GTP energiberoende av endocytos och autofagi i den åldrande hjärnan och Alzheimers sjukdom

Abstrakt

Ökat intresse för åldrande ochAlzheimers sjukdom(AD)-relaterade funktionsnedsättningar i autofagi i hjärnan väcker viktiga frågor om reglering och behandling. Eftersom många steg i endocytos och autofagi beror på GTPaser, behövs nya mått på cellulära GTP-nivåer för attutvärdera energireglering vid åldrande och AD. Den senaste utvecklingen av ratiometriska GTP-sensorer (GEVALS) och upptäckten att GTP-nivåer inte är homogena inuti celler ökarnya frågor om reglering av GTPaserav den lokala tillgängligheten för GTP. I denna recension lyfter vi frammetabolism av GTPi relation till Rab GTPaserna involverade i bildandet av tidiga endosomer, sena endosomer och lysosomal transport för att utföra den autofagiska nedbrytningen av skadad last. Specifika GTPaser kontrollerar makroautofagi (mitofagi), mikroautofagi och chaperone-medierad autofagi (CMA). Genom slutledning skulle lokala GTP-nivåer kontrollera autofagi, om inte i överskott. Ytterligare nivåer av kontroll åläggs av cellens redoxtillstånd, inklusive tioredoxininblandning. Under hela denna recension betonar viåldersrelaterade förändringardet kundebidra till underskott i GTP och AD. Vi avslutar med utsikter för att öka GTP-nivåerna och vända åldersrelaterade oxidativa redoxförskjutningar för att återställa autofagi. Därför kan GTP-nivåer reglera de många GTPaser som är involverade i endocytos, autofagi och vesikulär trafik. Vid åldrande kan metabol anpassning till en stillasittande livsstil försämra mitokondriell funktion och generera mindre GTP och redoxenergi för sund hantering av amyloid ochtau proteostas, synaptisk funktion, ochinflammation.

Nyckelord GTP · Energi · Autofagi · Mitofagi ·Endocytos· Lysosomer ·Alzheimers · Åldrande

Klicka här för att få ört-cistanhe för anti-Alzheimers sjukdom

GTP, den andra energivalutan, i åldrande och AD

Syntes av högenergimolekylerna ATP och GTP är båda beroende av redoxtillståndet för NAD plus /NADH och deras tillräckliga koncentrationer. ATP-syntes från glykolys drivs i första hand av den oxidativa kraften hos NAD plus som verkar på reducerande sockerarter. ATP-syntes genom oxidativ fosforylering i mitokondrier drivs av NADH-generering i TCA-cykeln för reduktion av pyruvat, glycerol eller fettsyror med syre som terminal elektronacceptor i elektrontransportkedjan. Våra etikettfria studier på levande råtta- eller mushippocampusneuroner indikerar en åldersrelaterad utarmning av NAD och NADH, som kan försämra syntesen av ATP och GTP [1-4]. Denna utarmning förvärrades ytterligare i neuroner från möss som bär transgener för human beta-amyloid och tau. Vidare indikerade postmortemanalys av TCA-cykelenzymer upp till 40 procents försämring av TCA-cykelenzymerna från AD-hjärnor jämfört med åldersmatchade kontroller [5]. Således kan åldersrelaterad energisk utarmning av NAD plus och NADH utöver AD-relaterad mitokondriell försämring av aktiviteten hos TCA-enzymer lokalt påverka ATP- och GTP-nivåer, även om deras bulkkoncentrationer påverkades minimalt.

Energin som är tillgänglig från GTP-hydrolys är densamma som ATP-hydrolys, men GTP används för andra ändamål än ATP på grund av specifika enzymers selektivitet. GTP-koncentrationer i celler är i genomsnitt tio gånger lägre än den millimolära ATP. GTP är en viktig regulator av flera energiberoende cellulära processer för proteinsyntes och vesikulär trafficking som involverar endocytos och autofagi. Den uppskattade totala cellulära GTP-koncentrationen i däggdjursceller ligger i intervallet 250-700 μM [6], men fri GTP i cancercellsutsprång är närmare 30 μM [7]. Huvudproteiner som drivs av GTP inkluderar dynaminer för membranklyvning och fusion, de små regulatoriska GTPaserna och mikrotubuli som beskrivs nedan. Förutom de novo syntes från inosin av IDMPH2 och xantosin av GMPS, är cellulära källor till GTP främst lokaliserade nukleosid-difosfatkinaser (NDPK) från de icke-metastaserande generna (NME; ibland kallad NM23) som omvandlar ATP till GTP [8]. Det finns minst tio medlemmar av NME-genfamiljen men endast de fyra första har nukleosid-difosfatkinasaktivitet. Enligt Allen Brain Atlas uttrycks NME1 till 4 starkt och selektivt i musen och människans hippocampus där minnet är nedsatt vid AD. NME1–3 är cytoplasmatiska, medan NME4 är mitokondriellt. Eftersom båda distinkta processer av endocytos och autofagi påverkas vid åldrande och AD, hävdar vi att förändringar uppströms påverkar båda, möjligen åldern och AD-relaterade konsekvensen av att begränsa GTP-nivåer på dessa amyloidkritiska funktioner.

Mätning av GTP-nivåer

Även om GTP reglerar flera avgörande processer för cellulär överlevnad, är det svårt att mäta GTP-nivåer i den levande cellen under fysiologiska och patologiska förhållanden på grund av den höga omsättningen och existensen av både ett proteinbundet och fritt tillstånd. Bianchi-Smira glia et al. [9] beskrev en ny genetiskt kodad GTP-sensor (GEVAL) baserad på ett gult fluorescerande protein som detekterar ratiometriska förändringar i GTP-fri och GTP-bunden koncentration in vitro och in vivo. Nyligen rapporterade samma grupp en mekanism för reglering av GTPase Rac1 i cellinvasion av en human melanomcellinje som drivs av lokal GTP-produktion [7] och granskade deras metod [10]. Som vi kommer att se i denna recension spelar GTP en avgörande roll under endocytos och autofagi-relaterad till amyloidbearbetning. För närvarande studerar vi de åldersrelaterade GTP-förändringarna i bearbetningen av A i primärkulturer av hippocampusneuroner från den trippeltransgena 3xTg-AD-musen och dess effekt på förändringar i autofagi. Figur 1 visar de preliminära resultaten av GEVAL530-transfektion till primära vuxna neuroner från denna AD-musmodell jämfört med icke-transgena musneuroner. Såsom observerats av Bianchi-Smiraglia et al. [7], vi ser en ojämn fördelning av GTP i processerna och kanterna av soma vid mätning av fritt GTP (Fig. 1Aa), med lägre fria GTP-nivåer i 3xTg-AD-neuronerna (Fig. 1Ac). Såsom beskrivs i avsnitt 10, höjde förbehandling av dessa neuroner med en NAD plus-prekursor, nikotinamid, de fria GTP-nivåerna (Fig. 1Ab, d). 530-µM Kd för GEVAL530 som användes i dessa experiment tyder på att den lokala fria GTP-koncentrationen ligger inom ett par gånger av 530 µM. I Fig. 1B undersökte vi den bundna GTP som verkar vara lokaliserad i vesiklar och ökad av nikotinamid (Fig. 1Bf, h), särskilt i 3xTg AD-neuronerna. Preliminära bevis tyder på att neuroner behandlade med NME1 siRNA sänker deras fria GTP-nivåer (Santana Martinez, opublicerad). Ytterligare studier med vuxna neuroner över åldersspektrumet kommer att bestämma åldersberoendet av GTP-underskott och förmågan att åtgärda dem med NAD plus -prekursorer. Med tanke på GTPs väsentliga roll i vesikulära traffickingprocesser av endocytos och autofagi och detta preliminära bevis för förändringar i GTP med AD-liknande genetik, ger följande avsnitt detaljer om dessa processer och effekterna av åldrande och Alzheimers sjukdom på dem. Resultatet av denna granskning lyfter fram behovet av nya metoder som GEVAL-sonder för att direkt mäta förändringar i bunden och fri GTP och totala GTP-koncentrationer.

Fig. 1 Ratiometriska GTP-mätningar i primära mushippocampusneuroner från medelåldersmöss transfekterade med GEVAL530-sensor Falskfärgade pixel-för-pixel-ratiometriska bilder av neuroner visar olikformiga distributioner av GTP. (a) Överskott av fri-GTP/bundet-GTP av medelålders (14 månader) icke-transgen (NTg) vid kanterna och apikala dendrit jämfört med (c) medelålders (10 månader) 3xTg-AD-neuron. (b, d) Ökning av fritt GTP i neuroner behandlade med 2 mM nikotinamid med 24 timmar. (e, g) Obehandlade neuroner uppvisar vesikulärt bundet GTP som ökar i (f, h) neuroner behandlade med 2 mM nikotinamid med 24 timmar

Endocytos: GTP-beroende vid åldrande och AD

I endocytosprocessen internaliserar cellen makromolekyler och ligandbundna receptorer och ytproteiner inklusive amyloidprekursorproteinet (APP) [11] (Fig. 2A). Av de två huvudsakliga endocytiska vägarna sker plasmamembraninbäddat APP-upptag mestadels genom clathrin-medierat upptag (Fig. 2B.1) snarare än caveola-medierat från cholesterolrika fläckar (Fig. 2B.2). Hydrofobt A delar sig dock i kolesterolrika fläckar av lipidflottar i plasmamembranet med efterföljande upptag av caveolabanan [12] (Fig. 2B.2). I båda fallen samlas dynamin GTPase-komplex vid invagineringen för att katalysera GTP-beroende membrankrökning för slutlig fusion och frisättning av mogna vesiklar från plasmamembranet [13-15]. Lokal GTP-bränsle katalyseras av NME1- och 2-nukleotidfosfatkinaser som binder till dynamin [16]. Tidig endosom Rab5 GTPase beslut mot exocytos och receptoråtervinning eller transformation till sen endosom Rab7 GTPase för nedbrytning.

Rab5 GTPase anses vara en markör för den tidiga endosomen [17]. Rab5-protein finns i plasmamembranet, i clathrin-belagda vesiklar och tidiga endosomer (fig. 2). I cell- och fy-modeller av Huntingtons sjukdom deltar Rab5 i autofagosombildning för att reglera autofagi och eliminera giftigt mutant huntingtin [18]. Hämning av Rab5 minskar autofagi-reglerande proteaser Atg5-Atg12-konjugering, vilket resulterar i minskad autofagosombildning. Atg12-Atg5-konjugatet främjar lipideringen av Atg8, och lipiderad Atg8 underlättar autofagosomerbildning och selektiv lastigenkänning under autofagi [19].

En annan bidragande faktor till Rab5-medierad autofagi är fosfatidylinositol-3-kinas (PI3K). PI3-kinaskomplex hämmar autofagi genom att aktivera Akt/mTOR-signaleringsvägen [20]. P110-subenheten av PI3K-komplexet reglerar den katalytiska aktiviteten hos Vps34-komplexet för att främja PI3P-generering [21]. Detta steg är viktigt för autofagosomerbildning. P110 främjar övergången från Rab5- BNP till Rab5-GTP. P110-överuttryck mildrar autofagisk brist efter aktivering av det makromolekylära komplexet som består av Rab5, Vps34 och Beclin1, vilket i sin tur leder till autofagosombildning [22]. Inriktning på dessa specifika proteiner kan belysa terapeutiska vägar för att dämpa AD-patologi.

Fig. 2 Endocytos av amyloidprekursorproteinet (APP). Den N-terminala delen av APP-proteinet med 770 rester med grön skuggning av det aggregationsbenägna A kräver klyvning av BACE- och Gamma-peptidaser. B Endocytos av APP. (1) Bildning av den inåtriktade knoppen från plasmamembranet orkestrerad av clathrin med endoproteaserna BACE och 훾-sekretas. Endocytos som stöds av dynamin får lokal GTP av NME1. (2) Mikrodomäner anrikade på kolesterol (lipidflottar) binder APP bearbetat till A eller A adsorberat från parenkymet. (3) Tidig endosom attraherar GTPase Rab5 som känns igen av en annan GTPas, Rab11, för att förmedla (4) endocytisk återcirkulation av receptorer tillbaka till plasmamembranet. Alternativt (5) förmedlar Rab7 segregation tidigt till sena endosomer, vilket möjliggör ytterligare bearbetning av APP och ackumulering av A . (6) Sen endosomfusion med (7) lysosom för att bryta ned innehåll. En del aggregerat A kan vara resistent mot matsmältning, och med endosomstörning kan A ackumuleras i cytosolen.

Membranbunden Rab5 är en nyckelfaktor för att direkt främja Mon1-Ccz1-beroende Rab7-aktivering och Rab7-beroende membranfusion [23]. Mon1-Ccz1 är ett heterodimert guanin-nukleotidbytesfaktor GEF-komplex som aktiverar Rab5. Mån1-medierad förskjutning av Rab5 GEF resulterar i förskjutning av Rab5 med Rab7. C-Vps-komplexet fungerar som en GEF för Rab7 och främjar Rab7 som transiterar från det GDP-bundna till det GTP-bundna tillståndet för Rab7-aktivering. Ultraviolett strålningsresistens-associerad gen (UVRAG) stimulerar Rab7-aktivering genom UVRAG-C-Vps-interaktion genom GDP/GTP-utbyte av Rab7 [24]. En annan reglerande punkt i den autofagiska processen är homotypisk fusion och vakuolproteinsorteringskomplex (HOPS) som aktiverar jästvakuolär Ypt-Rab GTPas under membranfusion [25]. En av de 6 subenheterna i HOPS-komplexet är klass C-vakuolär proteinsortering (C-Vps)-komplexet som innehåller Vps11, Vps16, Vps18 och Vps33. Rab7 sena endocytiska vesiklar smälter därefter samman med lysosomer för lastnedbrytning (Fig. 2).

Förändringar i Rab 5 och Rab 7 endosomal trafficking i musmodeller och i AD

I musmodeller av AD med mutationer i amyloidprekursorproteinet (APP) eller A-producerande presenilin, verkar endosom-autofagosom-lysosom-vägen dysreglerad delvis på grund av nedsatt försurning av lysosomer som inte tillräckligt aktiverar proteas och lipaser [26]. I musmodeller av AD kolokaliserades stora perinukleära kroppar innehållande A med autofagosommarkören LC3 med Rab7 och sena endosomala och lysosomala komponenter. Detta kan bero på misslyckad skyddande uppreglering eller patologisk försämring. I neuroner odlade från 3xTg-AD-möss över hela åldersspannet fann vi att aggregerat vesikulärt A ökade 30–50 gånger med åldern, mest framträdande i Rab5-märkta tidiga endosomer och mitokondrier, men även inom Rab{{9} }märkta sena endosomer och autofagosomer [27]. Den snöbollsliknande ansamlingen av A 42 och A 45 tyder på att gamla neuroner inte kunde fullborda autofagisk nedbrytning av dessa längre aggregat av A . Vi antar att försämrad energiproduktion i gamla neuroner begränsar den energiska kapaciteten för att fullborda autofagi. Jämfört med nivåerna i den unga hippocampus och cortex, i 7–12-månader gamla APP/PS1 mushippocampus, minskade Rab7-nivåerna tillsammans med minskningar av Beclin1- och Rubicon-aktivatorer och en ökning av Rubicon-hämmaren [28]. I den yngre hippocampus och alla åldrar i cortex aktiverar Beclin1 Rab7, medan Rubicon hämmar aktiveringen av Rab7 via suppression på UV-strålningsresistensassocierat genprotein (UVRAG) -vakuolär proteinsorteringsgen (Vps) interaktion. Rab7-brist i jäst och fruktflugor resulterar i en massiv ansamling av autofagosomer [29]. Rab7 knockdown inaktiverar också mTORC1/S6K1, och lokaliseringen av mTOR i sena endosomer [30]. Intressant nog ändrar inte hämningen av andra stadier av endocytisk trafficking aktiviteten av mTORC1, vilket tyder på att intakta sena endosomer är avgörande för mTORC1-signalering i autofagi. Detta är en viktig anledning till att inriktning på mTOR kanske inte bromsar åldrandet eller AD.

Regionalt selektiv uppreglering av Rab 5 och Rab7 proteiner och mRNA i AD, antyder selektiva bidrag till sjukdomspatologi eller en otillräcklig skyddsmekanism [31]. A ackumuleras huvudsakligen i Rab7-positiva sena endosomer och autofagiska vakuoler av neuronala celler [32] på ett åldersrelaterat sätt [27] vilket orsakar internalisering av A och efterföljande ökning av Rab7 som utlöser neuronal degeneration [33]. Blockering av den sena endocytiska vägen genom Rab7-undertryckning inducerar A-beroende amyloidfibrillbildning på cellytan vilket orsakar endosomal förstoring [34] vilket resulterar i accelererad återvinning av Rab7 och endocytisk trafik av A till lysosomer för nedbrytning [35]. Hämning av Iysoso mal-proteolys kan också påverka den axonala retrograda transporten av autofaga organeller som orsakar AD-liknande axonal dystrofi [36]. Praktiska åtgärder för att främja Rab7-förmedlad autofagi kan dock försena eller vända AD-progression. Exempel inkluderar ett skifte från ett stillasittande tillstånd till träning, en medelhavsdiet och energihöjande föreningar som NAD-prekursorer för att skapa ett redoxskifte [4] (avsnitt 10). En annan väg är den märkliga upptäckten att nivåerna av guanosinmonofosfatreduktas 1 (NADPH-beroende GMPR1) ökar i AD-hjärnor, vilket i sig kan sänka GTP-nivåerna och höja AMP-signaleringen [37]. Neurofibrillära tovor av tau sänktes när denna aktivitet hämmades i AD-möss.

Med progression från mild kognitiv försämring till AD uppreglerades både endosomala Rab5- och Rab7-uttryck i hippocampala CA1-neuroner mätt med transkriptionell mikroarray [31]. Förstoring av Rab5-positiva endosomer var associerad med neurofibrillära trassel och amyloidavlagring. Neurotrofa faktorer såsom nervtillväxtfaktor (NGF) binder till deras Trk-receptorer och internaliserar i Rab5-positiva endosomer för att initiera nedströms signalering [38]. Det är intressant att notera att den signalerande endosomen behålls som Rab5 tidiga endosomer och går inte vidare till Rab7 sena endosomer, under deras transitering inom de långa axonerna [39]. Denna skillnad skiljer receptormedierad signalleverans från endosombearbetning mot autofagi [40]. Efter aktivering av NGF rekryterar TrkA en Rab5-GAP för att snabbt konvertera GTP-Rab5 till GDP-Rab5 för att hålla nivån av GTP-Rab5 i schack, vilket förhindrar Rab5- till Rab7-omvandlingen vilket resulterar i hämning av NGF-/TrkA-signaleringen och för tidig nedbrytning.

Rab5-funktionen äventyras i de tidiga faserna av AD [41]. Ihållande hyperaktivering av Rab5 främjade den endocytiska vägen mot sena endosomer, lysosomfusion och autofagi, vilket resulterade i för tidig nedbrytning av signalering av neurotrofisk faktor och neuronal atrofi. Vps35 och Vps26, två nyckelretromerproteiner, reducerades också i AD-hjärnor [42]. Vps26 binder till SorLA som är en sorteringsreceptor som kontrollerar APP-trafik från endosomer till Golgi. En minskning av Vps-retromerproteiner leder till onormalt Vps-SorLA-komplex som hindrar APP-tranficering av APP-ackumulering i endosomerna där det är föremål för beta-sekretas. Men att efterlikna APP-fosforylering vid S655, inom det APP 653YTSI656 basolaterala motivet, kan förbättra APP-hämtning i en retromermedierad process vilket orsakar minskad APP lysosomal inriktning och minskad Abeta-produktion [43]. En ökning av APP- och APP-fragment -CTF i full längd kan i sin tur höja Rab5 GTPas-aktivitet, vilket inducerar förstoring av tidiga endosomer [44]. Intressant nog kunde neuronal atrofi inducerad av APP-CTF:er räddas av en dominant-negativ Rab5-mutant både in vitro [39] och in vivo [45].

Nettoresultatet av åldrande är utarmning av sena endosomer, sen endocytisk dysfunktion och försämrad lysosomal fusion. I AD ökar endocytos av A till förstorade Rab5 tidiga endosomer. Rollen för Rab7 i AD är ännu inte tydligt klarlagd eftersom både tidig uppreglering och sen nedreglering av Rab7 har observerats påverka neuronal hälsa i båda riktningarna. Som betonats av Bianchi-Smiraglia et al. [7], total cellulär GTP som mäts i homogenat tillåter inte bedömning av fritt GTP tillgängligt lokalt för Rab GTPaserna. Fria GTP-mått har inte rapporterats ännu, så deras möjliga roll i ålder och AD-relaterade försämringar vid endocytos är outforskad. Därför kommer det att vara viktigt att mäta fritt GTP i levande celler och effekterna av variationer i fritt GTP på endocytos som en funktion av ålder och AD-modeller.

Fråga för mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

AFFÄR:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop