Hepcidin-medierad hypoferremi stör immunsvaret mot vaccination och infektion Del 2

DISKUSSION

Järn och immunmetabolism

Hepcidin-inducerad hypoferremi är en välbevarad komponent i det medfödda immunsvaret hos ryggradsdjur.8 Vi visar att hypoferremi kan försämra flera aspekter av adaptiv immunitet om den inträffar under perioden av lymfocytexpansion, med potential för efterföljande långvarig hämning av T-cellsminne även efter att hypoferremi har löst sig. Vi visar att lämplig reglering av cellulärt järnupptag som kontrolleras av IRP1/2 är väsentligt för T-cellseffektorfunktioner, och TFRC-medierad järnupptagning är cellinneboende nödvändig för B- och T-cellsvar in vivo.

Den anmärkningsvärda ökningen av uttrycket av TFRC av aktiverade T-celler, som ökar med ~1 miljon kopior av protein per cell inom 24 timmar, tillsammans med eskalering av transmembrana järnimportörer, indikerar en betydande intensifiering av ansträngningarna att förvärva järn från extracellulära källor. Även om vi visade att oxidativ metabolism och DNA-syntesstudier är två järnberoende processer som hämmas i T-celler av låg järntillgänglighet, kräver många andra cellulära vägar viktiga i T-cellsbiologi, inklusive epigenetisk omprogrammering och hypoxiavkänning, också järn och bör undersökas.

Dessutom kan minskat CD25-uttryck och misslyckande att känna av IL-2 bidra till den sämre kvaliteten på effektor/minne CD8 T-celler som observeras vid järnbrist.27 Eftersom den accelererade metaboliska aktiviteten hos aktiverade lymfocyter är särskilt känslig för järntillgänglighet, fysiologiska variationer i järnkoncentrationer påverkar immunsvaret starkt. Därför kan järn anses vara ett näringsämne som är relevant för begreppen immunometabolism.28

Immunitet avser kroppens förmåga att försvara sig mot olika skadliga faktorer från omvärlden. God immunitet har stor inverkan på människokroppen, inklusive: 1. sjukdomsresistens: Immunitet kan identifiera och eliminera patogener och förhindra att människokroppen drabbas av sjukdomar. 2. Främja återhämtning: Om människokroppen har infekterats med patogener, kan immunitet påskynda återhämtningen av sjukdomen och främja fysisk återhämtning. 3. Anti-aging: Dålig immunfunktion kommer att orsaka åldrande av kroppen, och god immunitet kan fördröja åldrandet av kroppen. 4. Förebygga cancer: Ett bra immunförsvar kan förstöra cancerceller och förebygga cancer. 5. Skydda kardiovaskulär hälsa: God immunitet kan minska förekomsten av hjärt-kärlsjukdomar.

Så vi måste förbättra vår immunitet i det dagliga livet. Studier har visat att Cistanche kan förbättra immuniteten. Cistanche innehåller även vissa antioxidantämnen, såsom Flavonoider, C-vitamin etc. som kan hjälpa till att ta bort fria radikaler i kroppen, minska oxidativ skada på celler och därmed indirekt förbättra immuniteten. Olika näringskomponenter och aktiva substanser i Cistanche kan verka synergistiskt, förbättra kroppens immunitet och ha en positiv roll för att främja människors hälsa.

Klicka på hälsofördelarna med cistanche

Hepcidin, hypoferremi och virusinfektioner

Hepcidinkontrollerad järnomfördelning skyddar mot vissa bakterieinfektioner och malaria hos möss.29,30 Hos människor uppstår ökad hepcidin och hypoferremi efter experimentella norovirus-, tyfoid- och malariainfektioner,31–33 och under den initiala uppkomsten av viremi i HIV{ {5}}infekterade blodgivare.34 Även om inflammatorisk hypoferremi kan vara fördelaktigt i samband med infektioner med encelliga organismer som måste förvärva järn från sin värd, saknas bevis för att lågt serumjärn är skyddande i samband med virusinfektioner. Faktum är att i våra experiment med influensaviruset, resulterade imponerande hepcidin-inducerad hypoferremi i ett försämrat adaptivt immunsvar, viral persistens och allvarlig lungsjukdom, vilket tyder på att lågt serumjärn ibland kan vara ett ohjälpsamt svar på infektion.

Färska rapporter visar att hypoferremi förekommer hos patienter med coronavirussjukdom 2019 (COVID-19) vid inläggning på intensivvårdsavdelningen (ICU).35 Lågt serumjärn korrelerade med lymfopeni och extremt lågt serumjärn (~3 mmol/L) ) identifierade covid-19-patienter med svår respiratorisk hypoxemi, sannolikt sekundär till lungskada. Denna hypoferremi är mer djupgående än i tidigare rapporterade kohorter av icke-COVID-19 intensivvårdspatienter, inklusive de med sepsis,36,37, vilket indikerar att extrem hypoferremi kan vara ett särskilt kännetecken för allvarlig covid-19-sjukdom. IL-6 driver hepcidinuttryck, och ett obalanserat inflammatoriskt svar med högt IL-6 och relativt lågt typ I och typ III IFN är associerat med allvarlig covid-19 och dåliga resultat.38,39 IL -6-driven och hepcidinmedierad hypoferremi kan försämra det antivirala adaptiva immunsvaret, vilket bidrar till infektionens svårighetsgrad. Tocilizumab, som är inriktat på IL-6R, är under utredning som ett terapeutikum för covid-19 och kan motverka hypoferremi. Övervakning av serumjärn hos covid-19-patienter kan vara användbart för att utvärdera sjukdomens svårighetsgrad och effekterna av behandlingar.

Järnavvägningen – konsekvenser för adaptiv immunitet och vaccination

Tidigare karakteriseringar av järns roll i infektionssammanhang beskriver patogenens försök att kapa värdjärn, vilket värden försvarar, vilket leder till en evolutionär kapprustning.40 Vi föreslår att infektionens hypoferremi också representerar en avvägning för värden, som försöker minska virulensen hos invaderande patogener genom att hålla tillbaka järn, men på så sätt samtidigt undanhåller järn från adaptiva immunsvar.

Resultatet av denna avvägning kommer att bero på arten av den orsakande infektionen, storleken och typen av det inflammatoriska svaret och värdens underliggande järnstatus. Globalt sett är hypoferremi vanligt i populationer där näringsmässig järnbrist är utbredd och där det också finns en börda av infektioner och inflammationer som ökar hepcidin, en kombination som sannolikt påverkar hundratals miljoner individer.4,10 Samt påverkar svaren på infektion direkt kan hypoferremi ha indirekta effekter på infektionsbördan genom att försämra svaren på vaccination. Effektiviteten och immunogeniciteten hos vissa vacciner är suboptimala i populationer där järnbrist är endemisk,41 och i sådana populationer förblir barndomsdödligheten från vaccinförebyggande infektioner oacceptabelt hög.42 Här visar vi i en smågrismodell att järn förstärker svaren på vaccination i samband med naturligt förekommande järnbrist.

Nyligen visade vi i en retrospektiv analys av kenyanska spädbarn att anemi är associerad med nedsatt humoral respons på vissa vacciner och att järntillskott kan förstärka det humorala svaret på ett mässlingsvaccin.43 Men järn kan också öka risken för vissa infektioner och negativt påverka tarmens mikrobiota.4 Följaktligen behövs skräddarsydda prövningar för att avgöra om riktat näringsjärn som ges vid vaccinationstillfället förbättrar effektiviteten av immuniseringar i populationer med järnbrist, inklusive barn och äldre.

Förhöjt hepcidin och hypoferremi hos IRIDA-patienter med mutationer i TMPRSS6 kan associeras med nedsatt humoral immunitet, åtminstone mot vissa patogener. Ihållande hög hepcidin och hypoferremi är också kännetecken för icke-infektiösa kroniska inflammatoriska sjukdomar såsom kronisk njursjukdom,9 och inflammation och järnbrist observeras i cancer.44 Adaptiv immunitet i dessa populationer och tillstånd kan äventyras av hypoferremi. Det bör noteras att farmakologisk eller genetisk manipulation av hepcidinaktivitet, avsedd som en terapeutisk intervention för järnrelaterade sjukdomar, är relativt väl utvecklad.45 Därför är hepcidin redan ett potentiellt tillgängligt mål och kan undersökas som en modalitet för att kontrollera immunsvar i flera sammanhang.

Studiebegränsningar

Medan vår studie fann att järnrestriktion försämrar T-cells aerob metabolism, bedömd av syreförbrukning och mitokondriell membranpotential, kan bredare hypotesfria tillvägagångssätt ge en mer holistisk uppskattning av mekanismen genom vilken begränsning av järntillgängligheten stör funktionen hos T-celler. Både T- och B-cellssvaren försämras av serumjärnbrist in vivo, men vi undersökte inte hur fysiologin hos isolerade B-celler störs av järnbrist eller hur T-cellsdifferentiering påverkas av järn. Dessutom har vi inte frågat i vilken utsträckning försämringen av CD8 T-cellsminne av järnbrist sträcker sig till CD4- och B-cellsminne och hur dessa observationer kan påverka svar på vacciner och skydd mot infektion.

Sammanfattning

Vi fann att hepcidin-inducerad hypoferremi försämrade primära och minnessvar på immunisering, och vi upptäckte en djup efterfrågan på aktiverade T-celler för järnmedierad åtminstone delvis av IRP1/2 och TFRC. Högt hepcidin kan hämma adaptiva immunsvar mot patogener, medan tillskott av järn mot bakgrund av lågt serumjärn kan förbättra immunsvaret. Dessa resultat indikerar att serumjärn, reglerat av hepcidin, är en viktig och potentiellt målbar kontrollpunkt för immunitet.

STAR plus METODER

Detaljerade metoder finns i onlineversionen av detta dokument och inkluderar följande:

TACK

Författarna tackar personalen vid Department of Biomedical Services, University of Oxford för djurhållning, Alireza Morovat (Clinical Biochemistry, Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust) för hjälp med biokemiska mätningar, David Pattinson (Jenner Institute, Oxford University) och Biobest Laboratories , Edinburgh, för hjälp med ELISA, och Weatherall Institute of Molecular Medicine flödescytometrianläggning och medlemmar av Cantrell Lab, University of Dundee, för många användbara diskussioner.

Detta arbete stöddes av UK Medical Research Council (MRC Human Immunology Units kärnfinansiering till HD, pris nr. MC_UU_12010/10), och ett Christopher Welch-stipendium och EMBO Short Term Fellowship till JNFSJ Draper är en Jenner-utredare, en Lister Institute Research Prize Fellow och en Wellcome Trust Senior Fellow (106917/Z/15/Z).

Vi tackar Jenner Institute, University of Oxford och Viral Vector Core Facility för produktionen av rekombinanta virala vacciner. Arbetet som utfördes på i3S stöddes av Norte 2020 Portugals regionala operativa program (bidragsnr Norte-01-0145- FEDER-000012); författarna erkänner också stödet från i3S Scientific Platform HEMS, en medlem av den nationella infrastrukturen PPBI-Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). OB finansieras av ett Sir Henry Wellcome Fellowship (105654/Z/14/Z). TKT finansierades av Townsend-Jeantet Charitable Trust (välgörenhetsorganisation nr 1011770). MS och UG stöddes av MRC Human Immunology Units kärnfinansiering till VCBK finansieras av ett NIHR Research Capability Funding-anslag från Oxford Biomedical Research Centre. SJ Dunachie är en Jenner-utredare och finansieras av Fleming Fund vid UK Department of Health and Social Care. MDF och DRC stöds av S. Burt Wolbach-professuren, Harvard Medical School. SKW stöddes av doktorandprogrammet Wellcome Trust Infection, Immunology & Translational Medicine (anslag nr. 108869/Z/15/Z). BG fick bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag nr. GA2075/3-1 och GA2075/5-1). MA finansierades av ett University of Reading International Research Studentship. AS stöds för närvarande av ett NIHR Doctoral Research Fellowship (NIHR-DRF-2017-10-094). Denna studie är tillägnad Maria de Sousa och Vincenzo Cerundolo.

FÖRFATTARBIDRAG

Konception och utformning av arbete, JNF, TKT, MA, TLD, AEA, ARMT, BG, MCL och HD Insamling och analys av data, JNF, TKT, MA, AS, SKW, MB, NS, KW, BK, GS, DRC, TLD, JML, AEA, JA, PJL, AEP, DA, MT, CN, MS, UG, FRMvdK, ARMT, BG, MDF, MCL och HD-insamling, fenotypning och genotypning av patienter med järnbrist, MDF och DRC Tolkning av data, JNF, NS, TLD, OB, SCA, SJ Dunachie, MZ, FRMvdK, VC, SJ Draper, ARMT, BG, MDF, MCL och HD Writing, JNF och HD

INTRESSEFÖRKLARING

HD har suttit i Kymabs rådgivande styrelse, fått forskningsfinansiering från Pfizer och La Jolla Pharmaceutical Company och fått hedersbetygelser från Pharmacosmos och Vifor. De andra författarna deklarerar inga konkurrerande intressen.

REFERENSER

1. Phan, AT, Goldrath, AW och Glass, CK (2017). Metabolisk och epigenetisk koordination av T-cells- och makrofagimmunitet. Immunity 46, 714-729.

2. Andreini, C., Putignano, V., Rosato, A. och Banci, L. (2018). Det mänskliga järnproteomet. Metallomics 10, 1223–1231.

3. Jabara, HH, Boyden, SE, Chou, J., Ramesh, N., Massaad, MJ, Benson, H., Bainter, W., Fraulino, D., Rahimov, F., Sieff, C., et al. al. (2016). En missense-mutation i TFRC, som kodar för transferrinreceptor 1, orsakar kombinerad immunbrist. Nat. Genet. 48, 74–78.

4. Pasricha, SR, Armitage, AE, Prentice, AM och Drakesmith, H. (2018). Minska anemi i låginkomstländer: kontroll av infektion är avgörande. BMJ 362, k3165.

5. Muckenthaler, MU, Rivella, S., Hentze, MW och Galy, B. (2017). En röd matta för järnmetabolism. Cell 168, 344–361.

6. Nemeth, E., Tuttle, MS, Powelson, J., Vaughn, MB, Donovan, A., Ward, DM, Ganz, T. och Kaplan, J. (2004). Hepcidin reglerar cellulärt järnutflöde genom att binda till ferroportin och inducera dess internalisering. Science 306, 2090–2093.

7. Lim, PJ, Duarte, TL, Arezes, J., GarciaSantos, D., Hamdi, A., Pasricha, SR, Armitage, AE, Mehta, H., Wideman, S., Santos, AG, et al. (2019). Nrf2 kontrollerar järnhomeostas vid hemokromatos och talassemi via Bmp6 och hepcidin. Nat. Metab. 1, 519-531.

8. Drakesmith, H. och Prentice, AM (2012). Hepcidin och järninfektionsaxeln. Science 338, 768–772.

9. Ganz, T. (2019). Anemi av inflammation. N. Engl. J. Med. 381, 1148-1157.

10. Armitage, AE, Agbla, SC, Betts, M., Sise, EA, Jallow, MW, Sambou, E., Darboe, B., Worwui, A., Weinstock, GM, Antonio, M., et al. (2019). Snabb tillväxt är en dominerande prediktor för hepcidinundertryckning och sjunkande ferritin hos gambiska spädbarn. Haematologica 104, 1542–1553.

11. Prentice, AM, Bah, A., Jallow, MW, Jallow, AT, Sanyang, S., Sise, EA, Ceesay, K., Danso, E., Armitage, AE, Pasricha, S.-R., et al. (2019). Luftvägsinfektioner driver hepcidin-medierad blockad av järnabsorption som leder till järnbristanemi hos afrikanska barn. Sci. Advances 5, eaav9020.

12. Dallman, PR (1987). Järnbrist och immunförsvaret. Am. J. Clin. Nutr. 46, 329-334.

13. Oppenheimer, SJ (2001). Järn och dess relation till immunitet och infektionssjukdomar. J. Nutr. 131 (2S-2), 616S–633S, diskussion 633S–635S.

14. Wang, Z., Yin, W., Zhu, L., Li, J., Yao, Y., Chen, F., Sun, M., Zhang, J., Shen, N., Song, Y. ., och Chang, X. (2018). Järn driver T-hjälparcellers patogenicitet genom att främja RNA-bindande protein PCBP1-medierad proinflammatorisk cytokinproduktion. Immunitet 49, 80–92.e7.

15. Jiang, Y., Li, C., Wu, Q., An, P., Huang, L., Wang, J., Chen, C., Chen, X., Zhang, F., Ma, L. ., et al. (2019). Järnberoende histon 3 lysin 9 demetylering kontrollerar B-cellsproliferation och humorala immunsvar. Nat. Commun. 10, 2935.

16. Preza, GC, Ruchala, P., Pinon, R., Ramos, E., Qiao, B., Peralta, MA, Sharma, S., Waring, A., Ganz, T. och Nemeth, E. (2011). Minihepcidiner är rationellt utformade små peptider som efterliknar hepcidinaktivitet hos möss och kan vara användbara för behandling av järnöverskott. J. Clin. Investera. 121, 4880–4888.

17. Howden, AJM, Hukelmann, JL, Brenes, A., Spinelli, L., Sinclair, LV, Lamond, AI och Cantrell, DA (2019). Kvantitativ analys av T-cellsproteomer och miljösensorer under T-cellsdifferentiering. Nat. Immunol.20, 1542–1554. 

18. Hentze, MW, Muckenthaler, MU, Galy, B. och Camaschella, C. (2010). Två till tango: reglering av däggdjursjärnmetabolism. Cell 142, 24–38.

19. Hukelmann, JL, Anderson, KE, Sinclair, LV, Grzes, KM, Murillo, AB, Hawkins, PT, Stephens, LR, Lamond, AI och Cantrell, DA (2016). Det cytotoxiska T-cellsproteomet och dess formning av kinaset mTOR. Nat. Immunol. 17, 104–112.

20. Knight, ZA, Schmidt, SF, Birsoy, K., Tan, K. och Friedman, JM (2014). En kritisk roll för mTORC1 vid erytropoes och anemi. eLife 3, e01913.

21. Gerlach, C., Moseman, EA, Loughhead, SM, Alvarez, D., Zwijnenburg, AJ, Waanders, L., Garg, R., de la Torre, JC, och von Andrian, UH (2016). Kemokinreceptorn CX3CR1 definierar tre antigenupplevda CD8 T-celler med distinkta roller i immunövervakning och homeostas. Immunity 45, 1270-1284.

22. Hikono, H., Kohlmeier, JE, Takamura, S., Wittmer, ST, Roberts, AD och Woodland, DL (2007). Aktiveringsfenotyp, snarare än central- eller effektorminnesfenotyp, förutsäger återkallningseffektiviteten hos minnes CD8 plus T-celler. J. Exp. Med. 204, 1625–1636.

23. Rytych, JL, Elmore, MR, Burton, MD, Conrad, MS, Donovan, SM, Dilger, RN och Johnson, RW (2012). Järnbrist tidigt i livet försämrar rumslig kognition hos neonatala smågrisar. J. Nutr. 142, 2050–2056.

24. Maes, D., Segales, J., Meyns, T., Sibila, M., Pieters, M. och Haesebrouck, F. (2008). Kontroll av Mycoplasma hyopneumoniae-infektioner hos grisar. Veterinär. Microbiol. 126, 297-309.

25. Feinberg, KE, Heeney, MM, Campagna, DR, Aydinok, Y., Pearson, HA, Hartman, KR, Mayo, MM, Samuel, SM, Strouse, JJ, Markianos, K., et al. (2008). Mutationer i TMPRSS6 orsakar järnrefraktär järnbristanemi (IRIDA). Nat. Genet. 40, 569-571.

26. Harboe, ZB, Benfield, TL, Valentiner-Branth, P., Hjuler, T., Lambertsen, L., Kaltoft, M., Krogfelt, K., Slotved, HC, Christensen, JJ och Konradsen, HB ( 2010). Temporala trender i invasiv pneumokocksjukdom och pneumokockserotyper under 7 decennier. Clin. Infektera. Dis. 50, 329-337.

27. Kalia, V. och Sarkar, S. (2018). Reglering av effektor och minne CD8 T-celldifferentiering av IL-2—A Balancing Act. Främre. Immunol. 9, 2987.

28. Lee, YS, Wollam, J. och Olefsky, JM (2018). En integrerad bild av immunmetabolism. Cell 172, 22–40.

29. Arezes, J., Jung, G., Gabayan, V., Valore, E., Ruchala, P., Gulig, PA, Ganz, T., Nemeth, E. och Bulut, Y. (2015). Hepcidin-inducerad hypoferremi är en kritisk värdförsvarsmekanism mot den hydrofila bakterien Vibrio vulnificus. Cell Host Microbe 17, 47–57.

30. Portugal, S., Carret, C., Recker, M., Armitage, AE, Gonc¸ alves, LA, Epiphanio, S., Sullivan, D., Roy, C., Newbold, CI, Drakesmith, H. , och ll OPEN ACCESS 178 Med 2, 164–179, 12 februari 2021 Klinisk och translationell artikel Mota, MM (2011). Värdförmedlad reglering av superinfektion vid malaria. Nat. Med. 17, 732-737.

31. Darton, TC, Blohmke, CJ, Giannoulatou, E., Waddington, CS, Jones, C., Sturges, P., Webster, C., Drakesmith, H., Pollard, AJ och Armitage, AE (2015) . Snabbt eskalerande hepcidin och tillhörande serumjärnsvält är kännetecken för den akuta responsen på tyfusinfektion hos människor. PLOS Negl. Trop. Dis. 9, e0004029.

32. Spottiswoode, N., Armitage, AE, Williams, AR, Fyfe, AJ, Biswas, S., Hodgson, SH, Llewellyn, D., Choudhary, P., Draper, SJ, Duffy, PE och Drakesmith, H. (2017). Aktivinernas roll i hepcidinregleringen under malaria. Infektera. Immun. 85, e00191-e17.

33. Williams, AM, Ladva, CN, Leon, JS, Lopman, BA, Tangpricha, V., Whitehead, RD, Armitage, AE, Wray, K., Morovat, A., Pasricha, SR, et al. (2019). Förändringar i koncentrationer av mikronäringsämnen och inflammationsserumbiomarkörer efter en mänsklig utmaning med norovirus. Am. J. Clin. Nutr. 110, 1456–1464.

34. Armitage, AE, Stacey, AR, Giannoulatou, E., Marshall, E., Sturges, P., Chatha, K., Smith, NM, Huang, X., Xu, X., Pasricha, SR, et al. . (2014). Distinkta mönster av hepcidin- och järnreglering under HIV--1-, HBV- och HCV-infektioner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 12187–12192.

35. Shah, A., Frost, JN, Aaron, L., Donovan, K. och Drakesmith, H.; Samarbetspartners (2020). Systemisk hypoferremi och svårighetsgraden av hypoxemisk andningssvikt vid covid-19. Crit. Vård 24, 320.

36. Lan, P., Pan, KH, Wang, SJ, Shi, QC, Yu, YX, Fu, Y., Chen, Y., Jiang, Y., Hua, XT, Zhou, JC och Yu, YS (2018). Hög serumjärnnivå är associerad med ökad dödlighet hos patienter med sepsis. Sci. Rep. 8, 11072.

37. Tacke, F., Nuraldeen, R., Koch, A., Strathmann, K., Hutschenreuter, G., Trautwein, C. och Strnad, P. (2016). Järnparametrar bestämmer prognosen för kritiskt sjuka patienter. Crit. Care Med. 44, 1049-1058.

38. Blanco-Melo, D., Nilsson-Payant, BE, Liu, WC, Uhl, S., Hoagland, D., Møller, R., Jordan, TX, Oishi, K., Panis, M., Sachs, D., et al. (2020). Obalanserad värdrespons på SARS-CoV-2 driver utvecklingen av covid-19. Cell 181, 1036–1045.e9.

39. Cao, X. (2020). COVID-19: immunopatologi och dess konsekvenser för terapi. Nat. Rev. Immunol. 20, 269-270.

40. Barber, MF och Elde, NC (2014). Fly från bakteriell piratkopiering av järn genom snabb utveckling av transferrin. Science 346, 1362–1366.

41. Olotu, A., Fegan, G., Wambua, J., Nyangweso, G., Leach, A., Lievens, M., Kaslow, DC, Njuguna, P., Marsh, K. och Bejon, P. (2016). Sjuårig effekt av RTS, S/AS01 malariavaccin bland unga afrikanska barn. N. Engl. J. Med. 374, 2519-2529.

42. Greenwood, B. (2014). Vaccinationens bidrag till global hälsa: dåtid, nutid och framtid. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369, 20130433.

43. Stoffel, NU, Uyoga, MA, Mutuku, FM, Frost, JN, Mwasi, E., Paganini, D., van der Klis, FRM, Malhotra, IJ, LaBeaud, AD, Ricci, C., et al. (2020). Järnbristanemi vid tidpunkten för vaccination förutsäger minskat vaccinsvar och järntillskott vid tidpunkten för vaccination ökar humoral vaccinrespons: En födelsekohortstudie och en randomiserad uppföljningsstudie i kenyanska spädbarn. Främre. Immunol. 11, 1313.

44. Lopez, A., Cacoub, P., Macdougall, IC och Peyrin-Biroulet, L. (2016). Järnbristanemi. Lancet 387, 907–916.

45. Katsarou, A. och Pantopoulos, K. (2018). Hepcidin Therapeutics. Pharmaceuticals (Basel) 11, 127.

46. ​​Schulman, JL och Kilbourne, ED (1969). Oberoende variation i naturen av hemagglutinin- och neuraminidasantigener från influensavirus: särdragen hos hemagglutininantigen från Hongkong-68-virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 326–333.

47. Powell, TJ, Silk, JD, Sharps, J., Fodor, E. och Townsend, AR (2012). Pseudotypad influensa A-virus som ett vaccin för induktion av heterotypisk immunitet. J. Virol. 86, 13397–13406.

48. Wang, C., Hart, M., Chui, C., Ajuogu, A., Brian, IJ, de Cassan, SC, et al. (2016). Germinalt centrum B-cell och T-follikulära hjälparcellsvar på viral vektor och protein-i adjuvansvacciner. J. Immunol. 197, 1242-1251.

49. Galy, B., Ferring, D. och Hentze, MW (2005). Generering av villkorade alleler av murina Iron Regulatory Protein (IRP)-1 och -2 gener. Första Moseboken 43, 181–188.

50. Badea, TC, Wang, Y. och Nathans, J. (2003). En icke-invasiv genetisk/farmakologisk strategi för att visualisera cellmorfologi och klonala relationer i musen. J. Neurosci. 23, 2314–2322.

51. Heeney, MM, Guo, D., De Falco, L., Campagna, DR, Olbina, G., Kao, PP, Schmitz-Abe, K., Rahimov, F., Gutschow, P., Westerman, K. ., et al. (2018). Normalisering av hepcidin förutsäger TMPRSS6-mutationsstatus hos patienter med kronisk järnbrist. Blod 132, 448–452.

52. Naik, SH, Proietto, AI, Wilson, NS, Dakic, A., Schnorrer, P., Fuchsberger, M., Lahoud, MH, O'Keeffe, M., Shao, QX, Chen, WF, et al. . (2005). Nyskapande: generering av mjält-CD8 plus och CD8- dendritiska cellekvivalenter i Fms-liknande tyrosinkinas 3 ligand benmärgskulturer. J. Immunol. 174, 6592–6597.

53. Xiao, B., Deng, X., Zhou, W. och Tan, EK (2016). Flödescytometri-baserad bedömning av mitofagi med MitoTracker. Främre. Cell. Neurosci. 10, 76.

54. Armitage, AE, Lim, PJ, Frost, JN, Pasricha, SR, Soilleux, EJ, Evans, E., Morovat, A., Santos, A., Diaz, R., Biggs, D., et al. (2016). Inducerad störning av det järnreglerande hormonet Hepcidin hämmar akut inflammatorisk hypoferremi. J. Innate Immun. 8, 517–528.

55. Buchweitz, JP, Karmaus, PW, Harkema, JR, Williams, KJ och Kaminski, NE (2007). Modulering av luftvägssvar på influensa A/PR/8/34 av Delta9-tetrahydrocannabinol i C57BL/6-möss. J. Pharmacol. Exp. Ther. 323, 675-683.

56. Efstratiou, A. och Maple, PAC (1994). Laboratoriediagnos av difteri (World Health Organization Regional Office for Europe).

57. Hefele, L., Syphan, S., Xayavong, D., Homsana, A., Kleine, D., Chanthavilay, P., Nouanthong, P., Xaydalasouk, K., Phathammavong, O., Billamay, S. ., et al. (2019). Seroskydd på olika nivåer av hälso- och sjukvårdssystemet efter rutinvaccination med difteri-stelkramp Kikhosta helcell-hepatit B-Haemophilus influenzae typ B i Laos demokratiska republik. Clin. Infektera. Dis. 69, 2136-2144.

58. Världshälsoorganisationen (2005). Rekommendation för produktion och kontroll av pneumokockkonjugatvacciner. Världshälsoorgan. Tech. Rep Ser. 927, 64–98.

59. Chen, RT, Markowitz, LE, Albrecht, P., Stewart, JA, Mofenson, LM, Preblud, SR, och Orenstein, WA (1990). Mässlingsantikropp: omvärdering av skyddande titrar. J. Infect. Dis. 162, 1036-1042.

STAR plus METODER

TABEL FÖR NYCKELRESURSER

TILLGÄNGLIGHET RESURSER

Huvudkontakt

Ytterligare information och förfrågningar om resurser och reagens ska riktas till och kommer att uppfyllas av huvudkontakten, Hal Drakesmith (alexander.drakesmith@ imm.ox.ac.UK).

Materialtillgänglighet

Detta projekt genererade inga nya unika reagenser.

Data och kodtillgänglighet

Det här projektet genererade ingen ny kod eller nya datauppsättningar.

EXPERIMENTELL MODELL OCH ÄMNESDETALJER Möss

Om inget annat anges, utfördes djurförsök under auktoritet av UK Home Office-projektet och personliga licenser enligt Animals (Scientific Procedures) Act 1986 och godkändes av University of Oxfords etiska granskningskommitté. Möss hölls i individuellt ventilerade burar och matades ad libitum med en standarddiet innehållande 188 ppm järn (SDS Dietex Services, diet 801161), eller bestrålad diet med låg järnhalt (2ppm Fe, TD.99397, Teklad Envigo), eller bestrålad justerad järndiet (kontroll för diet med låg järnhalt, 200 ppm Fe, TD.07801, Teklad Envigo). Möss avlivades i ökande CO2-koncentrationer.

WT C57BL/6JOlaHsd möss beställdes från Envigo. WT B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (kongena C57BL/6 CD45.1-uttryckande möss) föddes upp internt vid University of Oxford. WT-möss hölls på en standarddiet på 188 ppm järn i minst 2- veckor internt innan jämförelser med transgena ämnen gjordes. TfrcY20H/Y20H-möss på en homogen C57BL/6-bakgrund var en vänlig gåva från Raif Geha, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School.3 OT-I CD45.1: Transgen C57BL/ 6.Tg(TcraTcrb)1100Mjb (OT-I) möss korsade med BL6-kongen stam B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ inhouse var en vänlig donation från Mike Bogetofte Barnkob och Vincenzo Cerundolo (MRC HIU). OT-II CD45.1/CD45.2 heterozygota möss.

Transgena B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OT-II) möss var en gåva från Oliver Bannard och ursprungligen från The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME, och korsade till medfödd homozygot B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) för att generera möss heterozygota för Tg(TcrbaTcrb)425Cbn-transgenen, Pepc- och Pepb-alleler: OT-II CD45.1/CD45.2 heterozygota.

Alla möss var könsmatchade och åldersmatchade (inom 2- veckor) inom de individuella experimenten. För in vivo-immuniseringsexperiment användes möss mellan 6-9 veckor gamla, alla möss var mellan 6-12 veckor gamla när experimentet initierades. Inom varje experiment fördelades möss slumpmässigt till behandlingsgrupper så att lika många möss i varje bur fick varje behandling. För dietexperiment tilldelades mössen slumpmässigt till dietgrupper i början av experimentet.

T-celler med villkorad förlust av IRP-funktion härleddes från djur som erhållits genom att korsa muslinjer som bär floxade Irp1 (Aco1) och Irp2 (Ireb2) alleler49 med en knock-in stam som bär en tamoxifen-inducerbar CRE-rekombinas (CreERT2)-sekvens in i den tillåtande Rosa26 locus.50 Aco1flox/flox, Ireb2flox/flox, Rosa26 plus / plus (CRE-negativ, benämnd IRP1/2flox/flox Cre –ve) och Aco1flox/flox,Ireb2flox/flox, Rosa26 plus /CreERT2 kullkamrater (CRE-positiva, benämnd IRP1/ 2flox/flox Cre plus ve) var på en homogen C57BL/6-bakgrund. Uppfödningen och förfarandena som utfördes på möss vid DKFZ gjordes enligt institutionella riktlinjer. Möss genotypades med användning av Acol- och Ireb2-primersekvenserna i nyckelresurstabellen.

Injicerade ämnen

Minihepcidin: En lämplig massa av mini-hepcidin PR7329 (da-TH-Dpa-bhProRCR-bhPhe-Ahx-Ida(Hexadecylamin)-NH2) löstes i 80 procent etanol och blandades sedan med 60 mg Purebright SL220/Sunbright DSPE }}CN (NOF). Kontrolllösningen var Purebright SL220 löst i etanol. Etanolen avdunstades med användning av en vakuumkammare värmd till 50°C. Den resulterande gelén lagrades i upp till 24 timmar vid 4°C och återupplöstes i en lämplig volym vatten för att ge en mHep-koncentration av 1 mM: 100 nmol mini-hepcidin i 100 ml vatten injicerades per mus per dos.

Järn(III)ammoniumcitrat (FAC) (F5879 Sigma Aldrich) löstes i 3 mg/ml i PBS. 100 ml injicerades intraperitonealt i möss. Järndextran (Sigma, D8517) justerades till 20 mg/ml i PBS och 100 ml injicerades intraperitonealt i möss.

Immuniseringar

Modifierat vacciniavirus Ankara som uttrycker ovalbumin: MVA-OVA var en vänlig gåva från Viral Vector Core Facility, Jenner Institute, University of Oxford. Viruset späddes till 10^7 plackbildande enheter (PFU)/ml i PBS, och 100 ml injicerades subkutant i mössens flanker.

Adenovirus mänsklig serotyp 5 som uttrycker ovalbumin: AdHu5-OVA var en vänlig gåva från Viral Vector Core Facility, Jenner Institute, University of Oxford. Viruset späddes till 10^10 virala partiklar (VP)/ml i PBS, och 100 ml injicerades subkutant i flanken av möss.

För immuniseringar av primärt OVA-protein fick möss 200 ug (för OT-I- eller OT-II-svar) eller 800 ug (endogena svar) OVA (änden av det Ovalbumin vac-pov, Invivogen), 25 ug MPLA (vac-mpla, Invivogen) och 1 ug alfa-galaktosylceramid (gåva från GS Besra, University of Birmingham, Storbritannien eller KRN7000 Enzo Life Sciences). För sekundära OVA-proteinimmuniseringar fick möss 200 ug OVA och 25 ug MPLA subkutant i flanken.

Adoptiva överföringar

För experiment som involverade svaret från OT-I CD8 eller OT-II CD4 T-celler erhölls röda blodkroppslyserade mjältsuspensioner och frekvensen av OT-I CD8 T-celler eller OT-II CD4 T-celler utvärderades med flödescytometri. Koncentrationen av hel mjältesuspension justerades till 50,000 OT-I CD8 T-celler/ml eller 500,000 OT-II CD4 T-celler/ml och 100 ul cellsuspension i PBS injicerades iv

Blandade benmärgschimärer

För experiment med blandad benmärgskimerism kombinerades en blandning av 60 procent TfrcY20H/Y20H CD45.2 (eller WT CD45.2) benmärg med 40 procent CD45.1 benmärg för att testa kapaciteten hos TfrcY20H/Y20H-celler att rekonstituera och bidra till immunsvar i förhållande till vildtypsceller. Manliga CD45.2-mottagare vid 8 veckors ålder bestrålades dödligt med 4,5 Gy i 300 s, följt av en 3-timmes vila och en efterföljande 4,5 Gy-dos i 300 s. Möss fick totalt 2 miljoner benmärgsceller från de specificerade mössen efter 9-veckors vila perifert blod togs för att analysera rekonstitution med flödescytometri. För att förhindra bakteriell infektion fick möss som mottog antibiotika i sitt dricksvatten (0,16 mg/ml Enrofloxacin (Baytril), Bayer Corporation).

Influensavirusinfektion

Influensavirus (A/X-31 (H3N2) A/Aichi/2/1968)46 förökades i MDCK-SIAT1-celler och kvantifierades genom hemagglutinationsanalyser och TCID50 som tidigare beskrivits.47

Möss bedövades med aerosoliserat isofluran och infekterades med 0.08 hemagglutinationsenheter (HAU) av influensavirus X-31 intranasalt. Virussuspension pipetterades droppvis på nasskålarna så att viruset inhalerades.

Influensaspecifika antikroppstitrar i serumet från infekterade möss mättes genom in vitro mikroneutraliseringsanalyser av infektion av MDCK-SIAT1-celler med en H3N2 (X31) GFP som uttrycker pseudotypat reportervirus (S-FLU) som beskrivits47 med mindre modifieringar. I korthet värmeinaktiverades uppsamlade mussera vid 56°C under 30 min. Spädningar av sera (startspädning 1:40) inkuberades med H3N2 (X31) S-FLU under 2 timmar vid 37°C innan tillsatsen av 3e4 av indikator MDCK-SIAT1-celler. Plattorna inkuberades över natten vid 37°C. Plattorna tvättades sedan och fixerades i 10 procent formalin. GFP-uttryck mättes på en Clariostar-plattläsare och utspädningen av sera som resulterade i en 50-procentig minskning av virusinfektionen (bestämd via en 50-procentig minskning av GFP-signalen) rapporterades som den neutraliserande titern (EC50).

Smågrisstudie

Inhysning av smågrisar och experimentella procedurer utfördes alla vid Center for Dairy Research (CEDAR), University of Reading, enligt lokala etiska riktlinjer. Alla experiment godkändes av Reading Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) och utfördes under en brittisk hemmakontorslicens.

För att bedöma effekten av järnbrist på svar på vaccination fördelades 18 stora vita F1-hybridgrisar från 6 kullar jämnt mellan 2 könsmatchade behandlingsgrupper vid 1 dag gamla. Behandlingarna var: grupp 1: Icke-järntillsatt kontroll, utfodrad sugmjölksersättning (SMR) liknande nötkreatursbaserad modersmjölksersättning; grupp 2: matad järntillskott (150 mg/kg BW) SMR, hälften av denna grupp fick också en intramuskulär (IM) järninjektion (200 mg Fe) vid 1 dag gammal (Figur S6). Innan de anlände till CEDAR fick smågrisarna inga vaccinationer, antibiotika eller vanliga IM-järninjektioner för djurhållning. Inledningsvis inhystes smågrisar i 2 grupper (oralt järn och inget oralt järntillskott) för att lära sig att dricka ur skålar och vid 2 dagars ålder hölls individuellt.

Under hela försöket hölls smågrisar vid 30C på sågspån och halm och försågs med värmelampor under en 12 timmars ljus- och mörkercykel och hade fri tillgång till färskt dricksvatten. Smågrisar matades initialt med 10 procent SMR-koncentration (antingen med järntillskott eller utan tillskott) var 4:e timme (5 foder/dag) och detta ökades till 15 procent och slutligen till 20 procent (4 foder/dag, standardkoncentration) dag 4 för att minska risken för skurning. Efter viktmätningar två gånger i veckan ökades mängden SRM och järnsulfat (oralt järntillskott) i enlighet med detta för att uppnå 150 mg/kg kroppsvikt under hela försöket. Alla smågrisar fick en IM-vaccination mot Mycoplasma hyopneumoniae (2 ml, Suwaxyn MH-One, Zoetis Ltd, Leatherhead, Storbritannien) vid 2 veckors ålder, och blodprover togs via venpunktion med användning av icke-EDTA-vacutainers efter 2 veckor (före vaccination), 3 och 4 veckor gammal (efter vaccination). Blodet kyldes omedelbart i 3-4 timmar innan det centrifugerades för att erhålla serum, som förvarades vid 80C. Efter 28 dagar dödades smågrisar av en överdos av pentobarbitalnatrium BP 20 procent (Dolethal, Vetoquinol Ltd, Northamptonshire, Storbritannien).

IRIDA-patienter

Insamling, genotypning och hematologisk fenotypning av IRIDA- och kontrollpatienter har beskrivits tidigare.51

Cell kultur

Alla celler odlades vid 37°C, 20 procent O2 och 5 procent CO2. Media. Slutför R10. RPMI med 10 procent FCS (sigma), glutamin (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (0,1 mg/ml) och Beta-merkaptoetanol (55 mM). Järnmodifierat odlingsmedium. Pannexin NTS serumersättning (P04-95080; Pan Biotech) som saknar järn beställdes. Järnfri Pannexin NTS serumersättning tillsattes med 10 % v/v till RPMI tillsammans med glutamin (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (0,1 mg/ml) och Beta-merkaptoetanol (55 mM) för att göra järnfri komplett medium. För att modifiera järnhalten i det järnfria kompletta mediet tillsattes holotransferrin (T0665 Sigma Aldrich) i den specificerade koncentrationen. Apotransferrin (T1147 Sigma Aldrich) sattes också till det järnfria kompletta mediet för att upprätthålla den totala transferrinkoncentrationen av mediet vid 1,2 mg/ml.

CD8 T-celler. Encellssuspensioner gjordes från cervikala, inguinala, axillära och brachiala lymfkörtlar genom mekanisk dissociation genom en 40 mm cellsil. När proliferationen analyserades återsuspenderades lymfkörtelsuspensioner i 500 ml PBS med 5 mM Invitrogen Cell Trace Violet (C34557) och färgades vid 37°C under 8 minuter innan de släcktes med 12 ml komplett medium, tvättades och fortsatte till T-cellisolering. CD8 T-celler isolerades från lymfkörtlarna i WT C57BL/6, TfrcY20H/Y20H, OT-I CD45.1 med användning av Stem Cell Technologies CD8 T-cellisoleringskit (19853, Stem Cell Technologies) och Easy Plate Magnet och från IRP1 /2flox/flox Cre -/ plus ve möss som använder Miltenyi Biotech negativa CD8 T-cellisoleringskit (130-104-075, Miltenyi Biotech) enligt tillverkarens instruktioner.

Plattor behandlade med platt vävnadsodling belades med 5 mg/ml antimus CD3 (145-2C11) under 2 timmar vid 37°C och tvättades sedan med PBS. CD8 T-celler ströks ut i ett komplett medium med en slutlig koncentration av 100 U/ml mus-IL-2 och 1 mg/ml anti-mus CD28 (37,51). Kulturer som involverade TfrcY20H/Y20H, WT C57BL/6-celler eller IRP1/2flox/flox Cre -/ plus ve utfördes i ett komplett R10-medium. Kulturer som undersökte effekten av reducerad järnkoncentration på WT T-celler från C57BL6/ eller OT-1 CD45.1-möss utfördes i järnfritt komplett medium. CD8 T-celler ströks ut vid en slutlig koncentration av 500,000/ml för analys 72 timmar efter aktivering för proliferationsanalys eller 700,000/ml för analys 24 timmar efter aktivering för aktiveringsanalys.

För odlingen av IRP1/2flox/flox Cre -/ plus behandlades ve-celler med antingen 4-hydroxitamoxifen (4-OHT) (H6278, Sigma/Merck) vid 100 nM eller en jämförbar volym ren etanol samtidigt med aktiveringsblandningen av lösligt anti-CD28, IL-2 och plattbundet anti-CD3. När cellproliferation skulle analyseras skördades cellerna efter 24 timmars odling, snurrades ner och återsuspenderades i färskt medium med 100 U/ml mus IL-2 och 1 mg/ml antimus CD28 för att avlägsna {{19} }OHT eller EtOH och återpläterats i brunnar belagda med anti-mus CD3. Celler odlades under ytterligare 48 timmar och proliferation utvärderades med flödescytometri.

För järnräddningsexperiment tillsattes järnsulfat (FeSO4) (F8633, Sigma Aldrich) eller järnammoniumcitrat (FAC) (F5879, Sigma Aldrich) i den angivna koncentrationen från början av odlingen och fylldes på i fallet av IRP1/2flox/flox Cre -/ plus ve-experimenten efter 24 timmar när 4-OHT/EtOH avlägsnades.

BMDCs odlades enligt beskrivning52 med mindre modifieringar. I korthet, röda blodkroppslyserade benmärgsceller från C57BL/6-möss återsuspenderades vid 1 miljon celler/ml i komplett R10-medium med 100 ng/ml FLT3L (550702, Biolegend) och odlades i 7 dagar före användning.

METOD DETALJER

Flödescytometri

Encellssuspensioner av lymfkörtlar eller mjälte gjordes genom mekanisk dissociation genom en 40 mm cellsil. Röda blodkroppar lyserades i mjältsuspensioner med användning av Tris-ammoniumklorid (ACT) Lyseringsbuffert för röda blodkroppar (2,06 g/L Tris-bas och 7,47 g/L NH4Cl, 1 L H20, justerad till pH 7,2)

För att isolera lymfocyter från lungan maldes lungorna med sax och smältes i 3 0 minuter i 4 ml matsmältningsmedium: RPMI, 40 U/ml DNas I (Sigma-Aldrich, katalognummer: D5025) och 0,4 mg/ ml kollagenas IV (Sigma-Aldrich, katalognummer: C5138). Encellssuspensioner gjordes genom att krossa genom en 70-cellsil. Celler pelleterades och röda blodkroppar lyserades med ACT Red cell-lysbuffert. En 40 procent /80 procent Percoll (GE Healthcare 17-0891-02) lagerisolering användes sedan för att berika lymfocyter i lungsuspensionen. Anrikade lymfocyter tvättades sedan och räknades före flödesfärgning.

För analys av murina perifera blodleukocyter blandades 100 ml helblod uppsamlat genom svansblödning i ett BD-mikrotrainer-EDTA-rör med 1 ml ACT Red Cell-lysbuffert och inkuberades vid rumstemperatur i 20 minuter. Blodlösningen centrifugerades vid 400 g under 5 minuter, supernatanten avlägsnades och leukocytpelleten överfördes till en rundbottnad platta med 96 brunnar för flödescytometrisk färgning.

Vävnadscellsuspensioner eller in vitro-aktiverade celler vid lämpliga tidpunkter efter aktiveringsceller överfördes till en 96-brunnsrunda bottenplatta, centrifugerades ner och tvättades med 200 ml PBS. Celler färgades med lämpliga koncentrationer av FC-receptorblock, fluoroforkonjugerade antikroppar och en fixerbar levande död färg i 40 ml PBS under 20 minuter vid 4C i mörker. Celler tvättades och kördes direkt på en Invitrogen Attune eller BD LSR Fortessa. För vissa experiment fixerades celler i 10 minuter i 100 ul 4 procent paraformaldehyd vid 4C i mörker före tvättning och återsuspension för analys eller återsuspenderades i saponinbaserad permbuffert för att färga intracellulära antigener.

Tetramerfärgning med reagens från NIH-tetrameranläggningen utfördes vid rumstemperatur under 30 minuter i FACs-buffert (PBS med 2 procent FCS och 0,04 procent natriumazid) före antikroppsfärgning.

För mitokondriell analys tvättades och färgades cellerna med Mitotracker Green (M7514, Thermofisher Scientific) och Mitotracker Deep Red (M22426, Thermofisher Scientific) vid 100 nM i kompletta medier (antingen järnbristmedium för serumjärnbristkultur eller RY200 för TH100 för att rekapitulera Y20H-kulturer) i 30 minuter vid 37C enligt tillverkarens instruktioner. Vi fann att MTDR-färgning var känslig för farmakologisk störning av mitokondriernas membranpotential med karbonylcyanid-p-trifluorometoxifenylhydrazon (FCCP) i överensstämmelse med publicerad litteratur.53 Förhållandet mellan MTDR och MTG beräknades för att indikera membranpotentialen normaliserad för volymen av mitokondrier. .

För detektion av intracellulära cytokiner ströks splenocyter ut med 2 miljoner celler/200ml i komplett media i en rundbottnad 96-brunnars platta med 0,1mg/ml SIINFEKL (OVA 257-264)( Vac-sin Invivogen) peptid för OVA-specifika svar, 0,5 mg/ml B8R-peptid för Vaccinia-specifika svar (AS-64688, Anaspec) eller 1ug/ml OVA (323-339), (Va-is, Invivogen) för att inducera OT-II-cytokinproduktion. Efter 30 minuter tillsattes 5 mg/ml Brefeldin A och cellerna odlades i ytterligare 4 timmar före yt-/intracellulär färgning för flödescytometri.

För detektering av MVA-specifika CD4-svar av ICS ströks BMDC dag 7 med 0,3 miljoner celler per brunn i en 96-brunnsplatta med 50ng/ml FLT3L. BMDC lämnades antingen ostimulerade, ospecifikt stimulerade med 0,5 mM CpG (ODN 1826) (Tlrl-1826, Invivogen), eller infekterades med MOI av 1 MVA-OVA över natten. Följande dag tvättades cellerna och 2 miljoner splenocyter från oimmuniserade eller MVA-immuniserade möss tillsattes. Efter 30 minuter tillsattes Brefeldin A till en slutlig koncentration av 5 mg/ml och cellerna odlades i ytterligare 4 timmar före yt-/intracellulär färgning för flödescytometri. Cytokine-utsöndrande CD4 T-celler definierades som CD154 plus cytokin plus (jämfört med ostimulerad CD4 på CpG-pulsade DCs eller CD4s från naiva möss).

Se tabellen med nyckelresurser för använda antikroppar.

Exempel på grindscheman för nyckelpopulationer visas i kompletterande metoder, figurerna 1–6. CD8 plus CD44 plus Tetramer plus CD8 T-celler (Supplementary Methods Figur 1A) och effekten av mini hepcidin på tetramer-positiva CD8s (Supplementary Methods Figur 1B). B220 plus IgD-CD95 plus groddcentrum B-celler (Supplementary Methods Figur 2A) och effekten av mini-hepcidin på germinal Center B-celler (Supplerande metoder Figur 2B). CD4 plus CD44 plus CXCR5 plus PD-1 plus T-follikulära hjälparceller (Supplementary Methods Figur 3A) och effekten av mini-hepcidin på T-follikulära hjälparceller (Supplementary Methods Figur 3B). CD138 plus IgD-plasmaceller (Supplementary Methods Figur 4A) och effekten av mini-hepcidin på plasma (Supplementary Methods Figur 4B). CD8 plus CD45.1 plus OT-I CD8s (Supplementary Methods Figur 5A) och effekten av mini hepcidin på OT-I effektorceller (Supplementary Methods Figur 5B). Gränsning av OT-I IFN-gamma-, TNF-alfa- eller IL-2-producerande CD8 T-celler genom ICS (Supplementary Methods Figur 6A) och effekt av mini-hepcidin på cytokinproducerande CD8 T-celler (Supplementary Methods Figur 6B).

Genuttrycksanalys genom kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)

RNA extraherades från leverexplantat eller lunglober som skördades till RNA senare (AM7020 Thermofisher Scientific) och snäppfrysta cellpellets med RNeasy plus-kitet (QIAGEN, 74136) och omvänt transkriberades till cDNA (Life Technologies, 4387quantitative för PCR 4387406 för PCR ) Biosystems 6500 Fast Real-Time PCR-systemmaskin som använder TaqMan-analyser som anges i tabellen med nyckelresurser. enligt tillverkarens protokoll. Genuttryck presenteras som 2^([CT av endogen kontrollgen] – [CT av genen av intresse]). Hprt har använt en endogen kontrollgen för lever- och lung-qRT-PCR. B2m användes som en kontrollgen för CD8 T-cellskulturer eftersom CT inte förändras under T-cellsaktivering.

Vävnads- och serumjärnmätningar

Vävnader torkades i 3 timmar vid 100C och den torra massan av vävnadsbiten mättes. Vävnadsbitar smältes i 10 procent triklorättiksyra/30 procent saltsyra under 20 timmar vid 65°C. Icke-hemjärninnehåll bestämdes genom reaktionen av den syranedbrutna vävnaden med kromogenreagens innehållande 0,1 procent (vikt/volym) badofenantrolindisulfonsyra (Sigma, 146617) och 0,8 procent tioglykolsyra (Sigma, 88652) som mäter absorptionen vid 5 och jämför 5 absorption. till en standardkurva av järn(III)ammoniumcitrat enligt beskrivning.54

För serumanalys av murina prover placerades upp till 400 ml blod erhållet genom hjärtpunktion i ett BD microtrainer SST-rör (Beckton Dickinson). Serum erhölls genom att snurra det koagulerade blodprovet centrifugerades vid 8,000 g i 5 minuter och lagrades vid 80C. Serumjärn kvantifierades med hjälp av Abbott Architect c16000 automatiserade analysator (Abbott Laboratories) och MULTIGENT Iron Kit vid Oxford John Radcliffe Hospital, Storbritannien.

Analys av smågrisstudie

Grisserumjärn mättes med hjälp av en automatiserad analys på en Abbott Architect c16000 automatiserad analysator (Abbott Laboratories) i Department of Clinical Biochemistry, OUHNHS. Serumprover testades för M. hyopneumoniae-antikroppar med användning av en kommersiell monoklonal blockerande ELISA (M. hyopneumoniae-detektionskit, Thermo Scientific Oxoid, UK, K004311) enligt tillverkarens instruktioner vid Biobest Laboratories Ltd, Edinburgh; provresultaten för optisk densitet (OD) korrigerades med användning av medel-OD för buffertkontrollbrunnar. Serumtitrar för neutraliserande antikroppar (agnostiska av isotyp) beräknades som en procentuell blockering av signalen härledd från bindningen av det definierade anti-M. hyopneumoniae HRP-konjugerad antikropp inkluderad i analysen. Resultat rapporterades som förbättring i procentuell blockering på dag 28 (14 dagar efter immunisering) i förhållande till dag 14 (dag för immunisering) för att detektera förbättring av antikroppssvar över ärvd maternell antikropp. Förbättring i procentblock=( procent block på dag 28) – ( ​​procent block på dag 14).

Murina anti-OVA IgG-titrar

Antikroppstitrar mot OVA-protein från immuniserade möss bestämdes med ELISA. Kortfattat belades plattorna med OVA-protein (InvivoGen Endofit, 50 ml/brunn vid 10 mg/ml) över natten. Spädningar av testsera (i tre exemplar) sattes till plattan. Plattorna tvättades 6 gånger med PBS-T (PBS, 0,05 procent Tween). För att detektera OVA-bindande IgG binder get-anti-mus sekundär Ab ett alkaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-mus-IgG (Sigma Aldrich A-3562), följt av ytterligare tvättning. OD405 efter tillsatsen av pNPP-substrat kvantifierades med användning av en ELx800 plattläsare (Bio-Tek). Spädningen vid vilken OD först låg under bakgrund plus 3 SD registrerades i AU som slutpunktstiter.

Mätningar av humana seraantikroppar hos IRIDA-patienter

Antikroppskoncentrationer (IgG) mot mässling, påssjuka, röda hund, Varicella, Ptx, FHA, PRN, Dtxd, Ttx, Hib och Streptococcus pneumoni serotyper 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F i sera från IRIDA-patienter med mutanta TMPRSS6-alleler och icke-järndefekta vildtyp-TMPRSS6-kontroller mättes vid National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven, Nederländerna. I inget fall var medelantikroppskoncentrationen signifikant högre hos TMPRSS6-patienter.

Histologi

För att utvärdera luftvägsinflammation fixerades lungprover med 4 procent paraformaldehyd i fosfatbuffert och bäddades in i paraffin vid HEMS kärnanläggning i i3S, Portugal. Efter avparaffinering med xylen och hydratisering genom passage genom en kvalitet av alkoholer, färgades 3 mm tjocka sektioner med hematoxylin-eosin. Histopatologiska poäng för lunginflammation tilldelades med hjälp av modifierade kriterier55 enligt följande: 0, normal, ingen inflammation; 1, minimala, sällsynta inflammationshärdar; 2, mildt, inflammatoriskt cellinfiltrat av det perivaskulära/peribronkiolära utrymmet med ingen eller knappt alveolär förlängning; 3, måttligt, inflammatoriskt cellinfiltrat av det perivaskulära/peribronkiolära utrymmet med måttlig förlängning in i det alveolära parenkymet; och 4, allvarligt, inflammatoriskt cellinfiltrat i det perivaskulära/peribronkiolära utrymmet med en större mängd inflammatoriska foci som finns i det alveolära parenkymet.

Neutrofil infiltration klassificerades som 0, utan tecken på polymorfonukleära leukocyter (PMN); 1, närvaro av dispergerat PMN; 2, frekvent PMN med fokal aggregation; 3, frekvent PMN med multifokal aggregering. Neutrofilinfiltration utvärderades ytterligare med kloroacetatesteras (Leder)-färgning, utförd vid Anatomic Pathology Service vid Centro Hospitalar de Sa˜ o Joa˜ o, Portugal. Orceinfärgning (utförd vid IPATIMUP Diagnostics, Portugal) användes för att utvärdera de elastiska fibrerna i alveolära septa och bedöma graden av förändring av den alveolära lungstrukturen associerad med närvaron av det inflammatoriska infiltratet. Sektioner poängsattes av två utredare, inklusive en utbildad patolog på ett förblindat sätt utan förkunskaper om behandlingsgrupperna. Medelpoängen beräknades och jämfördes mellan behandlingsgrupperna. Mjältsektioner bearbetades på liknande sätt, men färgades med Perls' preussian blue-reaktion för ferri-järn med användning av standardförfaranden.

ATP-produktionshastighet genom Seahorse metabolisk flödesanalys

ATP-produktionshastighet och det relativa bidraget från mitokondriell och glykolytisk metabolism till detta beräknades enligt tillverkarens protokoll med hjälp av Agilent Seahorse XF realtids-ATP-hastighetsanalyskit (103592-100) och ett Aligent XF96-instrument. I korthet skördades CD8 T-celler efter 48 timmars aktivering i media med den specificerade transferrinkoncentrationen, tvättades och återsuspenderades i Seahorse Assay Media (obuffrad RPMI pH 7,4 0 med 1 mM pyruvat, 2 mM L-glutamin och 10 mM glukos) och 150,000 viabla celler/brunn delades upp i en poly-D-lysinbelagd XF96-mikroplatta. Syreförbrukningshastigheter (OCR) och extracellulära försurningshastigheter (ECAR) mättes vid sekventiell tillsats av 1,5 mM Oligomycin och 0,5 mM Rotenon/Antimycin A.

ATP-kvantifiering genom luminescens

ATP-produktion mättes med användning av Cell Titer-Glo (Promega G7570) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet odlades CD8 T-celler enligt beskrivningen i "cellkultur" i 24 timmar (och analyserades därför innan celldelningen påbörjades), snurrades ner och återsuspenderades i 50 ml medium (järnfri för kulturer med järnbrist, normal RPMI med 10 procent FCS för TfrcY20H/Y20H-kulturer), överfördes till en vitväggig ogenomskinlig 96-brunnsplatta lämplig för luminescensmätningar och 50 ml Cell Titer-Glo tillsattes. Brunnar blandades och luminescens, proportionell mot ATP-innehåll, mättes på en Promega GloMax Luminometer.

KVANTIFIERING OCH STATISTISK ANALYS

Standard randomiseringsförfaranden användes för in vivo-experiment med möss av samma ålder och kön (experiment- och kontrollmöss valdes slumpmässigt bland kullkamrater). Utredarna var inte blinda för tilldelning under experiment och bedömningar. Det erforderliga antalet möss för varje experiment bestämdes från tillgången på uppfödda djur, kraftberäkningar, tidigare erfarenhet av att utföra experiment med samma stammar av möss och data från pilotexperiment. Statistiska analyser utfördes med Prism version 6 (GraphPad Software). Detaljer om specifika statistiska tester ges i figurförklaringar.

För antikroppskoncentrationer av TMPRSS6 IRIDA-patienter genomförde vi statistiska analyser med SPSS (IBM SPSS Statistics, version 22). Data kontrollerades med avseende på normalitet genom Smirnov-Kolmogorov-tester och genom visuell inspektion av histogramdiagram. Icke-normalfördelade data transformerades logaritmiskt för statistiska analyser. Vi definierade immunologiskt svar som skyddande när deltagarna hade anti-difteri serum IgG-koncentrationer R 0$1IU/ml,56 anti-tetanus IgG > 0.5IU/ml,57 anti-Hib IgG > 1. 0mg/ml,57 anti-PCV IgG R 0$35 mg/ml58 och anti-mässling IgG R 0$12IU/ml.59.

Det finns ingen skyddande serumkoncentration fastställd för anti-kikhosta IgG.57 För effekter mellan grupper användes oberoende prov t-tester eller oberoende prover icke-parametriska tester. Vi utförde en analys av kovarians (ANCOVA) för att bedöma effekten av grupp (IRIDA kontra kontroll) på serum-IgG-koncentrationer. Gruppen definierades som en fast effekt och vi lade sekventiellt till kända prediktorer för vaccinsvar: kön, ålder, Hb och TSAT som kovariater till modellerna. Vi utförde Pearson Chi-Square-testet och Fishers Exact-testet för att jämföra serokonversion mellan IRIDA- och kontrollgrupperna.

For more information:1950477648nn@gmail.com