Immungenuttryck och funktionella nätverk i distinkta lupusnefritklasser Ⅱ
Nov 08, 2023
RESULTAT
Karakterisering av kohorten
Från vårt arkiveradeFFPE njurbiopsier, identifierade vi 55 LN-biopsier innehållande tillräcklig vävnad för analys. Biopsier kom från kvinnliga patienter och bestod av klass III (n=11), klass IV (n=23) och klass V (n=21) LN-biopsier. Endast klass III och IV LN-biopsier med aktiva lesioner inkluderades (dvs. A eller A/C men inte C). Vi använde TBM-sjukdom (n=14) som kontroller. Vi jämförde också klass V LN med MN (n=9) givet tydliga histologiska likheter på ljusmikroskopi men olika etiologier. Demografiska, kliniska och biopsidata visas i tabell 1. Biopsiåldern varierade från under 1 år till över 11 år. Aktiva glomerulära lesioner, glomerulära halvmånar och nekros var närvarande i klass III och IV men inte klass V LN-biopsierna. Glomerulär trombos identifierades endast i en klass III-biopsi. Tubupartikulära inneslutningar (TRI) identifierades i de flesta biopsier av klass III (91 %), klass IV (78 %) och klass V (81 %). IFTA var lågt i alla klasser.Serum kreatininoch urinprotein:kreatininförhållandet var högre i klass IV jämfört med antingen klass III eller klass V LN (tabell 1, online tilläggsfigur 1A och B). Serumalbumin reducerades i alla klasser i förhållande till TBM (tabell 1, kompletterande online-figur 1B). Komplementen C3 och C4 reducerades signifikant i både klass III och klass IV jämfört med klass V LN (tabell 1, tilläggsfigur 1C online).
KLICKA HÄR FÖR ATT FÅ växtbaserade formuleringar av CISTANCHE FÖR NJURE
Analys av immungenexpression i LN-njurbiopsier
Vi jämförde först genuttryck mellan alla LN-klasser och TBM-prover och identifierade 171 (159 ökade och 12 minskade) differentiellt uttryckta gener (figur 1A, kompletterande onlinedata S3). Väganalyser visade att typ I IFN-signalering var mycket berikad i LN över kontroller förutom JAK-STAT-signalering, komplementkaskad, MHC II, Integrinbindning, NF-KB och apoptosvägar (figur 1B, kompletterande onlinedata S4 och S5). Hierarkisk klustring med transkript med en log2-vikningsändring (FC) större än eller lika med 1 (n=49) eller Mindre än eller lika med −0.5 (n=5) över hela kohorten avslöjade tre huvudkluster (figur 1C). Från vänster till höger i figur 1C, grupp 1 innehöll endast LN-prover (n=16), grupp 2 innehöll alla utom ett av TBM-proverna (n=13TBM, n=3LN) och grupp 3 var LN-dominant (n=36LN vs n=1TBM). Som rapporterats,16 fanns det inget tydligt samband mellan molekylära kluster och histologiska LN-klasser (figur 1C).
Jämförelse av klass V LN och idiopatisk MN
Den histologiska lesionen i klass V LN är en diffus membranösglomerulopatimed likheter med idiopatisk MN. När vi jämförde klass V LN med MN-prover fanns det 26 (23 högre och 3 lägre uttryck) differentiellt uttryckta gener (figur 2A, kompletterande onlinedata S6). Den översta anrikningstermen var typ I IFN-signalering (figur 2B, kompletterande onlinedata S4 och S7). En kärnuppsättning av 67 typ I IFN-associerade gener är uppreglerad över leukocytundergrupper (neutrofiler, CD4- och CD8-positiva T-celler, monocyter) i SLE.24 Vår panel innehöll prober som riktade sig till 17 av dessa gener och 13 av de 23 transkripten med högre uttryck var en del av denna kärnuppsättning, vilket indikerar att typ I IFN-signaturen är en nyckelmolekylär skillnad mellan klass V LN och MN.
Figur 1 DGE i LN jämfört med TBM-sjukdom. (A) Vulkanplot som visar DGE av LN (n=55 biopsier) vs TBM-sjukdom (n=14 biopsier). Benjamini-Hochberg justerade p=0.05 och log2 FC cut-off=0.5. (B) STRING-interaktionsnätverk för alla 171 signifikanta differentiellt uttryckta gener mellan LN och TBM (högsta konfidenspoäng=0.9). Röda noder—typ I IFN; blå noder— komplementkaskad; rosa noder—MHC II; gula noder—JAK-STAT-signalering; lila noder—integrinbindning; ljusgröna noder—NF-KB+TIR-domän; mörkgröna noder—NF-KB och apoptosmodulering. (C) Värmekarta över alla signifikant ökade differentiellt uttryckta transkript med log2 FC större än eller lika med 1 (n=49) och alla signifikant nedreglerade transkript med log2 FC mindre än eller lika med -0,5 (n=5 ) identifieras i LN vs TBM, över hela kohorten (LN n=55 biopsier, MN n=9 biopsier, TBM n=14 biopsier). DGE, differentiellt genuttryck; FC, veckbyte; LN, lupus nefrit; MN, membranös nefropati; NS, icke-signifikant; TBM, tunt basalmembran.
Hierarkisk klustring med hjälp av de 17 typ I IFN-associerade transkripten separerade LN från både MN- och TBM-proverna (figur 2C). Andelen LN-biopsier i det IFN-positiva klustret (n=48, 87 %) var signifikant större än det i det IFN-negativa klustret (n=7, 13 %, p<0.0001, Fisher exact test). Within the IFNpositive cluster, the next hierarchy contained two clusters, with higher or lower IFN expression. The proportion of class V LN samples in the cluster with lower IFN expression (n=14, 74%) was significantly greater than that in the cluster with higher IFN expression (n=5, 26%, p=0.0009, Fisher exact test). TRIs in glomerular endothelial cells is frequent in LN and related to the type I IFN response. TRIs were present in 45 out of 54 LN biopsies (83%, data unavailable for one biopsy) and of the 47 biopsies in the IFN-positive cluster, 89% (n=42) had TRIs (figure 2C). We measured the blood type I IFN signature in 25 (46%) of the 55 patients with LN. A high blood IFN score was present in 13 (62%) of the 21 patients within the renal biopsy IFN-positive cluster and 1 of the 5 (20%) of patients within the renal biopsy IFN-negative cluster. There were no significant differentially expressed genes between MN and TBM samples (online supplemental figure 2, online supplemental data S15).
Genuttrycksanalys inom de histologiska LN-klasserna
Vi utförde sedan DGE (figur 3A–C) och väganalys (online kompletterande figur 3 och online kompletterande data S4, S16–S18) för varje LN-klass. Jämfört med TBM-sjukdom fanns det i klass III LN 63 differentiellt uttryckta gener (60 ökade och 3 minskade, figur 3A, kompletterande onlinedata S8); i klass IV LN 205 differentiellt uttryckta gener (189 ökade och 16 minskade, figur 3B, online kompletterande data S9) och i klass V LN 95 differentiellt uttryckta gener (92 ökade och 3 minskade, figur 3C, online kompletterande data S10). Det fanns 52 signifikanta differentiellt uttryckta gener gemensamma över klasser (figur 3D, kompletterande onlinetabell 2) och väganalys visade anrikning för typ I IFN-signalling, komplement och MHC II-vägar (figur 3E, kompletterande onlinedata S4 och S11). FC var högre i klass IV för alla 52 gener jämfört med klass V och för 85% av generna jämfört med klass III (online tilläggstabell 2).
Jämfört med TBM-sjukdom fanns det 105 gener som uttrycktes signifikant differentiellt i klass IV men inte i vare sig klass III eller V LN-biopsier (figur 3D). Väganalys visade anrikning för NF-KB-signalering och Toll-IL1--resistensdomän, positiv reglering av reaktiva oxidativa species (ROS) metaboliska processer och positiv reglering av peptidasaktivitetsvägar (figur 3F, kompletterande onlinedata S4 och S12 ). När vi plottade effektstorlekarna för alla 205 signifikant differentiellt uttryckta klass IV-transkript med respektive effektstorlekar för klass III (figur 3G) och klass IV (figur 3H) LN. de flesta förändringarna var överensstämmande. Detta indikerade att endast ett litet antal transkript i vår datauppsättning var unikt differentiellt reglerade i klass IV LN-biopsier (dvs. där signifikanta effektstorlekar i klass IV LN-transkript hade låg eller noll effektstorlekar i antingen klass III eller klass IV LN).
För att utforska skillnader mellan proliferativ och membranös LN jämförde vi klass IV med klass V LN. Detta visade 179 (167 högre och 12 lägre uttryck) differentiellt uttryckta gener i klass IV (figur 4A, kompletterande onlinedata S13). Väganalys visade anrikning för typ I IFN-signalering, JAK-STAT-signalering, komplementkaskad, MHC II, Integrinbindning, NF-KB och apoptosvägar (figur 4B, kompletterande onlinedata S4 och S14). Medan de flesta av dessa vägar också identifierades i vår enda underklassanalys av klass IV och V jämfört med TBM-sjukdom (online kompletterande figur 3BC), observerade vi en ytterligare signifikant uppreglering och anrikning för dessa vägar i klass IV i förhållande till klass V ( figur 4B).
Figur 4 Differentiellt genuttryck mellan klass IV och klass V LN. Vulkanplottar som visar differentiellt genuttryck (DGE) av klass IV (n=23 biopsier) vs klass V (n=21 biopsier). Benjamini-Hochberg justerade p=0.05 och log2 FC cut-off=0.5. (B) STRING-interaktionsnätverk för 167 signifikanta differentiellt uttryckta gener med uttryck högre i klass IV jämfört med klass V (högsta konfidenspoäng=0.9). Röda noder—typ I IFN; blå noder—komplementkaskad; rosa noder—MHC II; gula noder—JAK-STAT-signalering; lila noder—integrinbindning; ljusgröna noder—NF-KB+TIR-domän; mörkgröna noder—NF-KB och apoptosmodulering. FC, veckbyte; LN, lupus nefrit; NS, obetydlig.
Jämfört med TBM-sjukdom fanns det 105 gener som uttrycktes signifikant differentiellt i klass IV men inte i vare sig klass III eller V LN-biopsier (figur 3D). Väganalys visade anrikning för NF-KB-signalering och Toll-IL1-resistensdomän, positiv reglering av metaboliska processer för reaktiva oxidativa arter (ROS) och positiv reglering av peptidasaktivitetsvägar (figur 3F, kompletterande onlinedata S4 och S12) . När vi plottade effektstorlekarna för alla 205 signifikant differentiellt uttryckta klass IV-transkript med respektive effektstorlekar för klass III (figur 3G) och klass IV (figur 3H) LN. de flesta förändringarna var överensstämmande. Detta indikerade att endast ett litet antal transkript i vår datauppsättning var unikt differentiellt reglerade i klass IV LN-biopsier (dvs. där signifikanta effektstorlekar i klass IV LN-transkript hade låg eller noll effektstorlekar i antingen klass III eller klass IV LN).
För att utforska skillnader mellan proliferativ och membranös LN jämförde vi klass IV med klass V LN. Detta visade 179 (167 högre och 12 lägre uttryck) differentiellt uttryckta gener i klass IV (figur 4A, kompletterande onlinedata S13). Väganalys visade anrikning för typ I IFN-signalering, JAK-STAT-signalering, komplementkaskad, MHC II, integrinbindning, NF-KB ochapoptosvägar(figur 4B, kompletterande onlinedata S4 och S14). Medan de flesta av dessa vägar också identifierades i vår enda underklassanalys av klass IV och V jämfört med TBM-sjukdom (online kompletterande figur 3BC), observerade vi en ytterligare signifikant uppreglering och anrikning för dessa vägar i klass IV i förhållande till klass V ( figur 4B).
DISKUSSION
Vår studie och andra16 18 19 har visat möjligheten att använda NanoString-teknik för att kvantifiera transkriptionsuttryck påFFPE njurbiopsivävnadoch anmärkningsvärt nog var detta möjligt med biopsier som var upp till 11 år gamla. Detta tillvägagångssätt har potentiell klinisk användbarhet eftersom FFPE-vävnad är en integrerad komponent i den diagnostiska njurbiopsivägen. I vår jämförelse av LN med TBM-sjukdom identifierades 36 signifikanta STRING-nätverkskluster, med de 10 bästa termerna som involverade NF-KB (översta 6 STRING-kluster, 8 av totalt 36) eller IFN alfa/beta-signalering (6 av 36 STRING-kluster) . Komplement var också högt representerat (6 av 36 STRING-kluster). I enlighet med publicerade data kunde vi detektera en typ I IFN-signatur över alla tre LN-klasserna.16 Denna IFN-associerade transkriptomiska signatur var så väl representerad i LN att den tydligt skilde mellan klass V LN och MN, trots deras slående morfologiska likheter. Intressant nog fanns det inga signifikant ökade transkript när vi jämförde MN med TBM.
Den molekylära profilen för LN studerades först med hjälp av laserfångade glomeruli från frusen vävnad från patienter med proliferativ LN (klass III och IV).17 Fyra genkluster som identifierar B-celler, ett typ I IFN-svar, myeloid härstamning och produktion av extracellulärt matrisen beskrevs. Noterbart var det markant heterogenitet mellan biopsier (vilket kan vara av både tekniska och biologiska skäl) och ingen distinkt profil mellan klass III och IV biopsier. I en studie som inkluderade proliferativ, blandad och klass V LN och som analyserade de glomerulära och tubulointerstitiella avdelningarna separat, korrelerade inte mängden RNA-transkript med vare sig histologisk klass eller National Institute of Health aktivitet och kronicitetsindex.16 På liknande sätt, i en studie av 28 parade biopsier från 14 patienter med LN, utvärderade med hjälp av en NanoString-immunpanel analog med vår studie, fanns det inga distinkta kluster när RNA-transkriptförekomsten analyserades från antingen glomerulära eller tubulointerstitiala fack.18 En stor styrka i vår studie var urval av väldefinierade klass III, IV och V biopsier utan blandade lesioner. Trots detta tillvägagångssätt, och i överensstämmelse med studierna som beskrivs ovan, kunde vi inte detektera en distinkt transkriptomisk signatur för varje histologisk subtyp.
Vi identifierade dock 52 differentiellt uttryckta gener i alla tre LN-klasser. STRING-analys visade anrikning för IFN-signalering, MHC II och klassisk antikroppsmedierad komplementaktivering. FC i klass IV LN var högre för de flesta av dessa gener i jämförelse med antingen klass III eller V. Det är anmärkningsvärt att det intrarenala uttrycket av IFN-associerade gener påverkas av sjukdomsutbrott och behandling, med MX1, STAT1 och IRF7 alla uppreglerade vid flare och reducerad eller ytterligare förhöjd i efterbehandlingsbiopsi av behandling respektive icke-reagerande. 19 I denna och vår analys var det inte möjligt att bestämma bidragen från IFN-svaret från bosatta glomerulära endotelceller och från infiltrerande leukocyter, signalen från de senare var mer sannolikt att påverkas av antiinflammatorisk terapi. Vi identifierade 105 signifikant differentiellt uttryckta gener i klass IV LN där alla identifierade STRING anrikningskluster var involverade i NF-KB och apoptos. Ackumulerande bevis implicerar NF-KB i patogenesen av LN inklusive podocytskada,25 och NF-KB-medierat cytokinuttryck har framhävts i icke-svar. 19 Varianter av flera gener i TLR/NF-KB-signalering är associerade med LN, inklusive TLR 3/7/9, MYD88, IRAK1, TNFAIP3 och TNIP1, 26 men detta är första gången som NF-KB har tillskrivits klass IV LN. VCAM-1 har föreslagits som en LN-aktivitetsbiomarkör27 med ett ökat uttryck mellan initial och flare biopsi18 och förmågan att skilja klass IV från andra klasser. I överensstämmelse observerade vi endast en signifikant höjning i vår studie i klass IV LN. Vår klass IV-analys lyfte också fram regleringen av ROS-metaboliska processer, som har rapporterats ha en roll i SLE.21 CYBB, genen som kodar för betakedjan av cytokrom-245, en underenhet av NADPH-oxidasenzymkomplexet , och M2 makrofagmarkören CD163 ökade i alla klasser men mest markerade i klass IV. CD163 har föreslagits som en urinbiomarkör för aktivitet i LN.18 Närvaron av typ I IFN-signalering har associerats med mitokondriell abnormitet, vilket leder till mitokondriell insufficiens och ökad celldöd som en reglerande mekanism vid ihållande typ I IFN-svar.21 det har visats i djurmodeller att förändrad metabol dysfunktion är en reversibel förändring i lupuspåverkade vävnader, inte driven av exponering för typ I IFN och korrekt modulering kan återställas efter immunsuppression i djurmodeller.28 Vi observerade ett liknande STRING-interaktionsnätverk i vår klass IV vs klass V och vår klass IV kontra TBM-analys. Om man jämför de två, är 71,4% (135 av 189) av generna som identifierats i förhållande till TBM också signifikant högre när man jämför klass IV med klass V, med vägar berikade för typ I IFN-signalering, JAK-STAT-signalering, komplementkaskad, MHC II, Integrinbindning, NF-KB och apoptos. Av detta kan vi dra slutsatsen att den immunologiska anrikningen i klass IV LN är signifikant uppreglerad från vår sjukdomskontroll (TBM-biopsierna) och från klass V LN.
Explorativ analys identifierade osteopontin (OPN/SPP1), fibronektin (FN1) och galectin-3 (LGALS3) som gener av intresse med avseende på lupussjukdomsaktivitet.16 FN1 har också kopplats till flare.18 I vår studie, LGALS3 uttrycktes inte nämnvärt. FN1 var dock signifikant i både klass IV och V. OPN var signifikant endast i klass IV, en observation som inte gjordes i den ursprungliga studien. OPN föreslogs som en kandidatmarkör för aggressivt och proliferativt LN16 och har associerats med hypercellularitet, cellulär proliferation och halvmånebildning i murint LN.29 Ett huvudmål med vår studie var att tillhandahållahela njurens transkriptomiska profilerför klass III, IV och V LN med syftet att identifiera molekylära vägar och inflammatoriska molekyler som kan riktas mot terapi. Även om vi inte identifierade nya vägar för målinriktning i LN, ger det nyliga godkännandet av anifrolumab, en human monoklonal blockerande antikropp mot typ I IFN-receptorsubenhet 1, för lupusbehandling en möjlighet att förstå hur den intrarenala IFN-signaturen kan påverka svaret. Komplementhämning kan också vara en potentiell terapi vid LN och att använda njurkomplementmarkörer, såsom att kombinera komplementimmunfärgning och transkriptomiska profiler, kan vara en metod för att välja patienter för proof of concept-studier.30
Vår studie har viktiga begränsningar. Den transkriptomiska analysen var begränsad till de 750 transkripten som förhördes av vår NanoString-panel. Emellertid valdes panelen ut för sin förmåga att förhöra immun- och inflammationsrelaterade transkript som helt klart är av stor betydelse för att förstå den molekylära patogenesen av LN. Vi använde hela njurvävnadssnitt snarare än att separera glomerulär och tubulointerstitiell vävnad, så vi kunde inte skilja uttryck från olika njurkompartment. Att använda hel vävnad har fördelen av att vara det mest tekniskt genomförbara tillvägagångssättet experimentellt och mest praktiskt för nedströms klinisk tillämpning. Detta var en retrospektiv studie och därför var behandlingsmetoderna heterogena. Vi begränsade våra biopsier till väldefinierade klass III, IV och V lesioner utan betydande ärrbildning för att stärka vår förmåga att upptäcka skillnader mellan klasserna. Hur signalerna skulle påverkas av blandade lesioner eller lesioner med kroniska skador (t.ex. arterioskleros, IFTA och glomeruloskleros) skulle behöva studeras ytterligare.
Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit en hel njursektions transkriptomisk analys av klass III, IV och V LN-biopsier med användning av en panel av immun- och inflammationsgensonder. Vi identifierade vägar som är gemensamma för alla tre klasserna och karakteriserade vägar som endast var signifikant modulerade i våra klass IV-biopsier. Eftersom mer riktade behandlingar utvecklas för LN, kan det vara möjligt att använda transkriptomisk analys för att informera om val av behandling.
Tack Vi vill tacka våra patientmedarbetare för deras engagemang i MASTERPLANS-konsortiet (https://sites.manchester.ac.uk/ masterplans/). Vi vill också tacka James E. Peters för hans hjälp med kodning, statistiska råd och stöd. Vi tackar University College London Nanostring Facility. Vi erkänner stöd från National Institute for Health Research Biomedical Research Centre baserat på Imperial College Healthcare National Health Service Trust och Imperial College London och från National Institute for Health Research Clinical Research Network. INB är ett National Institute for Health Research (NIHR) Senior Investigator Emeritus och finansieras av NIHR Manchester Biomedical Research Centre.
Bidragsgivare ACG utförde experimenten, analyserade data och var med och skrev manuskriptet. HRW gav hjälp med provtagning och klinisk fenotypning. HTC tillhandahöll expertis inom njurpatologi. MB, LL, TDC och INB gav hjälp med den kliniska fenotypningen och datatolkningen. MCP övervakade projektet och var med och skrev manuskriptet och är garant.
Finansiering Detta arbete finansierades av Medical Research Council, anslag MR/M01665X/1, "Maximering SLE Therapeutic Potential by Application of Novel and Systemic Approaches and the Engineering (MASTERPLANER)".
Ansvarsfriskrivning De åsikter som uttrycks är författarnas och inte nödvändigtvis de från National Health Service, National Institute for Health Research eller Department of Health.
Konkurrerande intressen Inga deklarerade.
Patientmedgivande för publicering Ej tillämpligt.
Etiskt godkännande Etiskt godkännande erhölls genom Imperial College Tissue Bank: MREC 12/WA/0196, Projekt: R16063. Deltagarna gav informerat samtycke till att delta i studien innan de deltog.
Proveniens och referentgranskning Ej beställd; externt peer-reviewed.
Datatillgänglighetsförklaring Data är tillgänglig på rimlig begäran. All data som är relevant för studien ingår i artikeln eller laddas upp som kompletterande information. Data tillhandahålls i den kompletterande excel-filen. Rådatafiler finns tillgängliga på begäran.
REFERENSER
1 Gasparotto M, Gatto M, Binda V, et al. Lupus nefrit: kliniska presentationer och resultat under 2000-talet. Reumatologi 2020;59:v39–51.
2 Hoover PJ, Costenbader KH. Insikter i epidemiologi och hantering av lupus nefrit ur den amerikanska reumatologens perspektiv. Kidney Int 2016;90:487–92.
3 Fanouriakis A, Kostopoulou M, Cheema K, et al. 2019 års uppdatering av den gemensamma europeiska ligan mot reumatism och European Renal Association–European Dialysis and Transplant Association (EULAR/ERA–EDTA) rekommendationer för hantering av lupus nefrit. Ann Rheum Dis 2020;79:713–23.
4 Moroni G, Vercelloni PG, Quaglini S, et al. Förändrade mönster i klinisk-histologisk presentation och njurresultat under de senaste fem decennierna i en kohort av 499 patienter med lupus nefrit. Ann Rheum Dis 2018;77:1318–2
5. 5 Weening JJ, D'Agati VD, Schwartz MM, et al. Klassificeringen av glomerulonefrit i systemisk lupus erythematosus återupptogs. J Am Soc Nephrol 2004;15:241–50.
6 Bajema IM, Wilhelmus S, Alpers CE, et al. Revision av klassificeringen av International Society of Nephrology/Renal Pathology Society för lupus nefritis: förtydligande av definitioner och modifierade National Institutes of Health aktivitets- och kronicitetsindex. Kidney Int 2018;93:789–96.
7 Haring CM, Rietveld A, van den Brand JAJG, et al. Segmentella och globala underklasser av klass IV lupus nefrit har liknande njurresultat. J Am Soc Nephrol 2012;23:149–54.
8 Austin HA, Muenz LR, Joyce KM, et al. Diffus proliferativ lupusnefrit: identifiering av specifika patologiska egenskaper som påverkar njurresultatet. Kidney Int 1984;25:689–95.
9 Dall'Era M, Cisternas MG, Smilek DE, et al. Prediktorer för långsiktigt njurresultat i försök med lupus nefrit: lärdomar från Euro-Lupus nefrit-kohorten. Artrit Rheumatol 2015;67:1305–13.
10 Moroni G, Gatto M, Tamborini F, et al. Brist på EULAR/ERA-EDTA-svar efter 1 år förutsäger dåliga långsiktiga njurresultat hos patienter med lupusnefrit. Ann Rheum Dis 2020;79:1077–83.
Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Handla för fler specifikationer:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
