HPLC för samtidig bestämning av fyra fenyletanolglykosidkomponenter i Cistanche Herba-avkoksbitar och Cistanche Tubulosa-extrakt

Sammanfattning: Syftet med denna studie är att fastställa enhögpresterande vätskekromatografi (HPLC)metod för samtidig bestämning av fyra fenyletanolglykosider iCistanches Herba avkoksbitarochCistanche tubulosa extrakt. De kromatografiska förhållandena använde en Inertsil ODS{{0}}-kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), med en mobil fas bestående av acetonitril - 0,1 % myrsyra lösning med användning av gradienteluering. Flödeshastigheten sattes till 1,0 mL/min, kolonntemperaturen hölls vid 30 grader och detektionsvåglängden var 330 nm med en injektionsvolym på 1{ {27}} µL. Linjäriteten för topparean med koncentrationer varierade från 2,53 till 201,60 µg/ml för olika glykosider, med korrelationskoefficienter (r) större än 0,9993. Gränserna för detektion (LOD) och kvantifiering (LOQ) var mellan 0,2249 till 1,1004 µg/mL respektive 0,3101 till 0,8161 µg/ml. Metoden visade god precision, stabilitet och repeterbarhet med RSD-värden mindre än 3,0 %. Den genomsnittliga återvinningsgraden varierade från 97,70 % till 100,95 %, vilket indikerar metodens noggrannhet och effektivitet för samtidig kvantifiering av dessa komponenter i proverna.

Nyckelord:Högpresterande vätskekromatografi,Cistanches Herba, avkoksbitar,Cistanche tubulosa extrakt, fenyletanolglykosider, innehållsbestämning.

HETIAN DICHENMICROBIAL LIMIT RUM

Cistanche, även känd som Rou Cong Rong och Desert Ginseng, tillhör familjen Orobanchaceae och används i traditionell medicin för sina köttiga stjälkar täckta med fjäll. Den parasiterar rötterna hos Chenopodiaceae-växter som Haloxylon och Tamarix, och finns främst i torra regioner i Inre Mongoliet, Qinghai, Xinjiang och Ningxia i Kina. Den listades först i den klassiska örttexten "Shennong Bencao Jing" som en ört av högsta kvalitet. Cistanche smakar sött och salt, är varmt till sin natur och förknippas med njurarnas och tjocktarmens meridianer. Det är känt för sina fördelar för att stärka njurarna och yang, återfukta tarmarna och lindra förstoppning, skydda levern, anti-aging, bekämpa trötthet och förbättra immuniteten. Kliniskt används det ofta för att behandla tillstånd som njure-yang-brist, blodbristförstoppning, infertilitet hos kvinnor, svaga knän och rygg samt minnesförsämring. Cistanche är vördad som "öknens ginseng" och en "dyrbar medicin".

Växten innehåller fenyletanolglykosider, iridoidterpener, alkaloider, lignaner och andra komponenter, där echinakosid och acteosid är representativa fenyletanolglykosider kända för sina effekter för att förbättra yang, anti-aging, antioxidantegenskaper och minnesförbättring. Dessa komponenter är den primära grunden för de medicinska effekterna av Cistanche och är också nyckelindikatorer för kvalitetsutvärdering och kontroll i 2020 års upplaga av den kinesiska farmakopén.

Det har förekommit rapporter om bestämning av innehållet av fenyletanolglykosid i Cistanche-arter med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC), men dessa har begränsats till Cistanche-råmaterial och -skivor. För närvarande finns det inga nationella standarder för Cistanche tubulosa-extrakt, och dess innehållsbestämning har inte rapporterats. Vår preliminära forskning fann att Cistanche tubulosa från Xinjiang huvudsakligen innehåller fyra representativa fenyletanolglykosider: echinakosid, isoacteosid, acteosid och tubulosid A. Denna studie etablerade en HPLC-metod för samtidig bestämning av dessa fyra komponenter i både Cistanche-avkoksbitar och Cistanche tubulosa-extrakt, som syftar till att bättre utvärdera kvaliteten på Cistanche-dekoktbitar och hjälpa till att fastställa kvalitetsstandarder för dess extrakt. Rapporten är följande.

1 Instrument och reagens

1.1 Instrument

• LC-20AT högpresterande vätskekromatograf, inklusive en diode array-detektor (Shimadzu, Japan)

• AB135-S elektroniska saldo (Mettler Toledo, Schweiz)

• KQ-500DE ultraljudsrengörare (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Aike ultrarent vattensystem (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Reagens

• Standardämnen av Pinoresinoldiglukosid (batchnummer S-003-01904003), isomukronulatol 7-O-glukosid (batchnummer Y-073-11803024), mucronulatol 7-O-glukosid (batchnummer M{ {6}}) och Tubuloside A (batchnummer G-066-11812016), alla köpta från Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., med en renhet på över 98 %.

• Acetonitril och metanol av kromatografisk kvalitet, myrsyra av analytisk kvalitet, vatten var ultrarent.

• Fyra partier av Cistanches Herba avkok (kod S1, S2 från Inre Mongoliet; kod S3, S4 från Xinjiang) köptes alla från fyra apotek i Urumqi.

• Cistanche tubulosa-extrakt (kod S5, enzyminaktiverad vattenextraktion med torr skiva; kod S6, enzyminaktiverad extraktion av torr skiva alkohol; kod S7, enzyminaktiverad torr skiva alkohol hartsbunden extraktion) köptes alla från Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., Ltd.

2 Metoder och resultat

2.1 Kromatografiska förhållanden

• Kromatografisk kolumn: Inertsil ODS-3 kolumn (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Mobil fas: Acetonitril (A) - 0,1 % myrsyravattenlösning (B) med en gradienteluering (från 17 % A till 20 % A under 0-12 min, 20 % A till 22 % A över 12-30 min, 22 % A till 17 % A över 30-35 min)

• Flödeshastighet: 1,0 mL/min

• Detektionsvåglängd: 330 nm

• Kolumntemperatur: 30 grader

• Injektionsvolym: 10 µL

  

Hetia Dichen Fysikaliskt-kemiska laboratorium

2.2 Beredning av lösning

• Blandad standardlösning: Väg var och en av de fyra standarderna noggrant och överför till separata 10 mL mätkolvar, fyll till volymen med 50 % metanol för att erhålla enstaka standardlösningar med koncentrationerna 1,008, 1,011, 1,012 och 1,012 mg/L för Pinoresinoldiglukosid, Tubulosid A, Mucronulatol 7-O-glukosid respektive Isomukronulatol 7-O-glukosid. Mät upp en lämplig mängd av varje, kombinera i en 10 ml mätkolv, ställ till volym med 50 % metanol, blanda väl för att bereda en blandad standardlösning med koncentrationer på 201,60, 50,55, 101,20 respektive 50,60 µg/mL, och filtrera genom ett 0,45 µm membranfilter.

• Provlösning: Cirka 1,0 g Cistanches Herba-avkokspulver (passeras genom en sikt nr 4) vägs noggrant och överförs till en 1{{10}}0 ml bärnstensfärgad mätkolv . Tillsätt exakt 50 mL 50 % metanol, väg, extrahera ultraljud i 40 minuter med en effekt på 250 W och frekvens på 35 kHz, kyl, väg om och fyll på den förlorade massan med 50 % metanol. Blanda väl, filtrera och samla upp filtratet. Passera genom ett 0,45 µm membranfilter för att erhålla Cistanches Herba provlösning. Förbered på samma sätt Cistanche tubulosa-extraktprovlösningen med cirka 0,2 g av extraktpulvret.

1. Echinakosid 2. Tubulosid A 3. Akteosid 4. Isoakteosid A. Blandad referenslösning B. Testlösning av Cistanches Herba-avkoksbitar C. Testlösning av Cistanche Tubulosa-extrakt

2.3 Metodologisk undersökning

Systemets lämplighetstest: Lämpliga volymer av tre lösningar från avsnitt 2.2 togs under de kromatografiska förhållanden som beskrivs i avsnitt 2.1, och kromatogram registrerades. Resultaten indikerade att det teoretiska plattnumret för echinacoside-toppen inte borde vara mindre än 3000, med separationsgrader större än 1,5, vilket indikerar god baslinjeseparation. Se figur 1 för detaljer.

Linearitetsutvärdering: Exakta volymer av den blandade referenslösningen från avsnitt 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 och 10,0 mL 10 ml mätkolvar, bringades till volym med 50 % metanol, blandades väl och användes för att skapa en serie blandade referenslösningar. Exakt 10 µL av dessa lösningar injicerades under de kromatografiska betingelserna i avsnitt 2.1. Toppareor registrerades och linjär regression utfördes med användning av koncentrationerna av komponenterna (X, µg/ml) som den oberoende variabeln och toppareorna (Y) som den beroende variabeln. Regressionsekvationerna och linjäritetsintervallet finns i Tabell 1.

Detektions- och kvantifieringsgränser: Exakta volymer av den blandade referenslösningen från avsnitt 2.2 togs, späddes i enlighet med detta och analyserades under de kromatografiska förhållandena i avsnitt 2.1. Koncentrationer motsvarande signal-brus-förhållanden på 3:1 och 10:1 användes som detektions- respektive kvantifieringsgränser. Resultaten presenteras i tabell 1.

Precisionstest: En lämplig volym av den blandade referenslösningen från avsnitt 2.2 analyserades sex på varandra följande gånger under de kromatografiska förhållandena i avsnitt 2.1. RSD-värdena för toppareorna för echinakosid, tubulosid A, akteosid och isoakteosid var 1,31 %, 0,91 %, 1,58 % respektive 0,58 % (n {{12} }), vilket indikerar god precision hos instrumentet.

Stabilitetstest: Testprovlösningar bereddes och lämnades i rumstemperatur i 0, 2, 4, 6, 8, 12 och 24 timmar innan de analyserades under villkoren i avsnitt 2.1. RSD-värdena för toppareorna för echinakosid, tubulosid A, akteosid och isoakteosid var 1,84 %, 2,18 %, 1,05 % respektive 1,55 % (n=7), vilket indikerar att testlösningarna var stabila i rummet temperatur i upp till 24 timmar.

Repeterbarhetstest: Ett prov (ID: S2) vägdes noggrant och delades upp i sex portioner. Varje portion bereddes som en testprovlösning enligt metoden i avsnitt 2.2 och analyserades under de kromatografiska betingelserna i avsnitt 2.1. Medelhalten av echinakosid, tubulosid A, akteosid och isoakteosid var 0,779 %, 0.020 %, 0,155 % respektive 0,074 % , med RSD-värden på 1,21 %, 3,12 %, 2,65 % och 2,96 % (n=6), vilket visar god repeterbarhet för metoden.

Återvinningstest: En känd kvantitet prov (ID: S2) togs och delades upp i nio portioner. Varje portion spetsades med låga, medelhöga eller höga koncentrationer av de individuella referenslösningarna, framställda enligt metoden i avsnitt 2.2, och analyserades under de kromatografiska förhållandena i avsnitt 2.1. Toppområden registrerades och återhämtningsgraden beräknades. Resultaten visas i tabell 2.

Hetian DiChen HPLC Laboratorium

2.4 Provinnehållsbestämning

Lämpliga volymer av varje provsats framställdes som testlösningar enligt metoden i avsnitt 2.2 och analyserades sedan under de kromatografiska betingelserna i avsnitt 2.1. Varje prov testades i tre exemplar, toppareor registrerades och innehållet i proverna beräknades. Resultaten visas i tabell 3.

3 Diskussion

I denna studie användes en diod array-detektor och skanningar av de blandade referenslösningarna och testprovlösningarna utfördes inom våglängdsområdet 200 till 450 nm. Resultaten visade att echinakosid och acteosid uppvisade maximal absorption vid 330 nm, tubulosid A vid 331 nm och isoakteosid vid 327 nm. Dessutom, med hänvisning till 2020 års upplaga av den kinesiska farmakopén, som specificerar en detektionsvåglängd på 330 nm för echinakosid och acteosid, observerades det att många komponenter hade signifikanta kromatografiska toppar och höga svarsvärden vid 330 nm, vilket ledde till valet av 330 nm den slutliga mätningens våglängd.

Från resultaten av innehållsbestämningen av Cistanches Herba-dekoktbitar fann man att echinakosid hade det högsta innehållet i både Cistanche tubulosa och öken-Cistanche, följt av akteosid, medan tubulosid A och isoacteosid hade relativt lägre halter. Det fanns en betydande variation i innehållet av de fyra fenyletanolglykosidkomponenterna, och denna variabilitet var också uttalad mellan olika satser från samma plats eller olika platser. Denna variation kan hänföras till faktorer som geografisk miljö, temperatur, klimat och skördeprocesser för råvarorna, vilka påverkar ansamlingen av kemiska beståndsdelar i växterna. Medan de kemiska komponenterna i Cistanche som kommer från olika ursprung är likartade, varierar koncentrationerna av dessa komponenter, vilket leder till skillnader i deras effekter. Därför är det lämpligt att välja råvaror baserat på deras effektivitet för att uppnå bättre kliniska resultat.

Sammanfattningsvis är metoden som etablerats i denna studie enkel, snabb, korrekt och effektiv. Den kan användas för att samtidigt bestämma fyra fenyletanolglykosidkomponenter i Cistanches Herba-avkoksbitar och Cistanche tubulosa-extrakt. Resultaten av innehållsbestämningen kan återspegla kvalitetsnivåerna för olika partier och olika extrakt från samma eller olika platser, vilket ger en teoretisk grund för att fastställa relevanta kvalitetsstandarder.

Flik. 2 resultat av återställningstestet (n=9)

Flik. 3 Resultat av innehållsbestämning av fyra fenyletanoidglykosider i proverna (%,n=3)

Cistanche-fördelar

Referenser:

1. 中文 (kinesiska): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:瑭卛北京:瑭升:{100}{101} {1}}.
   英文 (engelska): National Pharmacopoeia Commission. Folkrepubliken Kinas farmakopé (Vol. 1) [M]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 140-141.

2. 中文 (kinesiska): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (engelska): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, et al. Jämförande studie av fingeravtrycken av Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (kinesiska): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (engelska): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, et al. Jämförelse av Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa [J]. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (kinesiska): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (engelska): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, et al. Studie om laxerande och tonifierande njur-yang-effekter av Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (kinesiska): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (engelska): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, et al. Effekter av Cistanche deserticola före och efter bearbetning på anti-aging och immunfunktion hos åldrande modellråttor [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (kinesiska): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (engelska): Wu Bo, Fu Yumei. Studie om antilipidperoxidationseffekten av Cistanche-glykosider på subakuta åldrande möss [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (kinesiska): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (engelska): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, et al. Studie om effekten av Cistanche-glykosider på inlärning och minnesfunktion hos normala möss [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (kinesiska): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (engelska): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Utveckla Cistanche deserticola ekologisk industri för att främja ekologisk civilisation i västra ökenområden [J]. Modern Chinese Medicine, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (kinesiska): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (engelska): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei, et al. Kvalitativ analys av fenyletanoidglykosider och polysackarider i Cistanche deserticola från olika ursprung [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (kinesiska): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (engelska): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, et al. Bestämning av aktiva komponenter i Cistanche deserticola genom ultrapresterande vätskekromatografi-tandem trippelkvadrupolmasspektrometri [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (kinesiska): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (engelska): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Studie om flashextraktionsteknik av echinacoside och verbascoside i Cistanche deserticola [J]. Livsmedelsforskning och utveckling, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (kinesiska): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (engelska): Yu Yifan. Forskningsframsteg om kemiska beståndsdelar och farmakologiska aktiviteter hos Cistanche [J]. Chemical Management, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (kinesiska): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (engelska): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Effekt av Cistanche deserticola på anti-trötthet och minne hos möss [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (kinesiska): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (engelska): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu, et al. Forskningsframsteg om kemiska beståndsdelar och farmakologiska effekter av Cistanche deserticola och prediktionsanalys av dess kvalitetsmarkörer [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (kinesiska): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (engelska): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Effekt av Cistanche deserticola på immunfaktorer och apoptosrelaterade proteiner hos råttor med för tidig ovariesvikt [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 20