Kontakta: emily.li@wecistanche.com

Klinisk effekt och transkriptomisk analys av Kongrong Shujing-granulat (苁蓉舒痉颗粒) hos patienter med Parkinsons sjukdom i Shen (njure) essensbristsyndrom

CHEN Shi-ya1, XIAO Shao-jian1, LIN You-ning1, LI Xi-yu1, XU Qian2,

YANG Sha-sha2, HUANG Lian-hong3,4 och CAI Jing1,2

ABSTRAKTMål: Att utvärdera den kliniska effekten och säkerheten avCongrong Shujing granulat(苁蓉舒痉颗粒, CSG) vid behandling av patienter medParkinsons sjukdom(PD) och kinesisk medicin (CM) syndrom av Shen (Njure) essensbrist och att undersöka den potentiella mekanismen som involverar effekt genom en transkriptomsekvenseringsmetod. Metoder: Berättigade PD-patienter med syndromet shenessensbrist tilldelades slumpmässigt till en behandlingsgrupp eller en kontrollgrupp med en slumptalstabell och behandlades med CSG i kombination med västerländsk medicin (WM) respektive placebo i kombination med WM. Båda behandlingskurserna varade i 12 veckor. Det enadeParkinsons sjukdomRating Scale (UPDRS) poäng, PD Question-39 (PDQ-39) poäng, CM Syndrome Scale poäng och läkemedelsanvändning av alla patienter utvärderades före och efter behandlingen. Säkerheten utvärderades genom kliniska laboratorietester och elektrokardiografer. Blodprover från 6 patienter i varje grupp samlades in före och efter försöket och användes för transkriptomisk analys genom genontologianalys och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway Analysis. Differentiellt uttryckta gener validerades med användning av omvänd transkription-polymeraskedjereaktion. Resultat: Totalt 86 PD-patienter valdes ut från det tredje anslutna folksjukhuset vid Fujian University of Traditional Chinese Medicine mellan januari 2017 och december 2017. Slutligen slutförde 72 patienter studien, varav 35 i behandlingsgruppen och 37 i kontrollgruppen. Jämfört med kontrollgruppen efter behandling visade patienterna i behandlingsgruppen signifikanta minskningar av UPDRS sub-II. poäng, PDQ-39-poäng, CM-syndrompoäng och Levodopa-ekvivalent dos (P<0.05). during="" the="" treatment="" course,="" no="" significant="" changes="" were="" observed="" in="" safety="" indicators="" between="" the="" two="" groups="" (p="">0,05). En möjlig mekanism för klinisk effekt föreslogs som involverade reglering av cellmetabolismrelaterade processer och ribosomrelaterade vägar. Behandling med CSG hade visat sig påverka relevanta genlodier för PD, inklusive AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, BCL2L11, FTH1P2, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7, TGFBR1, WIPF2 och COX7B. Slutsatser: CSG i kombination med WM kan användas för att behandla PD-patienter med CM-syndrom av Shen-essensbrist med god säkerhet. Den möjliga verkningsmekanismen och relevanta genlokaliseringar föreslogs. (Registreringsnr. ChiCTR-IOR-16008394)

NYCKELORD Congrong Shujing granulat,Parkinsons sjukdom, randomiserad kontrollerad studie, RNA-sekvensering, transkriptomik, kinesisk medicin

Parkinsons sjukdom(PD) är en neurodegenerativ sjukdom som förekommer hos både medelålders och äldre befolkningar. Dess utbredning, sjuklighet och tillhörande ekonomiska börda har stadigt ökat. I den allmänna befolkningen är den uppskattade förekomsten av PDn i industriländerna 0,3%. År 2030 förväntas antalet patienter med PD uppgå till 4 940 000 i Kina och 8 670 000 över hela världen. Den relativa risken för dödsfall hos patienter med PD är ungefär dubbelt så hög jämfört med den totala befolkningen. Nuvarande behandlingsregimer kan emellertid inte hindra utvecklingen av tillståndet. Med sjukdomsprogression minskar den kliniska effektiviteten av medicineringsregimen ofta, och daglig funktion och socialt deltagande äventyras avsevärt.) Således medför långvarig vård av PD-patienter en betydande ekonomisk börda för individer, familjer och samhälle.

Levodopa, "guldstandarden" för PD-behandling, är i allmänhet effektiv i 3-5 år. Därefter upplever patienter ofta allvarliga motoriska komplikationer, inklusive dosfenomen, morgonstyvhet, frysning och dyskinesi. Behandling av PD medKinesiska läkemedel(CM) kan förbättra patienternas kliniska symtom och motsvarande biverkningar och därigenom förbättra PD-patienternas livskvalitet.

Kongrongjing granulat(苁蓉精颗粒, CRJ) består huvudsakligen avHerba Cistanchesoch Polygonatum sibiricum, som härrör från det berömda klassiska CM-receptet Dihuang Decoction (地黄饮子) som användes för behandling av PD. I våra tidigare experimentella studier bekräftades de positiva effekterna av CRJ. Uppgifterna visade att Polygonatum sibiricum ochHerba Cistanches, huvudkomponenten i CRJ, förbättrade uttrycket av dopamin, minskade innehållet i relaterade apoptosfaktorer (caspase-3, FasL), ökade uttrycken av neurotrofa faktorer och minskade apoptos av dopaminerga nervceller. Studien visade också att CRJ skyddade dopaminerga nervceller genom att reglera apoptos och glialcell-härledd neurotrofisk faktor. Alla dessa som nämns ovan föreslog att CRJ var ett säkert och värdefullt terapeutiskt läkemedel för behandling av PD.

Baserat på vår kliniska erfarenhet och experimentella forskning modifierades CRJ genom att lägga till Radix Paeoniae Rubra, Cortex Moutan och Salvia miltiorrhiza Bge., såledesCongrong Shujing granulat(苁蓉舒痉颗粒, CSG) komponerades. Denna studie observerade den kliniska effekten av CSG vid behandling av PD-patienter med CM-syndrom av Shen (njure) essensbrist och de genetiska förändringarna i perifert blod-mRNA hos patienter. För att undersöka den underliggande verkningsmekanismen för CSG vid behandling av PD användes en RNA-sekvenseringsmetod (RNA-seq) för att omfattande analysera patienternas gentranskript före och efter försöket och för att identifiera och validera differentiellt uttryckta gener (DEG).

METODER

Diagnostiska kriterier

De diagnostiska kriterierna för västerländsk medicin (WM) hänvisade till de senaste diagnostiska standarderna för PD som publicerades av International Parkinson and Movement Disorder Society 2015. CM-diagnostiska kriterier för Shen essence deficiency syndrome hänvisade till de relaterade standarderna som publicerades av China Press of Traditional Chinese Medicine.

Kriterier för inkludering och uteslutning

Patienter som uppfyllde ovanstående WM-diagnostiska kriterier samt CM-syndromets differentieringskriterier för Shen-essensbrist, 50–80 år gamla, hade en Hoehn-Yahr (H-Y) iscensättningsskala på 4 och undertecknade skriftliga informerade samtycken inkluderades i studien. Patienter som diagnostiserades med stora sjukdomar, inklusive svår organdysfunktion, psykiska eller neurologiska sjukdomar, allvarliga infektioner, tumörer, encefalit eller allergisk konstitution, fick CM-behandling för PD inom 3 månader eller deltog i andra kliniska prövningar under de senaste 3 månaderna uteslöts.

Kriterier för avhopp och uppsägning

Patienter som frivilligt drog sig ur studien eller inte kontaktades betraktades som avhoppare. Patienter som upplevde allvarliga biverkningar eller plötsliga allvarliga sjukdomar och komplikationer och som inte kunde fortsätta studien, hade dålig överensstämmelse med försökspersonerna, fick mindre än 80% eller mer än 120% av de angivna behandlingsdoserna, bröt mot prövningsprotokollen, tillhandahöll ofullständig information som påverkade utvärderingen av effekten uteslöts från studien.

Deltagare

Berättigade PD-öppenvårdspatienter och inpatienter från det tredje anslutna folksjukhuset vid Fujian University of Traditional Chinese Medicine var inskrivna. Experimentplanen, informerat samtycke och fallrapportformulär fick skriftligt godkännande från den medicinska etikkommittén vid det tredje anslutna folksjukhuset vid Fujian University of Traditional Chinese Medicine (nr 2017KS-6-1) och registrerades vid det kinesiska kliniska prövningsregistret (registreringsnr. ChiCTR-IOR-16008394).

Uppskattning av provstorlek

Provstorleken beräknades baserat på de data som presenterades i den tidigare studien, och provet • 414 • Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419 storleksuppskattningsmetod fastställdes av China Clinical Trials Statistical Working Group. Med hjälp av provinnehållsdesignformeln för en helt randomiserad design och med tanke på en avhoppsfrekvens på 20%, bestämdes det att behandlingsgruppen och kontrollgruppen skulle omfatta 43 försökspersoner.

Randomisering, allokeringsdöljande och blindning

I denna studie användes en helt randomiserad dubbelblindad metod. SPSS-programvara användes för att slumpmässigt tilldela ämnen till de två grupperna och för att generera en slumpmässig numrerad tabell. Apotekare dispenserade läkemedel enligt tabellen. Ämnen, läkare och granskare var alla blinda för tilldelning av ämnen och droger.

Droger

Varje dos av CSG bestod av extraktivet avHerba Cistanches6 g, Polygonatum sibiricum 12 g, Salvia miltiorrhiza Bge. 15 g, Radix Paeoniae rubra 12 g och Cortex Moutan 10 g. Placebo består av 5% Radix Bupleuri med stärkelse, dextrin, etc. Dess utseende, lukt och smak liknar CSG: s. Både CSG (batch nr 16004691) och placebo (sats nr 16004728) tillhandahölls av Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Peking, Kina) och distribuerades av apoteksavdelningen vid det tredje anslutna folksjukhuset vid Fujian University of Traditional Chinese Medicine.

Behandling

Försökspersonerna i behandlingsgruppen behandlades med WM i kombination med CSG, medan försökspersonerna i kontrollgruppen behandlades med WM i kombination med placebo. VM valdes ut enligt riktlinjen. Bland dem var de vanligaste drogerna Madopar (sats nr. H10930198, Shanghai Roche Pharmaceutical Co. Ltd., Kina) och Sifrol (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH, Tyskland). Enligt den angivna riktlinjen skulle primärläkare under behandlingen justera läkemedelsdosen baserat på patientens tillstånd. Varje dos av CSG och placebo delades upp i två lika stora förpackningar, som togs 0,5 timmar efter frukost respektive middag, under 12 på varandra följande veckor.

Utfallsmått

För utfallsmått, inklusive bedömningsskalor för läkemedelsanvändning och relaterade index, utvärderades försökspersoner från båda grupperna av utbildade läkare både före studien och 3 månader efter administrering av den initiala dosen.

Primära utfallsmått

Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) bestod av poäng av I. (mentalt beteende, aktivt beteende och känslor), II. (dagliga livsaktiviteter), III. (motorisk undersökning) och IV. (motoriska komplikationer). Ju högre poäng, desto allvarligare är tillståndet.

Sekundära utfallsmått

De sekundära utfallsmåtten inkluderadeParkinsons sjukdomFråga-39 (PDQ-39) poäng, (21) CM Syndrome Scale score och droganvändning av WM. PDQ-39 utvärderar kvaliteten på det dagliga livet för PD-patienter genom att poängsätta deras handlingar, känslor, dagliga liv och socialt stöd. CM Syndrome Scale poängsätter de relaterade CM-syndromen hos PD-patienter, för att utvärdera svårighetsgraden av sjukdomen (bilaga 1). Dosen av WM beräknades som Levodopa ekvivalent dos (LED). För läkemedel relaterade till behandling av PD och dess komplikationer som inte ingick i LED-formeln (dvs. benshexolhydroklorid) gjordes motsvarande anmärkningar.

Säkerhetsutvärdering

De kliniska laboratorietesterna inklusive 3 huvudsakliga rutiner (blod/urin/avföring), leverfunktion (aspartattransaminas (AST) och alaninaminotransferas (ALT)) och njurfunktion (blodureakväve (BUN) och serumkreatinin (Cr)) samt elektrokardiograf (EKG) hos patienter utvärderades före och efter studien. Eventuella biverkningar registrerades med detaljer om tidpunkt, svårighetsgrad, symtom, varaktighet, vidtagna åtgärder och resultat.

Statistisk analys

SPSS version 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) användes för statistisk analys. Normalt fördelade mätdata uttrycktes som medelvärdet ± standardavvikelse (x–± s), medan icke-normalt fördelade data uttrycktes som median- och interkvartilintervallet. Räkningar uttrycktes som absoluta tal och priser. Vid jämförelse av mätdata mellan grupper tillämpades t-testet med två prover om data/transformerade data följde en normalfördelning. I andra fall tillämpades testet med två prov rangsumma. Vid jämförelse av mätdata före och efter försöket tillämpades ett t-test med parat prov om data/transformerade data följde en normalfördelning, medan det parade provrankningssummetestet tillämpades. För jämförelse av räkningsdata användes Chi-kvadrattestet. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Transkriptomsekvenseringsexperiment

RNA-seq Blodprover från 6 patienter i varje grupp valdes slumpmässigt före och efter studien, och RNA extraherades, renades och utvärderades. För att slutföra sekvenseringsprovbibliotekets konstruktion genomgick totalt RNA rRNA-avlägsnande, fragmentering, första strängens cDNA-syntes, andra strängens cDNA-syntes, terminalreparation, tillsats av A vid 3 '-terminalen, foganslutning och anrikning. Det konstruerade biblioteket validerades av Qubit® 2.0 Fluorometer och Agilent 2100. Sekvensering utfördes efter validering av biblioteket.

Bioinformatik analys

För bioinformatikanalys renades de råa läsningarna härledda från sekvenseringsanalys först för att erhålla högkvalitativa och rena läsningar. Därefter användes en skarvningsmappningsalgoritm för His at 2 (version 2.04) för genomkartläggning av de rena läsningarna. Antalet läsningar konverterades till fragment per kilobas av exonmodell per miljon (FPKM) mappade läsningar med Hjälp av Stringtie (version 1.3.0) och det trimmade medelvärdet av M-värdemetoder för att standardisera genuttryck. Därefter beräknades vikförändringen i differentiellt genuttryck från FPKM. Gener med ett q-värde 0,05 och foldchange 2 betraktades som DEG. Till DEG från motsvarande grupp med klinisk effekt, genontologi (GO) funktionsanrikningsanalys och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway

anrikningsanalys tillämpades. Efter justering av variationskriterierna valdes DEG: erna för varje grupp före och efter försöket, vilket var effektgenlokisen förCistanche deserticolaextrakt. Utvalda gener validerades ytterligare genom omvänd transkriptionpolymeraskedjereaktion (RT-PCR).

RESULTAT

Villkor för slutförande av provperiod

Totalt 86 PD-patienter valdes ut från det tredje anslutna folksjukhuset vid Fujian University of Traditional Chinese Medicine mellan januari 2017 och december 2017, 43 patienter i varje grupp. Slutligen slutförde 72 patienter studien enligt protokollet, inklusive 35 i behandlingsgruppen och 37 i kontrollgruppen. Studiens flödesschema presenteras i figur 1. Mellan grupperna observerades ingen statistiskt signifikant skillnad i ålder, sjukdomsstadium och H-Y-stadium (P>0,05, tabell 1).

Jämförelse av UPDRS-poäng mellan de två grupperna

Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de två grupperna före behandling i UPDRS totalpoäng och underavsnittspoäng (P>0,05). Jämfört med poängen före behandling minskade UPDRS totalpoäng och sub-II. poäng signifikant i behandlingsgruppen efter behandling (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" updrs="" sub-ⅱ="" score="" was="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05). however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" updrs="" total="" score="" between="" the="" two="" groups="" after="" treatment="" (p="">0.05, tabell 2).

Jämförelse av PDQ-39-poäng, CM-syndrompoäng och droganvändning mellan de två grupperna

Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de två grupperna före behandling i PDQ-39-poäng, CM-syndrompoäng och läkemedelsdosering (P>0.05). Jämfört med före behandling minskade PDQ-39-poängen, CM-syndrompoängen och LED signifikant i behandlingsgruppen efter behandling (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" pdq-39="" score,="" cm="" symptom="" score="" and="" led="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05, table="">

Säkerhetsutvärdering

Under studien observerades 2 fall i behandlingsgruppen med biverkningar. Båda biverkningarna var lätta i grad och inträffade på dag 4 efter försökets start, med symtom på inre värme, törstig och torrhetsvärme. En av dem var inte villig att fortsätta rättegången och hoppade av. En vecka efter avslutad CM-granulat minskade symtomen och försvann sedan. När det gäller det andra ämnet, efter att Paeoniae Rubra och Salvia Miltiorrhiza tillsattes till CSG: erna, minskade symtomen efter 4 dagar och försvann. Inga förändringar observerades i de kliniska laboratorietesterna och EKG som var direkt relaterade till prövningen. Dessutom observerades inga statistiskt signifikanta skillnader mellan de två grupperna i något av indexen före och efter studien (P>0,05).

Jämförelse av genomet

Av de sex proverna i varje grupp var intervallet för antalet läsningar i referensgenen 74452867–117774869. Kartläggningsförhållandena för provtranskriptomsekvenserna var 87,30%-96,14%.

Funktionell analys av DEGs GO-analys av DEG: er
DEG i behandlingsgruppen före och efter studien grupperades i 47 funktionella kluster (figur 2). Dessutom grupperades DEG mellan behandlingsgruppen och kontrollgruppen efter studien i 35 funktionella kluster (figur 3). DEG: erna var huvudsakligen relaterade till cellreglering och metabolismprocesser.

KEGG-anrikningsanalys av DEG
Pathway enrichment analysis med hjälp av KEGG:s offentliga databas över DEG för motsvarande grupp med klinisk statistisk signifikans av P<0.05 of="" the="" efficacy="" evaluation="" indices="" above="" suggested="" that pd-related="" degs="" were="" likely="" to="" be="" enriched="" in="" the="" following="" 4="" signaling="" pathways:="" (1)="" ribosome-related signaling="" pathways,="" (2)="" endocytosis-related="" signaling="" pathways,="" (3)="" foxo="" signaling="" pathways,="" and="" (4)="" were="" identified.="" moreover,="" 1="" up-regulated="" gene="" and="" 12="" down-regulated="" genes="" were="" identified="" in="" the="" control="" group.="" according="" to="" the="" quantitative="" analysis="" of="" degs,="" 13="" highly="" degs="" related="" to="" csgs="" had="" an="" effect="" in="" the="" pd="" patients="" screened,="" including="" aida,="" ankrd36bp2,="" bcl2a1,="" bcl2l11,="" fth1p2,="" gch1,="" hprt1,="" nfe2l2,="" rmrp,="" rps7,="" tgfbr1,="" wipf2,="" and="">

RT-PCR-analys
Generna som nämns ovan validerades med hjälp av RT-PCR-analys. Bland dem var AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7 och COX7B uppreglerade gener, medan TGFBR1 var nedreglerad (bilaga 3). Dessutom fanns det ingen signifikant skillnad i förändringen av de andra tre generna.

DISKUSSION

Totalt 95% av PD-patienterna är mellan 40 och 70 år gamla. Åldern vid debut är oftast runt 50 år och incidensen ökar med åldern. I tidigare studier föreslogs att aktiva ingredienser i CSG minskade oxidationsrelaterad skada av PD och minskad apoptos av dopaminneuroner. Resultaten av denna studie indikerade att CSG minskade läkemedelsdosen och förbättrade livskvaliteten hos PD-patienter. I denna studie slutförde totalt 72 av 86 försökspersoner försöket. Slutförandegraden var endast 83,7%, vilket var relativt lågt jämfört med andra liknande kliniska prövningar Orsakerna kan innefatta de två uppsättningarna omfattande tester av försökspersonerna före och efter försöket, komplicerade frågeformulär och regelbundna 3-månaders uppföljningsbesök för dosjustering. Ytterligare ansträngningar krävs för att förbättra försökspersonernas efterlevnad och prövningsgraden.

Det finns dock fler frågor att besvara. Kan CSG ersätta medicinering, såsom dopamin, i det tidiga skedet av PD-behandling och fördröja medicineringsintaget? Till vilket stadium av PD har CSG en signifikant effekt på att minska dosen av medicinering? Kan CSG förlänga den effektiva medicineringsperioden? För att ta itu med dessa frågor är ytterligare ansträngningar, inklusive ytterligare fallstudier, längre behandlingsperioder, förlängd uppföljning efter behandling, ökad detaljerad svårighetsgrad och åldersstratifiering och mer omfattande statistisk analys motiverad.

Baserat på observationen av effektiviteten av CSG vid behandling av PD-patienter undersökte vi i denna studie den möjliga mekanismen för den kliniska effekten av CSG och relaterade gener genom RNA-seq-teknik. Transkriptet, GO-funktionsanalysresultat relaterade till klinisk effekt, KEGG-väganalysresultat och de verkande genlokierna i CSG: s behandling på PD erhölls. Ytterligare ansträngningar kommer dock att behövas för att identifiera den primära vägen som är involverad i CSG: s aktivitet, de aktiva ingredienserna och monomererna i CSG för behandling av PD och motsvarande symtom på genlodi som CSG verkar på. Framtid
studier bör fokusera på att integrera CM-teorier med bioinformatik och modern molekylärbiologi för att undersöka effekterna och verkningsmekanismen för Shen-förstärkande terapi vid behandling av PD.

Sammanfattningsvis indikerade resultaten att CSG var effektiva för att förbättra livskvaliteten, lindra CM-symtom och minska läkemedelsdoseringen hos PD-patienter med Shen-essensbristsyndrom. Ingen allvarlig biverkning observerades under försöket. Vår studie indikerade att CSG kan vara ett potentiellt nytt läkemedel för behandling av PD. En större provstorlek, multicenterstudier behövs dock för att bekräfta dessa resultat, vilket ligger inom vår framtida forskningsplan.

Utdrag ur: Klinisk effekt och transkriptomisk analys av Congrong Shujing Granulat (苁蓉舒痉颗粒) hos patienter med Parkinsons sjukdom i Shen (njure) Essence Deficiency Syndrome av CHEN Shi-ya1 etc.

------Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419