Hur man förhindrar och minskar bildandet av njursten?

för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Del Ⅰ Ⅱ: Fosfatidylserin-eversion reglerad av fosfolipidskramblas aktiverad av TGF‑ 1/Smad-signalering i det tidiga skedet av njurstensbildning

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Introduktion

Urolithiasis är en av de vanligaste sjukdomarna som drabbar människor och är förknippad med flera urologiska komplikationer [1]. Kalciumoxalat (CaOx) skadar enligt uppgift odlade njurrörsceller, varefter cellmembranfosfatidylserin (PS) vänder från det inre lagret till det yttre lagret in vitro för att spela viktiga roller injurstenbildning [2]. Liknande fynd har rapporterats av olika studier [3-6]som utförts på cellnivå. Den mekanism som ligger bakom PS-externisering i njurtubuliceller orsakad av CaOx-medierad skada är dock fortfarande oklar. Tidigare studier har visat att en hög koncentration av kalciumoxalat leder till överproduktion av reaktiva syrearter (ROS)[7], vilket därefter bidrar till PS-externisering i njurtubuliceller för att resultera i kärnbildning och tillväxt av CaOx-kristaller [8]. ROS och lipidperoxidation aktiverar kraftigt fosfolipid-scramblas (PLSCR)[9], medan exponering för ROS-rensare, såsom glutation, koenzym Q10 eller idebenon (en syntetisk koenzym Q10-homolog), minskar aktiveringen av PLSCR vid polycystisk njursjukdom [10] . PLSCR, som är förankrat till cellmembranet [11], fungerar som ett av de tre fosfolipid-flipping enzymer som kan katalysera den snabba tvåvägsrörelsen av PS på båda sidor av membranet längs en koncentrationsgradient [12]. Under fysiologiska förhållanden är cellmembranet i ett asymmetriskt tillstånd och PLSCR har ingen effekt på membranet [13]. Men efter skadan av eukaryota celler, aktiveras PLSCR och flyttar PS från det inre till det yttre lagret[14,15]. Dessutom stimulerar överuttryck av PLSCRin kinesisk hamsteräggstock K1-celler enligt uppgift PS-externisering, vilket förbättrar den utåtriktade rörelsen av PS till cellytan under apoptos [16]. Därför antog vi att PLSCR också är involverad i PS-externisering i njurtubulicellmembranet via aktivering av ROS.

En potentiell molekylär mekanism för oxalatinducerad ROS-produktion sker genom induktion av TGF- 1/Smad-signalering, vilket kan spela en roll i produktionen av ROS [17,18]. TGF- 1/Smad-signalering rapporteras faktiskt vara involverad i en mängd njursjukdomar, såsom glomerulonefrit, njurinterstitiell fibros och nefrolitiasis[19]. Dessutom uppvisar mononukleära celler behandlade med TGF - 1 PSexternalisering i cellmembranet genom att orsaka vändning av PS från det inre till det yttre lagret [20]. Såvitt vi vet är förhållandet mellan TGF- 1/Smad-signalering och PSeversion i njurtubulicellmembran fortfarande okänt. Vi antog att TGF- 1 deltar i PS-eversion i njurtubulicellmembran genom att aktivera PLSCR i det tidiga stadiet av råttanjurstenbildning förmedlad av ROS.

Därför undersökte vi om TGF- 1/Smad-signalering stimulerar PS-externisering genom ROS-aktivering och om TGF aktiverar PLSCR i njurtubuluscellmembranet under det tidiga skedet avnjurstenutveckling in vitro och in vivo, och lägger därigenom en teoretisk grund för etiologin avnjurstenbildning.

Klicka till Cistanche DHT för njursjukdom

Material och metoder

Råttmodell av CaOx-njurstensbildning i tidigt skede

Sextio rena 3-månader gamla Wistar-hanråttor som vägde 200±20 g tillhandahölls av Experimental Animal Center vid Harbin Medical University och hölls i rumstemperatur (22 grader ±2 grader) och 50-70 procent luftfuktighet. Efter 3 dagars adaptiv avel delades de slumpmässigt in i tre grupper (20 råttor/grupp) - kontroll,njursten, ochnjurstenplus SB431542 (en TGF- 1/Smad signalvägshämmare).

Njurstenbildning initieras som en tidig patologisk förändring efter njurtubulär cellskada [21,22]. För att studera denna process av skada, en råttmodell av tidigt stadiumnjurstenbildning etablerades, eftersom ett standardiserat tillvägagångssätt ännu inte har rapporterats. För att observera de tidiga förändringarna efter njurrörscellskada tillämpade vi metoden som rapporterats av Liet al. [23]. Kortfattat administrerades råttorna i kontrollgruppen 2 ml destillerat vatten dagligen via oral sondmatning, medan råttorna injurstengruppen administrerades 2 ml 1 procent etylenglykollösning och 1 procent NHCl-lösning dagligen via oral sondmatning. Råttorna injurstenplus SB431542-gruppen injicerades intraperitonealt med SB431542-samlösningsmedel (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, Kina) var 7:e dag [24]. Mat och vatten tillhandahölls ad libitum. På dag 14 avlivades råttorna genom överdos av bedövningsmedel (pentobarbitalnatrium, 200 mg/kg, via intraperitoneal injektion) och deras njurar skars ut. De vänstra njurarna bevarades omedelbart i flytande kväve för efterföljande proteindetektering. De högra njurarna fixerades och dehydrerades sedan och bäddades in i paraffinvax. Alla djurstudier utfördes enligt National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De experimentella procedurerna godkändes av djurexperimentanvändningsetiska kommittén vid det första anslutna sjukhuset vid Harbin Medical University (godkännandenummer: 2020005, Harbin, Kina).

Kristallbildning i njurvävnad

Vävnadsproverna färgades med Pizzolato-metoden [23] och CaOx-kristaller observerades under ett optiskt mikroskop med polariserat ljus (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Kina). Pizzolato-positiva regioner mättes och uttrycktes som permillålder av den totala vävnadsarean av tvärsnitt med hjälp av ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, USA).

Detektion av PS i njurens tubulära cellmembran in vivo genom flödescytometri

Exponering för PS av njurepitelceller utvärderades med en fluoresceinisotiocyanat (FITC)-märkt Annexin V-färgningsanalys, som tidigare beskrivits [2]. Cellerna observerades (i varje grupp) under ett konfokalt lasermikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Mängden PS-externisering bestämdes som procentandelen Annexin V-positiva celler. Annexin V-fluorescens av proverna mättes med användning av en flödescytometer (488 nm excitation/530 nm emission; Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Mätning av TGF- 1- och Smad7-nivåer i det tubulära njurcellmembranet genom western blotting

Efter återvinning av de frusna vävnadsproverna extraherades proteinet med hjälp av det naturliga membranproteinextraktionssatsen ProteoExtract(M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA), och proteinkoncentrationen bestämdes med hjälp av en Bio-Rad proteinanalys kit (Hercules, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Därefter laddades 40ug protein på en 8-procentig SDS-polyakrylamidgel (staplingsgel 100 V, upplösningsgel 200 V) under 1 timme vid en elektrodkonstant ström på 300mA. Proteinerna i gelén överfördes till ett nitrocellulosamembran (Kexing Co., Beijing, Kina), blockerades i 1 timme vid 37 grader i 5 procent skummjölkspulver och inkuberades över natten vid 4 grader C med får-anti-rått-TGF 1 ( ab208466; Abcam, Cambridge, Storbritannien) och Smad7 (66 478; Proteintech, Wuhan, Kina) antikroppar [25]. Pepparrotsperoxidas-märkt kanin-anti-får sekundär antikropp tillsattes (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Peking, Kina) och inkuberades vid 37 grader i 1 timme. Signalen detekterades med användning av det förbättrade kemiluminescensreagenset (Abcam). Positiva band analyserades med hjälp av Gel-Pro 4.0 geloptisk densitetsanalysprogramvara, och den kumulativa optiska densiteten (IOD-värdet) mättes, med R-värdet som representerar det relativa proteininnehållet enligt följande: R=referens-IOD-värde för PLSCR(mål)/referens IOD-värde för GAPDH (referensprotein).

Cellkultur och RNA-interferens

En njurepitelcellinje (MDCK-celler, CCL34, passager 53-90; ATCC, Manassas, VA, USA) odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium kompletterat med antibiotika (10{{1{14} }}} U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) och 10 procent fetalt nötkreatursserum (Life Technologies Co.) vid 37 grader i en atmosfär av 5 procent CO och subkultur med 0,25 procent trypsin och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (Life Technologies Co., CA, USA). Cellerna behandlades med CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 2 timmar och med 0,5 mM CaOx och 100 ug/mL neutraliserande anti-TGF- 1 antikropp (R&D Systems, Minneapolis) , MN, USA) i 2 timmar. Alla experiment utfördes i tre exemplar.

För att bestämma rollen för PLSCRin PS eversion transfekterades renala tubulära epitelceller med PLSCR siRNA [26]. siRNA designades och syntetiserades av Anhui General Biological System (Anhui, Kina; se tabell 1). LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina) användes för transfektion enligt tillverkarens instruktioner . Efter 24 timmars transfektion digererades cellerna med trypsin, centrifugerades vid 1000 xg i 5 minuter, tvättades två gånger med PBS och centrifugerades igen. Supernatanten kasserades och pelleten suspenderades i PBS för att bilda en encellssuspension med densitet 1 x 10 graders celler/ml. Den positiva hastigheten för FAM(karboxifluorescein)-uttryck var 93 procent ±5 procent, bestämt med flödescytometri. För att ytterligare bedöma sambandet mellan TGF 1 och PLSCR, behandlades cellerna med 0,5 mM CaOx eller 10 ng/ml TGF- 1 under 2 timmar och transfekterades därefter med PLSCR siRNA.

Mätning av PLSCR-nivå i njurrörformiga cellmembran genom western blotting

Protein extraherades med användning av ett naturligt membranproteinextraktionskit ProteoExtract (Chemical Book Co., Beijing, Kina), och proteinkoncentrationen bestämdes med användning av ett Bio-Rad proteinanalyskit (Noble-Ryder Co., Peking, Kina). Därefter laddades 40 ug protein på en 8-procentig SDS-polyakrylamidgel (staplingsgel 100 V, upplösningsgel 200 V) under 1 timme vid en konstant ström på 300 mA. Proteiner i gelén överfördes till ett nitrocellulosamembran (Kexing Co., Shenzhen, Kina) och blockerades med 5 procent skummjölk i 1 timme vid 37°C och inkuberades över natten vid 4 grader med får-anti-rått-PLSCR monoklonal antikropp (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, Kina). Pepparrotsperoxidas-märkt kanin-anti-får sekundär antikropp tillsattes sedan (1:400) och blandningen inkuberades vid 37 grader C i 1 timme. Efter tvättning av membranet detekterades signalen med ett förstärkt kemiluminescensreagens (Abcam, Guang-zhou, Kina). Positiva band analyserades med användning av Gel-Pro 4.0gel optisk densitetsanalysmjukvara, och IOD-värdet mättes, med R-värdet representerande det relativa proteininnehållet som beskrivits ovan.

Tabell 1 siRNA-sekvenser för PLSCR

Mätning av membranfosfatidylserinfördelning

Mängden cellmembran PS-eversion bestämdes med användning av fluorescenssläckningsmetoden som beskrivs av Kim et al.[27] och vårt forskarteam [2], med nitrobensen-2-oxa-1,3-diazol (NBD, Shanghai, Kina) som fluorescensprob. Efter märkning av PS i det yttre skiktet av cellmembranet med NBD, odlades cellerna i PBS innehållande 5 mM diisopropylfluorfosfat. Därefter tillsattes PBS innehållande kalciumoxalat(1.0 mM) och cellerna inkuberades vid 37 grader. En lika stor mängd cellsuspension tömdes ut var 10:e minut och fluorescensintensiteten registrerades med en RF-5000-spektrofluorometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). Inställningarna för spektrofluorometern var som följer: 10 nm slitsbredd för en emissionsvåglängd av 530 nm; och 5 nm slitsbredd för en excitationsvåglängd på 470 nm. Därefter registrerades det genomsnittliga fluorescensvärdet (FT) under 50-talet. Den genomsnittliga reducerade fluorescensintensiteten (FD) registrerades också efter användning av en ditionitlösning för att släcka NBD-fluorescensen från det yttre lagret av cellen. Därefter tillsattes 1 procent (vikt/volym) Triton X-100 för att permeabilisera cellmembranet. NBD-fluorescensen från det inre lagret av cellmembranet släcktes sedan och fluorescensintensiteten (FO) registrerades. Procentandelen NBD-PS i de inre lobulerna beräknades senare med följande ekvation: procentandel av internaliserad NBD-PS=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Procentandelen av PS-externisering bestämdes enligt principen som användes för mätning av NBD-PS-internalisering. Procentandelen NBD-PS i de yttre lobulerna beräknades också med hjälp av följande ekvation: procentandelen NBD-PS i yttre lobulerna =100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Statistisk analys

Kontinuerliga variabler uttrycks som medel±standardavvikelse. Ett icke-parametriskt parat rangsummetest, t-test och chi-kvadrattest användes. Alla analyser utfördes med SPSS-programvara 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Resultat med P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Resultat

TGF- 1/Smad-signalering stimulerar PS-externisering in vivo

Kristallbildning i njurvävnad av råttmodell

Att etablera en råttmodell av tidigt stadiumnjurstenbildning, etylenglykol och ammoniumklorid administrerades till magen på råttor under 2 veckor, och sedan undersöktes varje njursektion med ett digitalt mikroskop. I kontrollgruppens prover observerades normala tubulära njurstrukturer utan kristallbildning på dag 14 (Fig. 1A). När njurvävnaden frånnjurstengruppen observerades genom mikroskopi, njurtubuli verkade vidgade med synliga mikrokristaller; tillfällig ackumulering av CaOx-kristaller observerades i vissa njurtubuli, vilket indikerar framgångsrik etablering av en råttmodell i tidigt stadiumnjurstenbildning och generering av njurtubulicellskada.

Förekomst av PS i njurens tubulära cellmembran

Annexin V-FITC, en fluorescerande molekyl som binder till PS på cellytan, används ofta för att detektera PS-omfördelning. I vår studie, MDCK-celler i den normala kontrollen,njursten, ochnjurstenplus SB431542-grupper observerades under ett konfokalt lasermikroskop (Fig. 1B). PS-eversionshastigheten ökade injurstengrupp jämfört med kontrollgruppen (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">njurstenplus SB431542-gruppen visade en lägre basal nivå av PS-externalisering än de injurestengrupp (P<0.05, fig.="" 1c,="">

Mätning av TGF- 1- och Smad7-nivåer

TGF- 1-nivån injurstengrupp kvantifierades genom western blotting. En typisk westernblot visas i Fig.2A tillsammans med densitometriska analysen av TGF- 1-nivån. Värden normaliserades till kontrollen och uttrycktes som förhållandet mellan TGF- 1 och tubulin. Tillsatsen av etylenglykol och NH Cl ökade signifikant TGF- 1-nivån och minskade Smad7-nivån jämfört med de i kontrollcellerna (Fig.2A); emellertid, behandling med SB431542 plus etylenglykol och NH kallades för att signifikant minska TGF- 1-nivån och ökade Smad7-nivån jämfört med de i celler behandlade med etylenglykol och NH, Cl.

TGF aktiverar PLSCR-aktivitet i njurtubulicellmembranet in vitro

PLSCR

Nivån av PLSCR utvärderades genom western blotting. Cellerna behandlades med CaOx i 2 timmar. PLSCR-nivån var försumbar i kontrollceller men ökade signifikant i CaOx-gruppen (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Nedsatt NBD-PS rörelse inåt

Vi bestämde inåt- och utåtriktade rörelser av PS i det renala tubulära epitelcellmembranet för att utvärdera PLSCR-aktiviteten. För att bedöma om PLSCR påverkar rörelsen av PS från den yttre broschyren till den inre broschyren av plasmamembranet, integrerade vi fluorescensmärkt PS (NBD-PS) i den yttre broschyren av plasmamembranet och övervakade dess internalisering (Fig. 3). Mängden NBD-PS internaliserad av MDCK-celler i kontroll- och CaOx-grupperna var cirka 46,2 procent respektive 17,8 procent. Därför var hastigheten för PS-internalisering i CaOx-gruppcellerna signifikant lägre än i kontrollgruppsceller (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Fig. 1 Kristallbildning och PS-externisering observerades i kontroll-, njurstens- och njurstens- plus SB431542-grupperna.

(A) Kristallbildning i njurvävnaden på dag 14; pil indikerar mikrokristallina strukturer. (B) MDCK-celler observerades med konfokal lasermikroskopi.

(C) Flödescytometriska plotter av eversionshastighet. (D) Eversionsfrekvens ( procent ). Triangel indikerar P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">njurstengrupp

Förbättrad NBD-PS utåtgående rörelse

För att bestämma huruvida PS utåttransport påverkas av oxalat, märktes MDCK-celler intracellulärt med NBD-PS, och omfattningen av dess rörelse till exemplen-mic-broschyren bestämdes. Inkubationsmediet innehöll bovint serumalbumin (1 % vikt/volym), som snabbt extraherade ytuttryckt NBD-PS. Ungefär 34,5 procent av NBD-PS migrerade till den yttre broschyren i kontrollceller, medan hastigheten för utåtgående PS-överföring i CaOx-gruppcellerna ökade till 75,3 procent jämfört med den för den totala inre märkta NBD-PS, som var signifikant högre än det i kontrollgruppscellerna (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Fig.2 TGF- 1/Smad-uttryck i kontrollen, njursten och njursten plus SB431542-grupper och PLSCR-uttryck i njurtubuluscellmembranet.

(A)TGF- 1/Smad uttryck. (B) Relativa fosfolipid scramblas (PLSCR) nivåer och representativ blöt med uttryck normaliserat till det för GAPDH.P<>

Triangel indikerar P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

KLICKA HÄR FÖR ATT DELA Ⅱ