Hypotermi inducerad av oxkarbazepin efter övergående ischemi i framhjärnan utövar terapeutiskt neuroskydd genom övergående receptorpotential Vanilloid typ 1 och 4 hos gerbiler del 3

4. Material och metoder

4.1. Försöksdjur

Gerbiler av hankön (totalt antal=252) användes vid 6 månaders ålder (kroppsvikt, 63–78 g). Gerbilerna föds upp i det experimentella djurcentret vid Kangwon NationalUniversity (Chuncheon, Korea).

Gerbiler är väldigt söta små djur. De lever i ökenområden, är bra på att gräva grottor och har starka instinkter för att lagra och lokalisera mat. Bland dessa små killar har gerbiler ett särskilt bra minne, vilket gör att folk vill veta deras hemligheter.

För det första, när gerbilhannar letar efter mat använder de en serie signaler som landmärken och terräng för att bestämma riktningen. Genom långvarig observation och praktik har de etablerat ett eget "geografiskt informationssystem". Däremot har gerbilhonor ett sämre minne för dessa signaler, särskilt i en ständigt föränderlig miljö.

För det andra visar manliga gerbiler också ett starkt minne när de bekämpar naturliga fiender. Enligt forskare, när gerbiler är hotade, kommer de snabbt in i hålan och försöker fly. Men när de står inför samma hot kommer manliga gerbiler att komma ihåg attacksättet för naturliga fiender och undvika dem, vilket ökar deras chanser att överleva.

Slutligen ligger också minnet av gerbiler i deras sociala beteende med varandra. Varje gerbil har sin unika doft. När de träffar andra gerbiler kommer de att använda sitt luktsinne för att identifiera varandras identitet och status. Denna minnesförmåga tillåter inte bara gerbiler att etablera en relativt stabil social anknytning utan är också en viktig garanti för deras reproduktion.

Sammanfattningsvis är förhållandet mellan manliga gerbiler och minne oskiljaktigt. I processen att söka överlevnad och fortplantning i naturen förlitar de sig på sitt starka minne för att ständigt anpassa sig till miljön och förbättra sig själva. Som människor borde vi lära oss av dessa små killar och ständigt finslipa vårt minne för att bättre anpassa oss till denna ständigt föränderliga värld. Man kan se att vi behöver förbättra vårt minne, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom det också kan reglera balansen mellan signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer, som är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Cistanche också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näring och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka på Know för att öka minnesstyrkan

För denna studie godkändes det experimentella protokollet (godkännandenr. KW-200113-1; godkännandedatum, 18 februari 2020) av Institutional AnimalCare and Use Committee.

Forskningsprotokollet följde riktlinjerna som föreslås i "Current International Laws and Policies" i Guide for Care and Use of Laboratory Animals publicerad av The National Academies Press (8:e upplagan, 2011).

4.2. Experimentella grupper, induktion av tFI och HyT- och OXC-behandlingar

För att bevisa de skyddande effekterna av OXC mot ischemisk skada efter FI hos gerbiler delades gerbilerna in i sex grupper: (1) sken+vehikelgrupp (n=24);(2) tFI+vehikelgrupp (n {{5) }}); (3) sken+HyT-grupp (n=24); (4) tFI+HyT-grupp (n=60); (5) sken+OXC (200 mg/kg) grupp (n=24); och (6) tFI+OXC-grupp (n=60).

Sju och fem gerbiler i de tre tFI-grupperna användes för Western blot-analys respektive histologisk undersökning vid 30 minuter, 12 timmar, 1 dag, 2 dagar och 4 dagar efter tFI-operationen, och i de tre skengrupperna, sju och fem gerbiler användes 30 minuter och 4 dagar efter skenoperationen för att minimera antalet. I detta experiment utvecklades tFI som tidigare beskrivits [34].

Kort sagt bedövades gerbilerna med 2,5 % isofluran (i 32 % syre och 68 % dikväveoxid). Under narkos isolerades båda vanliga halspulsådrorna från halspulsådern och tilltäpptes med aneurysmklämmor (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tyskland, Tuttlingen, Tyskland) ) i fem minuter.

Det perfekta stopp av blodtillförseln till hjärnan bekräftades genom observation av arteriellt blodflöde i båda retinala artärerna (grenar av inre halsartärer) med ett oftalmoskop (HEINE K180®) från Heine Optotechnik (Herrsching, Tyskland).

Kroppstemperaturen före och under operationen i alla grupper kontrollerades vid normotermi (37 ± 0,2 ◦C) med en termometrisk filt. Efter fem minuters ocklusion togs klämmorna bort.

I denna studie gjordes en skenoperation genom att utsätta dem för samma tFI-operation utan ocklusion av de gemensamma halspulsådrorna. HyT i de två sken+HyT- och tFI+HyT-grupperna kontrollerades (liknande förändringen i kroppstemperaturen i tFI+) OXC-gruppen) genom helkroppskylning med en ispåse i sex timmar.

Kroppstemperaturen för de två sham+OXC- och tFI+OXC-grupperna registrerades i sex timmar efter omedelbar intraperitoneal injektion av 200 mg/kg OXC (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) efter tFI-operationen.

Doseringen av OXC valdes baserat på en tidigare studie som rapporterade att 200 mg/kg OXC effektivt skyddade mot celldöd i hjärnan efter [36]. För att registrera kroppstemperaturförändringen mättes kroppstemperaturen i ändtarmen varannan timme efter tFI, över en period på 6 timmar, under rumstemperatur (cirka 22 ◦C).

Gerbilerna fick en återhämtningstid på fyra dagar efter tFI eftersom pyramidceller belägna i hippocampus CA1-regionen börjar dö fyra dagar efter tFI [30,34,62].

4.3. SMA-test

SMA-testet utfördes för att undersöka förändringar i hyperaktivitet i alla grupper. Kort sagt, som beskrivits tidigare [63], gjordes SMA-testet på dag 1 efter tFI eftersom rörelseaktiviteten når den högsta punkten på dag 1 efter ischemisk skada efter tFI.

Gerbilerna från alla grupper fick miljöanpassning under två timmar och de placerades i en öppen fältbur (bredd 44 cm; längd 44 cm; höjd 30) erhållen från Ugo Basile SRL (Gemonio, Italien), där två parallella horisontella infraröda strålar 4 × 8 från golvet installerades under en timme. SMA registrerades med hjälp av ett Photobeam Activity System-Home Cagefrom San Diego Instruments (San Diego, CA, USA).

Rörelse (bana och totalt tillryggalagt avstånd) detekterades genom avbrottet av den array av infraröda strålar som produceras av fotoceller.

SMA övervakades kontinuerligt under en timme, och data samlades in med en AMB-analysator från IPC Electronics (Cumbria, Storbritannien).

Datainsamlingen påbörjades 15 minuter efter tillvänjning i den öppna fältburen. Slutligen utvärderades de erhållna resultaten som avståndet (meter) av rörelse under testperioden (en timme).

4.4. Tester av kognitiva funktioner

4.4.1. RAMT

För att jämföra rumsminne över alla grupper utfördes RAMT enligt tidigare studier [38,44]. En radiell 8-armlabyrint från Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA) användes för detta test.

Labyrintinstrumentet bestod av en central plattform och åtta armar (varje armbredd 5 cm; höjd 9 cm; längd 35 cm). Gerbilerna tränades en gång om dagen i tre dagar innan.

Nämligen, pelletsfoder erhållet från DBL Co (Chungbuk, Korea) sattes i änddelen av varje arm, och varje gerbil placerades på den centrala plattformen. Därefter letade gerbilen efter fodret.

Efter sken- eller tFI-operationen utfördes det riktiga testet en gång om dagen i fyra dagar med början en dag efter operationen.

För analysen utvärderades antalet fel, med ett fel som inträffade varje gång gerbilen gick in i en arm som redan besökts tidigare. Testet avslutades när gerbilen ätit fodret.

4.4.2. KLAPPA

För att jämföra korttidsminnet mellan grupperna genomfördes PAT enligt tidigare rapporterade metoder [64,65] med vissa modifieringar. Kort sagt, gerbilerna testades med hjälp av Gemini Avoidance System (GEM 392) från San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), som består av två (mörka och ljusa) fack som kommunicerar med varandra via en vertikalt glidande grind.

De experimentella sessionerna utfördes i två faser: ett träningspass och ett riktigt testpass en dag före och fyra dagar efter tFI- eller skenoperationen.

Det riktiga testet utfördes 20 minuter efter träningspasset genom att mäta latenstiden (sekunder) under vistelsen i det mörka rummet. Under träningspasset fick gerbilen nämligen utforska de två avdelningarna fritt i en minut medan porten öppnades .

Därefter, när gerbilen gick in i det mörka facket, stängdes dörren och gerbilen fick en elektrisk fotchock (0,5 mA) från ett stålgaller på golvet i fem sekunder.

I den riktiga testsessionen, på dag 4 efter tFI, placerades gerbilen i det ljusa facket, och latenstiden i det ljusa facket innan den gick in i det mörka facket registrerades.

4.5. Western blot-analys för TRPV1 och TRPV4

För att undersöka uttrycksnivåerna för TRPV1 och TRPV4 i gerbil hippocampal CA1, utfördes Western blot-tekniken enligt tidigare beskrivna metoder [66,67].

I korthet, enligt det angivna schemat (30 min, 12 timmar, 1 dag, 2 dagar och 4 dagar efter sken- eller tFI-operation), gavs gerbiler (n=5 för varje grupp) bedövning för dödshjälp genom intraperitoneal injektion med 200 mg/kg pentobarbitalnatrium (JW Pharm.Co., Ltd., Seoul, Korea).

Därefter skördades deras hjärnor och homogeniserades med 50 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) innehållande 0.1 mM etylenglykol-bis (aminoetyleter)-N, N, N{{ 11}}, N0-tetraättiksyra (EGTA) (pH 8.0), 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (pH 8,0), 0,2 % Nonidet P{{17 }}, 15 mM natriumpyrofosfat, 100 mM -glycerofosfat, 2 mM natriumortovanadat, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mMfenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och 1 mM ditiotreitol (DTT).

Därefter centrifugerades proverna och supernatanterna togs för att bestämma proteinnivåer med användning av ett Micro BCA-analyskit från Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) med bovineserumalbumin från Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Alikvoter innefattande 20 µg av totalt protein kokades i laddningsbuffert, 150 mM Tris (pH 6,8) innehållande 6% natriumdodecylsulfat (SDS), 3 mM DTT, 0,3% bromfenolblått och 30% glycerol.

Proverna separerades via 10% SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). Därefter överfördes gelerna till nitrocellulosamembran från Pall Co (East Hills, NY, USA) vid 350 mA och 4 ◦C under 90 min.

För att blockera ospecifik färgning inkuberades membranen i 5 % avfettad mjölk i 60 minuter vid rumstemperatur. Därefter immunreagerades de med varje primär antikropp: kanin anti-TRPV1 (spädd 1:1000) (Abcam, Cambridge, Storbritannien), kanin anti-TRPV4 (utspädd 1:1000) (Abcam) och kanin anti- - aktin (utspädd 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vid 4 ◦C under 7 timmar.

Därefter reagerades de med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad åsna-anti-kanin-IgG (spädd 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) vid rumstemperatur under 1 timme.

Slutligen användes aluminolbaserat kemiluminescenskit från Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) för att förbättra visualiseringen.

Som beskrivits tidigare [68], analyserades immunoblots av TRPV1 och TRPV4 med Scion Image-programvara från Scion Crop (Frederick, MD, USA). Banden skannades och densitometrisk analys utfördes. Proteinnivåerna normaliserades mot motsvarande nivå av -aktin.

4.6. Förberedelse av histologiska snitt

För immunhistokemiska och histopatologiska undersökningar avlivades gerbiler (n=7 för varje grupp) enligt det angivna schemat (30 min, 12 timmar, 1 dag, 2 dagar och 4 dagar efter tFI eller skenoperation).

Som tidigare beskrivits [34] var gerbilerna djupt bedövade med pentobarbitalnatrium (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seoul, Korea). Under narkos sköljdes gerbilerna transkardialt med 0,1 M fosfatbuffertsaltlösning (pH 7,4) och fixerades med 4% paraformaldehyd (i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4).

Därefter erhölls deras hjärnor och efterfixerades med användning av samma fixativ i sex timmar. Därefter skars hjärnvävnaderna (25 µm tjocklek av koronala plan) i akryostat (Leica, Wetzlar, Tyskland).

4.7. Histokemisk färgning med CV

För att undersöka den morfologiska och neuronala skadan i hippocampus i varje grupp utfördes kresylviolett (CV) färgning som vi beskrivit tidigare [69]. Kortfattat, kresylviolettacetat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) löstes vid 1,0% (vikt/volym) i destillerat vatten och isättika (0.28 %) sattes till denna lösning. Sektionerna färgades och monterades med kanadensisk balsam (Kanto, Tokyo, Japan).

4.8. FJ B färgning

FJ B-färgning utfördes för att undersöka neuronal degeneration (död eller förlust). Enligt den publicerade proceduren [34] blötlades de förberedda hjärnsektionerna i 1 % natriumhydroxid, överfördes omedelbart till 0.06 % kaliumpermanganat och reagerade omedelbart med 0,0004 % Fluoro-Jade B (Histochem) , Jefferson, AR, USA).

Sektionerna tvättades kort och sattes på en objektglasvärmare (cirka 50 ◦C) för reaktion med FJ B. För att bedöma den terapeutiska effekten av OXC mot tFI, räknades antalet FJ B+-celler i CA1-regionen enligt en metod publicerad i [ 70].

Kortfattat togs digitala bilder av FJ B + celler från fem sektioner per gerbil med hjälp av ett epifluorescerande mikroskop (Carl Zeiss) (Oberkochen, Tyskland) vid 450–490 nm våglängd. Cellerna räknades i 250 µm2, vilket inkluderade SP, i mitten av CA1-regionen med hjälp av ett bildanalyssystem (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA).

4.9. Immunhistokemi

För att undersöka förändringar i NeuN, TRPV1 och TRPV4 immunreaktivitet i CA1-regionen utfördes allmän immunhistokemi. I korthet, enligt en publicerad metod [34], inkuberades de förberedda hjärnsektionerna med primära antikroppar-mus anti-NeuN (utspädd, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, USA), mus anti-TRPV1 (utspädd, 1:500) (Abcam, Cambridge, Storbritannien) och kanin-anti-TRPV4 (utspädd, 1:500) (Abcam, Cambridge, Storbritannien).

Därefter inkuberades dessa inkuberade sektioner i motsvarande sekundära antikroppar (utspädda, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) och utvecklades med Vectastain ABC (utspädd, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) , USA). Slutligen hade dessa immunreagerade sektioner färg efter visualisering med 3,3'-diaminobensidin.

Antalet NeuN+-celler räknades enligt följande. Digitala bilder av NeuN+celler togs från fem sektioner per gerbil med hjälp av ett ljusmikroskop (AxioM1) (Carl Zeiss, Tyskland).

Cellerna räknades på samma sätt som FJ B+cellantalet. För att utvärdera densiteten av TRPV1+- och TRPV4+strukturer användes motsvarande områden i CA1-regionen i fem sektioner per djur. Bilder av TRPV1+- och TRPV4+strukturerna togs med ett AxioM1-ljusmikroskop (Carl Zeiss) (Tyskland).

Tätheterna för TRPV{{0}} och TRPV4+strukturer utvärderades som den relativa optiska densiteten (ROD). Till detta slut omvandlades bilderna till den genomsnittliga grånivån. ROD presenterades som en procentsats med hjälp av Adobe Photoshop (version 8.0) och programvaran NIH Image J (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.10. Statistisk analys

Vi presenterade data som medel ± standardfel för medelvärdet (SEM). Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av GraphPad Prism (version 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Skillnader i medelvärden mellan de experimentella grupperna analyserades statistiskt genom tvåvägsvariansanalys (ANOVA) med ett post hocBonferronis multipla jämförelsetest för att belysa tFI-relaterade skillnader mellan alla grupper. Statistisk signifikans ansågs vid p < 0. 05.

Författarbidrag: Konceptualisering: M.-HW och T.-KL; Metodik, J.-CL och DWK; Software, H.-IK och MCS; Validering, JHA, IJK och JHP; Utredning, J.-CL, H.-IK och M.CS; Data Curation, JHC, IJK och JHP; Writing-Original Draft Preparation, H.-IK, andJ.-CL; Skriv-granskning och redigering, M.-HW; Tillsyn, S.-SL; Projektadministration, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL och T.-KL Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering: Detta arbete stöddes av Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807) finansierat av National Research Foundation (NRF) i Korea, och av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av utbildningsministeriet (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Uttalande från institutionell granskningsnämnd: Gerbilerna föds upp i experimentdjurscentret vid Kangwon National University (Chuncheon, Korea). För denna studie godkändes det experimentella protokollet (godkännandenr, KW-200113-1; godkännandedatum, 18 februari 2020) av Institutional AnimalCare and Use Committee.

Forskningsprotokollet följde riktlinjerna som föreslås i "CurrentInternational Laws and Policies" i Guide for Care and Use of Laboratory Animals publicerad av The National Academies Press (8:e upplagan, 2011).

Informerat samtycke: Ej tillämpligt.

Datatillgänglighet: De data som presenteras i denna studie är tillgängliga på begäran från motsvarande författare.

Tack: Författarna uppskattar Hyun Sook Kim och Seung Uk Lee för deras tekniska hjälp i denna studie.

Intressekonflikter: Författarna har förklarat att det inte finns någon ekonomisk intressekonflikt.

Förkortningar

CA1: delfält Cornu Ammonis 1; CNS, centrala nervsystemet; CV, kresylviolett; DG, dentat gyrus; FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hypotermi; NeuN, neuronala kärnor; OXC, oxkarbazepin; PAT, passivundvikande test; ROD, relativ optisk densitet; SMA, spontan motorisk aktivitet; SO, stratum oriens;SP, stratum pyramidal; SR, stratum radiatum; tFI, övergående ischemi i framhjärnan; TRPV1, transientreceptorpotential vanilloid typ 1.

Referenser

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MY; Valdes, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Små skillnader i intraischemisk hjärntemperatur bestämmer kritiskt omfattningen av ischemisk neuronal skada. J. Cereb. Blodflödesmetab. 1987, 7, 729-738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Hypotermi som en potentiell behandling för cerebral ischemi. Cerebrovasc. Hjärnmetab. Rev. 1993, 5,277–300.

3. Sjuksköterska, S.; Corbett, D. Neuroskydd efter flera dagar av mild, läkemedelsinducerad hypotermi. J. Cereb. Blodflödesmetab. 1996, 16,474–480. [CrossRef]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Uppdatering av de prekliniska rundabordsrekommendationerna för stroketerapi, akademisk industri. Stroke 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Terapeutisk hypotermi: Neuroprotektiva mekanismer. Främre. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Terapeutisk hypotermi för akut stroke. Int. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Terapeutisk hypotermi vid akut stroke. J. Neurosci. Sjuksköterskor. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Terapeutisk hypotermi vid akut ischemisk stroke. Neurosurg. Fokus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Genomförbarhet och säkerhet för måttlig hypotermi efter massiv hemisfärisk infarkt. Stroke 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. Reglerad hypotermi minskar oxidativ stress i hjärnan efter hypoxisk ischemi. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Farmakologisk hypotermi: En potential för framtida stroketerapi? Neurol. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Neuroprotektiva effekter av läkemedelsinducerad terapeutisk hypotermi vid sjukdomar i centrala nervsystemet. Curr. Drug Targets 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Antiepileptika som en möjlig neuroprotektiv strategi i hjärnans ischemi. Ann. Neurol. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS Antiepileptika vid pediatrisk traumatisk hjärnskada. Expert Rev Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com