Human Alpha Defensin 5 uttryck i den mänskliga njuren och urinvägarna

För mer information: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstrakt

Bakgrund:Mekanismerna som upprätthåller sterilitet i urinvägarna är ofullständigt förstått. Nyligen genomförda studier har implicerat vikten av antimikrobiella peptider (AMP) för att skydda urinvägarna från infektion. Här karakteriserar vi uttrycket och relevansen av AMP humant alfa-defensin 5 (HD5) i människannjureoch urinvägar hos normala och infekterade försökspersoner.

Metodik/huvudsakliga resultat:Använder RNA isolerat från människanjure, urinledare och blåsvävnad, utförde vi kvantitativ realtids-PCR för att visa att DEFA5, genen som kodar för HD5, uttrycks konstitutivt i hela urinvägarna. Med pyelonefrit ökade uttrycket DEFA5 signifikant injure. Med hjälp av immunoblotanalys ökade HD5-produktionen också med pyelonefrit. Immunfärgning lokaliserade HD5 till urinblåsan och urinledaren. I njurarna producerades HD5 främst i det distala nefronet och uppsamlingsrören. Med hjälp av immunoblot- och ELISA-analyser detekterades inte HD5 rutinmässigt i icke-infekterade humana urinprover samtidigt som urin-HD5-produktionen ökade med E.coli-urinvägsinfektion.

Slutsatser/betydelse:DEFA5 uttrycks i hela urinvägarna hos icke-infekterade försökspersoner. Specifikt uttrycks HD5 i hela urotelet i de nedre urinvägarna och i uppsamlingsrören injure. Med infektion ökar HD5-uttrycket injure, och nivåerna blir detekterbara i urinen. Såvitt vi vet representerar våra fynd de första som kvantifierar HD5-uttryck och produktion i den mänskliga njuren. Dessutom är detta den första rapporten som upptäcker förekomsten av HD5 i infekterade urinprover. Våra resultat tyder på att HD5 kan ha en viktig roll för att upprätthålla urinvägssterilitet.

Cistanche biverkningar och Cistanche tubulosa förnjuresjukdom, klicka här för att få provet

Introduktion

Urinvägarna, bortsett från urethral meatus, är vanligtvis sterila trots sin närhet till fekal flora. De exakta mekanismerna genom vilka urinvägarna bibehåller sin sterilitet är inte väl förstått. Föreslagna mekanismer som bidrar till försvaret av urinvägarna inkluderar urinflöde, förändringar i urinens pH och osmolaritet, regelbunden tömning av urinblåsan, kemiska försvarskomponenter i uroepitelet och epitelavfall/inflöde av effektorimmunceller med bakteriestimulering [1]. Dessutom har antimikrobiella peptider (AMP) nyligen visat sig ha en viktig roll för att upprätthålla urinvägssterilitet [2]. AMP, som fungerar som naturliga antibiotika som produceras av nästan alla organismer, är en allestädes närvarande komponent i det medfödda immunsystemet. AMP är katjoniska molekyler som uttrycks av fagocytiska vita celler och epitelceller. Hos människor och andra däggdjur är defensiner en stor familj av AMP. Defensiner har vanligtvis bredspektrum antimikrobiell aktivitet mot grampositiva och gramnegativa bakterier, virus, svampar och protozoer [2,3]. Defensiner syntetiseras initialt som preproproteiner och genomgår bearbetning för att bli mogna, biologiskt aktiva peptider [4]. Hos människor klassificeras defensiner i en av två familjer beroende på deras disulfidöverbryggande mönster - alfa-defensinerna eller beta-defensinerna [5].

I urinvägarna uttrycks beta-defensiner brett i hela uroepithelium. Epitelceller som kantarnjureögla av Henle, distal tubuli och uppsamlingskanal uttrycker konstitutivt humant beta-defensin 1 (hBD1). Även om urinnivåerna av hBD1 är otillräckliga för att döda invaderande bakterier, ger hBD1 en snabbverkande antimikrobiell beläggning av tubulära lumen och förhindrar infektion genom att hämma bakteriell vidhäftning till urotelet [6]. Nyligen genomförda studier indikerar att redoxtillståndet för hBD1 signifikant påverkar antimikrobiell styrka, så att den reducerade peptiden är mycket mer potent än den disulfidkopplade oxiderade formen [7]. Betydelsen av detta vid urotelytan har inte fastställts. Ett annat defensin, humant beta-defensin 2 (hBD2), uttrycks inte konstitutivt i frisk njurvävnad; men hBD2 uttryck induceras av infektion [8].

Till skillnad från beta-defensinerna är rollen för epitelhärledda alfa-defensiner inte väl beskriven i urinvägarna. Uttrycket och funktionen av alfa-defensinerna HD5 och HD6 har mestadels rapporterats i tunntarmen där de utsöndras av Panethceller i tarmkrypterna och bidrar till balansen av tarmmikrobiota [9]. HD5 har också lokaliserats i de manliga och kvinnliga könsorganen, med bevis som tyder på att det är inducerbart och viktigt för att utrota infektion [10,11,12]. Urin-HD5 har upptäckts hos patienter som har genomgått ileal neoblåderrekonstruktion och ileal conduit urinavledning varvid källan till HD5-produktionen i första hand krediterades till ileal Paneth-celler [13,14]. HD5 har antibakteriell aktivitet mot vanliga uropatogena grampositiva bakterier och gramnegativa bakterier [15]. HD5 har också antimikrobiell aktivitet mot uropatogena virus som adenovirus och BK-virus [16,17,18]. I denna studie ger vi den första beskrivningen och kvantifieringen av HD5-uttryck hos människannjureoch vidare definiera dess uttryck i de nedre urinvägarna under sterilitet och infektion.

Resultat

DEFA5 mRNA uttrycks konstitutivt i den mänskliga urinblåsan, urinledaren och njuren

Kvantitativ realtids-PCR visar att alla testade urinblåsor, urinledare ochnjureprover utan infektion uttryckte konstitutivt DEFA5. DEFA5-uttryck var signifikant högre i de nedre urinvägarna än de övre urinvägarna (p= 0.014). I urinblåsan (n=4) var medel DEFA5-uttryck 4,656637 transkript per 10 ng RNA och i urinledaren (n=4) var medel DEFA5-uttryck 4,1126170 transkript per 10 ngRNA (Figur 1A) . I njuren (n=6) var det genomsnittliga uttrycket av DEFA5 2,9376274 transkript per 10 ng RNA. DEFA5-uttryck analyserades separat i njurbarken, medulla och bäcken. DEFA5-uttrycket varierade inte signifikant beroende på njurregion (p= 0.45).

DEFA5-expression och HD5-peptidexpression ökar med pyelonefrit

Kvantitativ realtids-PCR-analys utförd pånjurvävnader medpyelonefrit visade en signifikant ökning av DEFA5-uttryck jämfört med icke-infekterade njurvävnader. Med pyelonefrit (n= 6), ökade medel DEFA5-uttryck till 7 82961 052 transkript per 10 ng RNA (p= 0.019) (Figur 2A).

För att ytterligare utvärdera denna ökning i uttryck med pyelonefrit, utförde vi immunoblotanalys på sammanjurevävnad som användes för realtids-PCR-analys för att utvärdera för samtidiga ökningar av HD5-peptidproduktion (Figur 2B, mittpanelen). Immunoblotanalys, med användning av polyklonala HD5-antisera, visade signifikant högre HD5-peptidproduktion i njurvävnad med pyelonefrit (n {{5} }) jämfört med icke-infekteradenjurevävnader(n=6). Icke-infekteradnjurevävnader uttryckte 300625 ng HD5/gram våt vävnadsvikt medannjurevävnad med pyelonefrit uttryckt 600621 ng HD5/gram våtvävnadsvikt (p,0,0001). Blots undersöktes på nytt med GAPDH för att fungera som en laddningskontroll (Figur 2B, mittpanelen) och en silverfärgning utfördes också för att bekräfta lika proteinbelastning (Figur 2B, övre panelen).

HD5-peptid produceras i hela mänskliga njurar och urinvägar

Immunfärgning utfördes för att lokalisera HD5-produktion i urinvägarna. Immunhistokemi (IHC) visade att HD5-immunoreaktivitet var närvarande i hela urothelium i urinledaren och urinblåsan på alla undersökta prover (n=4, figur 3). IHC visade också att HD5 producerades i tubuli i njurbarken och medulla av alla exemplar (n= 6, figur 4). Immunfluorescens (IF) visade att HD5-uttrycket var störst i det distala nefronet och de samlande tubuli (Figur 5). Interstitium och glomeruli visade inte HD5-immunreaktivitet. Immunfärgningen som visas i figurerna 3, 4 och 5 utfördes med användning av en mus monoklonal anti-HD5-antikropp (8C8) som känner igen HD5-propeptiden (Abcam, Cambridge, MA). Resultaten var liknande när man använde polyklonal anti-HD5-antikropp från kanin som känner igen HD5-propeptiden och den mogna peptiden (data visas inte) – vilket tyder på att HD5 lagras som en propeptid.

Med pyelonefrit ökade HD5-immunfärgning markant. HD5-immunreaktivitet ökade i hela det proximala nefronet, det distala nefronet och de samlande tubuli (Figur 4 och Figur 5). Liksom i icke-infekterade prover visade glomeruli och interstitium inget HD5-uttryck med infektion. Negativa kontroller visade ingen HD5-immunreaktivitet.

Infekterad mänsklig urin innehåller mätbara koncentrationer av HD5-peptid

Immunoblotanalys, med användning av polyklonalt kaninantiserum som detekterar prekursorn proHD5 och vidare bearbetade former identifierade mätbara nivåer av HD5 i 13 av de 15 testade urinproverna infekterade med uropatogen E. coli (Figur 6A och B). När de förekom låg HD5-nivåerna, normaliserade till urinkreatinin, mellan 299,8–669,7630 ng HD5/mg urin Cr (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), vilket motsvarar 11,10–27,67 nmol/L. Icke-infekterade urinprover (n=15), HD5 låg vid eller under detektionsgränsen på (,50 ng). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) på samma urinprov, med användning av den monoklonala musantikroppen (8C8) som endast detekterar prekursorn proHD5, detekterade mätbara nivåer av proHD5 i 13 av de 15 testade infekterade proverna. UrinproHD5-koncentrationer varierade från 122,78–490,060,03 ng HD5/mg urin Cr (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) när det finns (Figur 7).

Diskussion

I denna studie ger vi den initiala karakteriseringen av HD5 hos människannjure, urinledare och urinblåsa. HD5 har visat sig vara en viktig AMP som förhindrar invasiv infektion i tarmen och är uppreglerad i könsorganen vid infektion[11,18,19,20,21]. Epitelhärledda AMPs, som HD5, har visat sig vara viktiga för att upprätthålla sterilitet i urinvägarna [8,22,23,24]. Brister i dessa medfödda slemhinneförsvar kan resultera i akut och/eller kronisk infektion [25,26].

Våra kvantitativa realtids-PCR-resultat visar att DEFA5 uttrycks konstitutivt i människannjurar, urinledare och urinblåsa. DEFA5-uttrycket ökar från de övre urinvägarna till de nedre urinvägarna – efter flödet av urinströmmen och den ökande närheten till mikrobiotans invasionspunkt. Såvitt vi vet är detta den första studien som kvantifierar DEFA5-uttryck i den mänskliga njuren och urinblåsan. Nyligen visade Townes et al att normal distal urinledare kan uttrycka DEFA5 [14]. Våra resultat tyder också på att DEFA5 uttrycks konstitutivt av den distala urinledaren. Även om uttrycket av DEFA5 i urinvägarna är nästan 100- gånger lägre än det som finns i gastrointestinala vävnader, är det basala uroepitheliala uttrycket av DEFA5 jämförbart med uttrycket av tidigare beskrivna urinvägsförstärkare som katelicidin, hBD-1, hBD -2 och ribonukleas 7[6,8,22,24,27].

I motsats till den mogna mag-tarmkanalen där DEFA5 uttrycks i höga nivåer i både hälsotillstånd och infektion/inflammation, visar våra kvantitativa realtids-PCR-data att DEFA5-uttryck injureär signifikant uppreglerad med infektion [27,28,29]. Detta inducerbara uttrycksmönster är analogt med DEFA5-uttryck i det kvinnliga reproduktionsorganet där DEFA5-uttrycket ökar med salpingit [30]. I urinvägarna har Townes et al visat en trend mot ett ökat ureteralt uttryck av DEFA5 hos patienter med UTI som har genomgått urinavledning från ilealkanalen [14]

Vår immunoblotanalys kompletterar realtids-PCR-data genom att visa att HD5-peptidproduktionen ökar med pyelonefrit. Detta inducerbara mönster av HD5-produktion liknar det som ses hos vissa medlemmar av beta-defensinfamiljen. hBD2 visar ett inducerbart produktionsmönster med infektion i urinvägarna och/eller kronisk pyelonefrit [8,31,32]. HD5-peptidproduktion har visat sig öka i det övre kvinnliga könsorganet och manligt urinrör med inflammation [11,30].

Med hjälp av immunfärgning visar vi att HD5 produceras enhetligt i urinledarens och urinblåsan urothelium. Eftersom den stora majoriteten av urinvägsinfektioner härrör från fekal flora som stiger upp i urinblåsan, tyder dessa resultat på att HD5-uttryck är närvarande på platser där mikrobiell exponering förekommer oftast [33]. Därför är HD5 idealiskt placerat för att förhindra en stigande mikrobiell infektion. I dennjure, HD5 produceras främst i den distala nefronen och uppsamlingsröret. Dessa fynd tyder på att HD5 produceras på platser där det kommer att vara positionerat för att ha optimal antimikrobiell aktivitet. Tidigare studier har visat att defensinernas antimikrobiella egenskaper är beroende av saltkoncentrationen – med högre saltkoncentrationer som minskar antimikrobiell aktivitet [23,34,35]. Vi spekulerar i att de låga saltkoncentrationerna av det distala nefronet och samlande tubuli ger en gynnsam miljö för HD5 antimikrobiell aktivitet.

Immunoblot och ELISA-analys visar också att HD5 utsöndras i urinen vid låga nivåer. Med tanke på storleken (8,1 kDa och 3,7 kDa) och den positiva laddningen av proHD5 och fullt bearbetad HD5, är det möjligt att viss urin HD5-peptid härstammar, åtminstone delvis, från plasmafiltrat. Ändå finns det få bevis som tyder på att HD5 kvarstår i plasma [27]. För att uppträda i urinen skulle HD5 dessutom behöva undkomma de effektiva peptidabsorptionsmekanismerna i den proximala tubuli [6,36]. Slutligen genomgick urinprover som användes centrifugering innan analyserna utfördes, vilket avlägsnade cellulära källor till HD5.

Vid de upptäckta koncentrationerna är det osannolikt att urin-HD5 är direkt antimikrobiellt mot uropatogena mikroorganismer eftersom fullt bearbetad HD5 har en minimal hämmande koncentration (MIC) mellan 6–10 mg/ml mot vanliga gramnegativa uropatogena bakterier [15]. Men koncentrationerna på slemhinnan är sannolikt högre. Vidare visar immunoblotanalys att HD5-koncentrationerna är betydligt högre injure. Dessa resultat tyder på att HD5 är involverat i slemhinneförsvar av urinvägarna. Ett analogt mönster ses med hBD1, där urinkoncentrationer av hBD1 är otillräckliga för att uppvisa antimikrobiell aktivitet men högre peptidkoncentrationer detekteras nära njurtubuli [6,31].

Eftersom IHC visar att proHD5 är en viktig form av HD5 injureoch eftersom både mogna och proHD5 detekteras i urinen, spekulerar vi att HD5 i första hand utsöndras som en prekursormolekyl och sedan genomgår proteolytisk bearbetning för att generera mogna former - liknande mag-tarmkanalen och genitourinary kanalerna [11,30,37]. I tunntarmen producerar Paneth-celler trypsin, som klyver HD5-propeptiden så att den fullt bearbetade peptiden är den dominerande formen i tarmens lumen [37]. I det manliga urinröret är de viktigaste bearbetnings- och aktiverande enzymerna för HD5 neutrofila proteaser som bidrar med neutrofiler som rekryterats till infektionsplatsen [11]. Bidragen från epitelialt trypsinogen, urintrypsin och/eller neutrofila proteaser på HD5-bearbetning i urinvägarna under infektion återstår att fastställa. Dessutom återstår även effekterna av förändringar i urinmiljön på HD5-funktionen (förändringar i osmolaritet, pH och katjoniska koncentrationer) att fastställa.

Sammanfattningsvis är detta den första studien som identifierar och kvantifierar uttrycket och produktionen av HD5 i urinvägarna. Våra resultat tyder på att HD5 är en epitelhärledd AMP som kan spela en viktig roll i den medfödda immuniteten hos det mänskliga uroepithe lium som förhindrar translokation av invaderande patogener till cirkulationen. Att klargöra de faktorer som reglerar HD5-produktion kan ge ny insikt i patogenesen av UVI hos patienter med risk för UVI och patienter med kroniska infektioner.

Metoder

Studiegodkännande

Informerat skriftligt samtycke erhölls från alla patienter som deltog i denna studie. För försökspersoner under 18 år erhölls skriftligt medgivande från föräldrar/vårdnadshavare. NationwideChildren's Hospital (NCH) Institutional Review Board godkände denna studie tillsammans med samtyckesprocessen och dokument (IRB07-00383).

Mänsklig vävnad och urinprov

Icke-infekterad distal ureter och blåsvävnad (n= 4) erhölls från barn som genomgick ureteral re-implantation av andra skäl än återkommande infektion. Icke-infekteradnjureprover (n=6) erhölls från patienter som genomgick nefrektomi för njurtumörer. Vävnadsprover var fria från makroskopiska tecken på sjukdom eller inflammation.Njurevävnad från patienter med kronisk pyelonefrit tillhandahölls av Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Två oberoende patologer bekräftade den histopatologiska diagnosen pyelonefrit. Vävnadsprover snabbfrystes eller konserverades som neutrala formalinfixerade paraffininbäddade sektioner. Sektioner av icke-infekterad njurvävnad dissekerades i cortex, medulla eller njurbäcken före lagring (n=4).

Icke-infekterade och infekterade urinprover erhölls från barn som uppsökte NCH akutmottagning eller nefrologisk klinik. Diagnosen UVI gjordes av en positiv urinodling enligt American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Alla infekterade urinprover hade 0,106 CFU/ml E.coli. Urinernas pH-värden varierade från 5,5 till 8,5 (medelurin 6,9). Urinjonsammansättningen mättes inte. Urinprover centrifugerades för att avlägsna urinsediment och proteashämmarcocktail tillsattes (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Ribonukleinsyraisolering och omvänd transkription

Totalt RNA isolerades från frusen vävnad med användning av PromegaTotal RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA). ForcDNA-syntes, 4–8 mg totalt RNA omvänt transkriberades med Superscript III omvänt transkriptas med användning av en oligo-(dT)12–18primer enligt leverantörens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Kloning av genspecifika plasmider för standardkurvor

Det cDNA som kodar för DEFA5 och GAPDH klonades in i en 4-Topo-plasmidvektor (Invitrogen) enligt tillverkarens instruktioner. Plasmider sekvenserades för att bekräfta att det var korrekt

konstruktioner erhölls. Serieutspädningar av genspecifika plasmider kvantifierades (genom spektrofotometrisk absorbans vid 260 och etidiumbromid-färgad agarosgelelektrofores) och användes i realtids-PCR för att generera standardkurvor för varje reaktion.

Kvantitativ PCR i realtid

Kvantitativ realtids-PCR utfördes med användning av enkelsträngat cDNA från människanjure, urinledare och blåsvävnad med specifika oligonukleotidprimerpar med användning av 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 och DEFA5 omvänd primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Kortfattat tjänade cDNA motsvarande 10 ng RNA som en mall i en 25 ml reaktion innehållande 2,0 mM av varje primer och 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green mix. PCR-betingelser var: initial denaturering vid 95uC under 10 minuter, följt av 40 cykler med varje cykel bestående av denaturering vid 94uC i 30 sekunder, hybridisering vid 64uC i 30 sekunder och förlängning vid 72uC i 30 sekunder. Cykel-till-cykel-fluorescensemissionen övervakades vid 530 nm och analyserades med användning av 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Genspecifika plasmidstandarder inkluderades i varje uppsättning reaktioner. Som en positiv kontroll inkluderades terminal ileum-RNA i varje uppsättning reaktioner, och resultaten jämfördes med tidigare publicerade standarder [27].

För att bekräfta PCR-amplifiering av den avsedda produkten analyserades ett representativt prov med elektrofores på en 1,5 procentig agarosgel. Produkterna visualiserades genom etidiumbromidfärgning och jämfördes med DNA-storleksstandarder med bekräftad produktstorlek (ej visad). Dessutom bestämdes en smälttemperaturprofilkurva för varje PCR-reaktion vid slutet av varje reaktion.

HD5-antikroppar

HD5-propeptiden (AA20-94) och delvis bearbetade former (AA36-94 och 56–94) identifierades med en kommersiellt tillgänglig mus monoklonal (8C8) anti-HD5-antikropp (Abcam). HD5-propeptiden och den mogna peptiden (AA63-94) identifierades med användning av tidigare beskrivna polyklonalt kaninantiserum[13,40].

Immunoblot

Avsnitt av detsammanjureProver som användes för kvantitativ realtids-PCR-analys (3–6 mg våtvikt) pulveriserades med en mortel och mortelstöt i flytande kväve och löstes i RIPA-buffert med proteashämmare. Urinproteiner extraherades från urinprover med användning av ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada). Njur- och urinproteinkoncentrationer kvantifierades med användning av en modifierad Bradford-analys och bekräftades med användning av en anOD280 nm-avläsning. Lika koncentrationer av njurvävnad eller urinprotein laddades på 18 procent natriumdodecylsulfatgradientgeler och utsattes för elektrofores. För att säkerställa lika proteinbelastning utfördes en silverfärgning.

Efter elektroforetisk separation överfördes proteiner till ett nitrocellulosamembran. Efter fixering med 0.05 procent glutaraldehyd i TBS, blockerades membranen i 5 procent fettfri mjölk i 30 till 60 minuter och inkuberades i en 1:1,000 utspädning av polyklonalt HD5-antiserum från kanin över natten . Efter tvätt applicerades den sekundära antikroppen, en anti-kanin pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-kanin IgG utspädd 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), i 1 timme vid rumstemperatur. Immunoblots frånnjurevävnader undersöktes också med anti-GAPDH-antikropp (Sigma Aldrich) under två timmar vid rumstemperatur och inkuberades sedan med den sekundära antikroppen som beskrivs ovan. Proteinerna visualiserades med användning av ett ECL-detektionssystem och kemiluminescensfilm enligt tillverkarens instruktioner (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

HD5 kvantifierades genom att jämföra resulterande bandintensiteter med en serieutspädning av rekombinant standard proHD5-protein (Peptides International, Louisville, KY, USA).NjureHD5-koncentrationer standardiserades till vikten av våt vävnad. Urin HD 5-koncentrationer delades med urinkreatinin för att fastställa standardiserade urin HD5-till-kreatininförhållanden (mg/mg) för att ta hänsyn till urinspädning. Urinkreatininkoncentrationer bestämdes med användning av Oxford Biomedical Research kreatininmikroplattanalys (Rochester Hills, Michigan, USA).

Immunhistokemi

Efter avparaffinering, rehydrering och antigenåtervinning utfördes ett biotinblock och ett serumfritt proteinblock (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Objektglasen inkuberades över natten vid 4uC med monoklonal mus HD5(8C8) antikropp (1:2{{10}}0; Abcam) eller polyklonalt kaninantiserum (1:500) följt av anti-polyvalent biotinylerad antikropp som förvanskats Streptavidin/HRP (ScyTek Laboratories). Sektioner framkallades med användning av 0,1 procent diaminobensidintetraklorid med 0,02 procent väteperoxid och motfärgades med hematoxylin. Negativa kontrollsektioner inkuberades med icke-immunserum i stället för HD5-antikropp.

Immunfluorescens

Dubbelmärkt immunfluorescens utfördes för att hjälpa till att lokalisera HD5-uttryck injure. Uppsamlingskanalen var dubbelmärkt för huvudceller med get polyklonal anti-human aquaporin-2-antikropp (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Slingan av Henle dubbelmärktes med muspolyklonal anti-human uromodulinantikropp (Sigma-Aldrich) och den proximala tubulen dubbelmärktes med get polyklonalantihuman aquaporin-1 (Santa Cruz) [41,42]. Rhodamine åsna polyklonal anti-get (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), rhodamine get anti-mus (JacksonImmunoResearch Laboratories) och FITC åsna polyklonal anti-kanin (Santa Cruz) fungerade som de sekundära antikropparna.

Alla avsnitt förbereddes enligt ovan. De inkuberades med en blandning av musantisera mot HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) i rummet temperatur i 90 minuter. Den sekundära antikroppen applicerades i 90 minuter vid rumstemperatur och sektionerna monterades med användning av monteringsmedia med DAPI. Icke-immunserum användes som en negativ kontroll. Objektglasen undersöktes med ett Leica DM4000B-mikroskop och fotograferades digitalt med hjälp av Spot RT-kamera/mjukvara (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) musmonoklonal antikropp i 2 timmar vid rumstemperatur, streptavidin-pepparrotsperoxidas (Biolegend, San Diego CA, USA) tillsattes under 30 minuter. Efter inkubation med TMB-substratlösning i 15 minuter (Kem-En-Tec Diagnostics), avslutades reaktionen med STOP-lösning (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) och avlästes vid en våglängd av 450 nm. HD5-koncentrationer från ELISA-analysen delades med urinkreatinin för att fastställa standardiserade urin HD5-till-kreatininförhållanden (mg/mg) för att ta hänsyn till urinspädning enligt beskrivningen ovan.

Referenser

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Aktuella koncept för molekylära försvarsmekanismer som fungerar under urinvägsinfektion. European journal of clinical study 38 Suppl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Antimikrobiella peptider, medfödd immunitet och de normalt sterila urinvägarna. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensiner: antimikrobiella och cytotoxiska peptider från däggdjursceller. Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Posttranslationell bearbetning av defensiner i omogna humana myeloidceller. Blood 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Det mänskliga beta-defensinet-1 och alfa-defensinerna kodas av intilliggande gener: två peptidfamiljer med olika disulfidtopologi delar en gemensam härkomst. Genomics 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Humant beta-defensin-1: en antimikrobiell peptid av urogenitala vävnader. J Clin Invest 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Reduktion av disulfidbindningar avslöjar potent antimikrobiell aktivitet av humant beta-defensin 1. Nature 469: 419-423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Uttryck av mänskliga beta-defensiner 1 och 2 i njurar med en kronisk bakterieinfektion. BMC Infect Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Paneth-celldefensiner: nyckeleffektormolekyler för medfödd immunitet. Biochemical Society transaktioner 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Genuttryck, immunlokalisering och utsöndring av humant defensin-5 i den mänskliga kvinnliga reproduktionskanalen. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Distinkta defensinprofiler i Neisseria gonorrhoeae och Chlamydia trachomatis uretrit avslöjar nya epitelceller-neutrofila interaktioner. Infect Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Uttryck av antimikrobiella defensiner i det manliga reproduktionsorganet hos råttor, möss och människor. Reproduktionsbiologi 68: 95–104.

13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Isolering av mänskliga intestinala defensiner från ileal neoblåsurin. FEBS Brev 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Tolerans av bakteriuri efter urinavledning är kopplad till antimikrobiell peptidaktivitet. Urology 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Antobakteriell aktivitet och mekanism för rekombinant humant alfa-defensin 5 mot kliniska antibiotikaresistenta stammar. Afr J Microbiol Res 4: 626-633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Epitelial defensiner försämrar adenoviral infektion: implikation för adenovirusmedierad genterapi. Human genterapi 10: 957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mekanism för adenovirusneutralisering av mänskliga alfa-defensiner. Cellvärd & mikrob 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, et al. (2008) Humana alfa-defensiner hämmar BK-virusinfektion genom att aggregera virioner och blockera bindning till värdceller. The Journal of Biological chemistry 283: 31125–31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Studie av lokal immunitet för nedre könsorgansinfektioner. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Det medfödda och tidiga immunsvaret på patogenutmaning i det kvinnliga könsorganet och epitelcellernas centrala roll. Journal of reproductive immunology 57: 61–79.