiktsegenskaper med användning av standardmusgrimasskalan; såsom beskrivits (26). Alla möss överlevde till den förutbestämda slutpunkten.

Utarmning av ILC2s in vivo

ILC2s utarmades i Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus möss genom intraperitoneal injektion av 0,025 mg/kg DTx (Sigma-Aldrich) som tidigare beskrivits (27). DTx administrerades 30 minuter före operationen och dagligen därefter fram till slutpunkten. För att bekräfta utarmning av ILC2- fick en delmängd av naiva djur DTx i 3 dagar. Kontroll Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus möss fick en intraperitoneal saltlösningsinjektion.

Histologi

Utskurennjurarsektionerades omedelbart på mitten i längdriktningen genom hilum. Hälften fixerades i 10 procent buffrat formalin, innehållande 4 procent formaldehyd i 24 timmar före tillfällig lagring i 10 procent etanol, paraffininbäddning och sektionering. Fyra mikrometer, longitudinellt skurna sektioner färgades med periodic acid-Schiff (PAS) och Massons trikrom. Histopatologi kvantifierades genom att visualisera utvidgning av tubuli, apoptos eller gipsbildning av en enkelblind utredare med användning av en väletablerad semikvantitativ metod (28), med mindre förändringar enligt beskrivningen (15). Ett genomsnitt togs av poängen från dubbla PAS-färgade sektioner från varje djur. En poäng på 0=0 procent av tubuli påverkades av ovanstående histopatologiska egenskaper; 1=1–10 procent ; 2=11–25 procent ; 3=26–50 procent ; 4=51–75 procent ; 5=76–100 procent . Kollagenavsättning utvärderades med hjälp av Massons trikrom och kollagen identifierades som metylblåttinnehåll mellan intilliggande tubuli.

RNA-extraktion, omvänd transkription och qPCR

Hälften av en njure behölls för genuttrycksanalys. Vävnaden homogeniserades i 400 µl PBS med användning av en TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Australien) genom 50 oscillationer per sekund under 2 minuter. Tvåhundra mikroliter av provet avlägsnades för andra analyser. En milliliter TRI Reagent R (Sigma-Aldrich) sattes till de återstående 200 µl av provet, som fick ytterligare 50 svängningar per sekund under 1–2 minuter tills det var fullständigt homogeniserat. Efter 5 minuters inkubation vid rumstemperatur och centrifugering vid 12,000xg under 10 minuter, extraherades supernatanten och vortexbehandlades med 250 µl kloroform (Sigma-Aldrich). Efter inkubering i 10 minuter vid rumstemperatur och centrifugering vid 12,000xg under 15 minuter, extraherades supernatanten och vortexbehandlades med 500 µl 70 procent isopropanol (Sigma-Aldrich). Provet inkuberades igen i 10 minuter vid rumstemperatur och centrifugerades sedan vid 12,000xg under 10 minuter. Supernatanten kasserades utan att störa den RNA-rika pelleten. Pelleten tvättades två gånger med 1 ml 75-procentig etanol av RNA-kvalitet (Sigma-Aldrich), centrifugerades vid 10,000xg i 5 minuter och supernatanten kasserades varje gång. Pelleten lufttorkades vid rumstemperatur en kort stund innan den återsuspenderades i 80–100 µl UltraPureTM DNase/RNase-fritt dubbeldestillerat vatten (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) och lagrades sedan vid 80◦C före omvänd transkription . Omedelbart före omvänd transkription bestämdes RNA-utbytet genom spektrofotometrisk bedömning med användning av en Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific). Fem mikroliter av varje prov späddes i ddH2O så att 1 000 ng RNA laddades per prov. Efter behandling med DNAse (Sigma-Aldrich) genererades cDNA med användning av M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Australien) enzymstandardoperationsprocedurer med användning av en T100TM termisk cykler (BioRad Laboratories, Gladesville, Australien). Med hjälp av SYBR-baserad metodik utfördes qPCR med CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) enligt standardprocedurer. Varje primeruppsättning gradienttestades för att bestämma den optimala temperaturen för amplifiering (kompletterande tabell 2). Cykelkvantifiering tolkades med hjälp av en regression för varje mål, genuttryck normaliserades i förhållande till hypoxantin-guaninfosforibosyltransferas (Hprt). Smältkurvor utvärderades för tecken på primerdimerisering och icke-specifik amplifiering. På varje platta användes minst en negativ kontroll och ingen mallkontroll för varje mål för att säkerställa att kontaminering inte var närvarande i varje mastermix eller den använda ddH2O.

RT2 Profiler Array

RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) utfördes enligt tillverkarens instruktioner och data laddades upp och analyserades sedan med onlineverktyget, tillgängligt från https://dataanalysis. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Denna array tillåter profilering av 84 gener i maximalt 4 prover, därför slogs lika mängder cDNA för varje replikat i en grupp samman från WT-möss på dag 1, 3 eller 7 efter IRI, och skenpoolades från varje replikat från varje av dessa tidpunkter. För varje mål jämfördes veckförändringen efter IRI med skenuttryck.

Statistisk analys

All data analyserades med Graphpad Prism programvara v8.02 med icke-parametriska oparade t-tester (Mann-Whitney U-test). P < 0.05="" sattes="" som="" tröskeln="" för="" att="" bestämma="" statistiskt="" signifikanta="" skillnader.="" ∗p="">< 0,05,="" ns="" ej="" signifikant.="" alla="" data="" uttrycks="" som="" medelvärde="" ±="" sem.="" i="" varje="" analys="" fanns="" det="" n="4–8" replikat="" per="" grupp="" och="" resultaten="" var="" representativa="" för="" minst="" två="" experiment.="" provstorleken="" för="" varje="" experiment="" beskrivs="" i="" motsvarande="">

RESULTAT

Renala ILC2 uttrycker konstitutivt IL-5 och är lokaliserade till njurkärlen under homeostatiska förhållanden

En detaljerad analys av renal ILC2-fenotyp och lokalisering under homeostatiska förhållanden utfördes. Det fanns signifikant fler ILC2s (CD45 plus Lineage IL- 7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow enstaka celler), i njuren jämfört med lungan när det representeras som en procentandel av totalt CD45 plus enstaka celler (Figur 1A; Kompletterande figurer lA, B). t-SNE-analys av njure och lunga ILC2s visade unik kluster, även om dessa kluster inte var helt skilda från varandra (Figur 1B). Njur-ILC2s hade dock markant lägre uttryck av CD25, konsekvent uttryck av ICOS och KLRG1, men högre uttryck av IL-5 jämfört med lung-ILC2 (Figur 1C). Njur-ILC2s hade ett högre konstitutivt uttryck av IL-5 än IL-13 (Figur 1D; kompletterande figurer 1C, D). ILC2s bestämdes vara den huvudsakliga IL-5-producerande celltypen i njuren, med ett försumbart bidrag från T-hjälpartyp-2 (TH2)-celler (Figur 1E, kompletterande figurer 1E, F). Därför användes IL-5 som en surrogatmarkör för att identifiera platsen för ILC2s i musnjuren, vilket har beskrivits för flera perifera organ (29–31). Detta uppnåddes genom att använda möss som uttrycker ett IL--5-kopplat Cre-rekombinas som korsades till en spårare av Rosa-tomatlinje (30, 31). IL-5 plus-celler (främst ILC2s) hittades under helanjuremen var primärt lokaliserade till den stora kärlstrukturen, som visualiserats med alfa-slätmuskelaktin (-SMA) positiv färgning (figur 2A; kompletterande figurer 2A, B), i överensstämmelse med vår senaste rapport (29). ILC2s visade sig vara associerade med både interlobulära och bågformade njurkärl i cortex- och märgregionerna, vilket visas av uttryck av lymfatisk endotelial hyaluronanreceptor-1 (LYVE1) (Figur 2B). Ytterligare avbildning visade att mycket få av CD3 plus-cellerna (främst TH2-celler) bidrog till den endogena IL-5 plus-signalen (Figur 2C). ILC2s identifierades i adventitia av kärlet med hjälp av pseudofärgade ytrekonstruktioner av arteriell -SMA.

Minskning, brist eller utarmning av ILC2 ändrar inte svårighetsgraden av experimentell njurischemi-reperfusionsskada hos möss

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2- gånger jämfört med skenkontroller, medan 1/84 och 6/84 ökade vid dag 1 respektive 3 (kompletterande figur 4A). IRI inducerade akut tubulär nekros kännetecknad av dilaterade tubuli och gipsbildning, jämfört med skenkontroller (figur 3B, kompletterande figurer 3A, 4B). Detta kvantifierades som en tubulär skada poäng och svårighetsgraden av skadan var liknande i alla genotyper (Figur 3C). IRI inducerade också kollagenavsättning, märkt av metylblått innehåll mellan tubuli i medulla och cortex, jämfört med skenkontroller (Figur 3D; Kompletterande Figur 3B). Kollagenavsättning var opåverkad av frånvaron av ILC2s. IRI ökade också mRNA-uttrycket av skadeassocierade faktorer, kemokiner och pro-inflammatoriska cytokiner (figur 3E–J, kompletterande figurer 4C–K). Neutrofil gelatinas-associerat lipokalin, (Lcn2; NGAL), en biomarkör för njurskada (33, 34), ökades av IRI och opåverkades av ILC2-reduktion, -brist eller -utarmning (Figur 3E). CXC-motiv kemokinligand 1 (Cxcl1) och Cxcl2 ökade också signifikant av IRI i alla genotyper (figur 3F, G). På liknande sätt ökades den pro-inflammatoriska cytokintumörnekrosfaktorn (Tnf) av IRI, jämfört med skenkontroller (Figur 3H). I överensstämmelse med synlig kollagenavsättning ökade mRNA-uttryck av de extracellulära matrisfaktorerna kollagen typ I alfa 1-kedja (Colla1) och fibronektin 1 (Fn1) av IRI i alla genotyper (figur 3I, J).

DISKUSSION

ILC2 är kritiska regulatorer av vävnadshomeostas, men deras roll i njuren återstår att helt klarlägga. Även om ILC2 kan induceras att föröka sig och skydda mot de skadliga konsekvenserna av experimentell njurskada, är det ännu inte känt vad som händer i frånvaro av dessa celler. Vi undersökte först om ILC2-tal, som andel av CD45 plus hematopoetiska celler, är olika i lunga och njure. ILC2s stod för en större andel CD45 plus-celler i njuren än i lungan. t-SNE-analys grupperade ILC2 från båda platserna på olika sätt, men klustren var inte helt distinkta mellan dessa vävnader. Det fanns skillnader i deras cellyteantigen och typ 2-cytokinexpression, med njur-ILC2 som uttryckte större mängder IL-5. Faktum är att njur-ILC2s konstitutivt uttryckte höga nivåer av IL-5 under homeostatiska förhållanden. ILC2s var också den huvudsakliga källan till IL-5 i njurarna, med försumbart bidrag från TH2-celler. Därför användes IL-5 som en surrogatmarkör för att bestämma platsen för dessa celler i njuren. ILC2s identifierades i njuren och lokaliserades nästan uteslutande längs njurkärlen. I dessa studier användes ett IL-5-kopplat Cre-rekombinas i kombination med en flox-stop-flox-sekvens uppströms om en CAG-RFP-WPRE-kassett i det konstitutivt uttryckta ROSA26-lokuset för att lokalisera ILC2s. LYVE1, som uttrycks av njurlymfatiska endotelceller, användes för att ytterligare definiera platsen för dessa celler i musnjuren (35). Som väntat var LYVE1-färgning inbäddad i bindväven i njurartärerna i cortex, men inte i märgen eftersom inget märkbart lymfatiskt nätverk existerar i denna region av njuren (35–37). Förmodligen är ILC2: er belägna nära det vaskulära eftersom njurendotelceller är en viktig källa till IL -33 i njuren (38, 39). Som bekräftar vår observation av FACS av encelliga njursuspensioner, visade sig ILC2s återigen vara de största producenterna av IL-5 i njurvävnadssnitt, med minimalt bidrag från CD3 plus T-celler. Även om dessa studier visar platsen för ILC2s i njuren med hjälp av reportermöss, återstår det att fastställa om ILC2s också finns intill kärlsystemet i den mänskliga njuren, och om placeringen av ILC2s ändras som svar på njurskada. Även om flera rapporter har funnit att ILC2-tal är oförändrade av njurskada, kräver deras fenotyp och aktiveringstillstånd efter skada ytterligare förklaring (12–16). Därefter karakteriserade vi den funktionella rollen av ILC2s i njuren med hjälp av en förlust av funktionsmetod. För att uppnå detta utnyttjade vi ILC2-reducerade och -deficienta möss och möss som kan vara villkorligt utarmade på ILC2s efter administrering av DTx (27). Vi validerade användningen av dessa verktyg för knockdown eller ablation av ILC2s i njurarna. En experimentell modell av IRI valdes, med tanke på närheten av ILC2s till njurkärlen. Även om kännetecken för skada var tydligt uppenbara efter IRI, förändrade inte en minskning, brist eller utarmning av ILC2s den grova histopatologin i njuren och orsakade inte heller dödlighet. Faktum är att IRI-inducerad ombyggnad och kollagenavsättning inträffade oberoende av ILC2s. Även om det är möjligt att en tidigare tidpunkt efter skada kan ha identifierat skillnader i histopatologi och genuttryck, möjliggjorde tidpunkten i vår studie också bedömning av kollagenavsättning, en viktig egenskap vid ombyggnad som regleras av ILC2s (16, 32, 40) –44). Det är också troligt att en minskning av ILC2s under

AKI kan vara skadligt för njurens struktur och funktion när det bedöms vid senare tidpunkter på grund av potentiella maladaptiva reparationssvar i frånvaro av ILC2s. För att ta itu med detta kommer framtida studier att behöva undersöka ILC2s roll i utvecklingen av AKI till kronisk njursjukdom (45, 46).

Sammantaget visar denna studie att en minskning, brist eller utarmning av ILC2s inte förändrar svårighetsgraden av experimentell AKI hos möss. Även om aktivering av ILC2s och den associerade amplifieringen av lokal typ 2-immunitet tidigare har visats minska de skadliga konsekvenserna av AKI, uppstår jämförbar skada när ILC2s reduceras, saknas eller utarmas, vilket tyder på möjlig redundans och kompensation av andra immunceller, såsom Treg , AAM och TH2-celler. Detta koncept stöds av studier med Rag1 / eller Rag2 / möss som saknar mogna T- och B-celler, i modeller avnjurskada(13, 15, 47, 48). I en studie användes anti-CD90.2-administrering för att tömma ILC2, men dessa djur hade också brist på Treg- och TH2-celler (15). I detta modellsystem, trots utarmningen av ILC2:er med anti-CD90.2, är kompensation från T-cellsfacket inte möjlig. Våra data visar att en förlust av ILC2s, när T-cellsfacket förblir intakt, har minimala effekter på svårighetsgraden av IRI. Våra data stödjer konceptet att ILC2s förutom andra immunceller, såsom Treg och AAM, bidrar till AKI. Treg-utarmning förvärrade faktiskt histopatologin efter IRI (15). På liknande sätt främjar makrofagpolarisering mot AAM upplösningen av skada (5, 12, 46, 49, 50). Ytterligare studier krävs för att klarlägga orsaken till förekomsten av ILC2 i njurarna, inklusive stigande urinvägsinfektioner och andra njurbesvär samt i utvecklingen avkronisk sjukdom.

ETIKUTTALANDE

Alla kirurgiska procedurer godkändes av University of Newcastles Animal Care and Ethics Committee i enlighet med Australian Code för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål. Procedurer för immunofluorescerande avbildning godkändes och utfördes i enlighet med riktlinjer som fastställts av UCSF Animal Care and Use Committee och Laboratory Animal Resource Center.

FÖRFATTARBIDRAG

Arbetet som presenterades utfördes i samarbete med alla författare. GC utförde den kirurgiska modellen, flödescytometri, histologisk bedömning, genuttrycksanalys och analyserade data. KC och ABM utförde immunfluorescensexperimenten. SL hjälpte till med djurövervakning och flödescytometri. SJ och AD gav klinisk insikt för studiedesign och kirurgisk teknik. ANM skapade, levererade och gav råd om användningen av ILC2-deficient & -depleted och Il13td tomatmöss. PF levererade och gav råd om användningen av Il5venus reporterlinje. PF och PH gav råd om experimentell design. MS designade, övervakade och underlättade alla aspekter av studierna. Alla författare deltog i tolkningen av data, förberedelser och redigering av manuskript för intellektuellt innehåll.

FINANSIERING

MS stöds av ett Australian Research Council (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) stipendium och anslag från National Health and Medical Research Council (NHMRC), Hunter Medical Research Institute och Hunter Children's Research Foundation.

REFERENSER

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, et al. Världens förekomst av AKI: en metaanalys.Clin J Am Soc Nephrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. Multifotonavbildning avslöjar skillnader i mitokondriell funktion mellan nefronsegment.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Uppdatering om mekanismer för ischemisk akut njurskada.J Am Soc Nephrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Cellulär patofysiologi av ischemisk akut njurskada.J Clin Invest.(2011) 121:4210–21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS, et al. Distinkta makrofagfenotyper bidrar till njurskada och reparation.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Inflammatoriska celler vid ischemisk akut njursvikt.Kidney Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Medfödda lymfoida celler - ett förslag till enhetlig nomenklatur.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H, et al. Medfödd produktion av T(H)2-cytokiner av fettvävnadsassocierade c-Kit( plus )Sca-1( plus ) lymfoida celler.Natur. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA, et al. Nuocyter representerar en ny medfödd effektorleukocyt som förmedlar typ-2 immunitet.Natur. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. Lungutveckling och framväxande roller för typ 2-immunitet.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA, et al. Medfödda lymfoida celler främjar lungvävnadshomeostas efter infektion med influensavirus.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H, et al. IL-25 framkallar medfödda lymfoida celler och multipotenta stamceller typ 2 som minskar njurischemi/reperfusionsskada.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. IL-33-medierad expansion av typ 2 medfödda lymfoida celler skyddar mot progressiv glomeruloskleros.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, et al. IL233, ett nytt IL-2- och IL-33-hybridcytokin, lindrar njurskada.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z, et al. Potentiera vävnadsresidenta typ 2 medfödda lymfoida celler genom IL-33 för att förhindra njurischemi-reperfusionsskada.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. En ny hybridcytokin IL233 förmedlar regenerering efter doxorubicin-inducerad nefrotoxisk skada.Sci Rep. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. Framväxande terapeutisk potential för grupp 2 medfödda lymfoida celler vid akut njurskada.J Patol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, et al. Djurmodeller för akut njursvikt.Pharmacol Rep. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Musmodeller och metoder för att studera mänsklig sjukdom, akut njurskada (AKI).Metoder Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker MP. Ischemi-reperfusionsmodell av akut njurskada och fibros efter skada hos möss.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Musmodell av ischemisk akut njurskada: tekniska anteckningar och knep.Am J Physiol Renal Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. Lunggrupp 2 medfödda lymfoida celler: överraskningar och utmaningar.Mucosal Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Immunceller vid experimentell akut njurskada.Nat Rev Nephrol.(2015) 11:88–101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Vävnadsresidenta lymfocyter i njuren.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. Det medfödda immunsvaret vid ischemisk akut njurskada.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, et al. Kodning av ansiktsuttryck av smärta i laboratoriemusen.NatMetoder.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM, et al. MHCII-medierad dialog mellan grupp 2 medfödda lymfoida celler och CD4 plus T-celler potentierar typ 2 immunitet och främjar utdrivning av parasitisk helmint.Immunitet. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. Effekter av ciklosporin A på utvecklingen av immunmedierad interstitiell nefrit.Njure Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, et al. Adventitiella stromaceller definierar grupp 2 medfödda lymfoida cellvävnadsnischer.Immunitet. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A, et al. Medfödda lymfoida typ 2-celler upprätthåller viscerala fettvävnader eosinofiler och alternativt aktiverade makrofager.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. Typ 2 medfödda lymfoida celler kontrollerar eosinofil homeostas.Natur.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B, et al. Roller för T/B-lymfocyter och ILC2 vid experimentell kronisk obstruktiv lungsjukdom.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J, et al. Identifiering av neutrofil gelatinas-associerat lipokalin som en ny tidig urinbiomarkör för ischemisk njurskada.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Differentiell genuttryck efter tidig njurischemi/reperfusion.Kidney Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. Anatomy of the kidney: Lymphatics. I:Brenner ochRektorsE-boken Njure. 10:e uppl. Amsterdam: Elsevier (2015). sid. 80–1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, et al. LYVE-1, en ny homolog av CD44-glykoproteinet, är en lymfspecifik receptor för hyaluronan.J Cell Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH, et al. Uttryck av lymfatisk endotelspecifik hyaluronanreceptor LYVE-1 i den utvecklande musnjuren.CellVävnadRes.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J, et al. IL- 33-beroende endotelaktivering bidrar till apoptos och njurskada hos orienterade tsutsugamushi-infekterade möss.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G, et al. Endogen IL-33 bidrar till njurischemi-reperfusionsskada som ett alarmin.J Am Soc Nephrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, et al. Interleukin-33-beroende medfödda lymfoida celler medierar leverfibros.Immunitet. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG, et al. En mastcell-ILC2-Th9-väg främjar lunginflammation vid cystisk fibros.Nat Commun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G, et al. IL-25 och typ 2 medfödda lymfoida celler inducerar lungfibros.ProcNatlAcad Sci USA. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. Typ 2 medfödda lymfoida cellantal ökar hos patienter med systemisk skleros och korrelerar med omfattningen av fibros.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L, et al. IL-33 främjar ST2-beroende lungfibros genom induktion av alternativt aktiverade makrofager och medfödda lymfoida celler i möss.J Allergy Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Subklinisk njurskada inducerad av upprepad cisplatinadministrering resulterar i progressiv kronisk njursjukdom.Am J Physiol Renal Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C, et al. Molekylär karakterisering av övergången från akut till kronisk njurskada efter ischemi/reperfusion.JCI Insight.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, et al. NKT-cellaktivering förmedlar neutrofil IFN-gammaproduktion och njurischemi-reperfusionsskada.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, et al. Medfödd IL-17A-producerande leukocyter främjar akut njurskada via inflammasom och Toll-liknande receptoraktivering.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM, et al. IL-25 inducerar M2-makrofager och minskar njurskada vid proteinurisk njursjukdom.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S, et al. TGF-beta främjar fibros efter allvarlig akut njurskada genom att förbättra njurmakrofaginfiltrationen.JCI Insight.(2018) 3:123563.