Immunstimulerande aktivitet av vatten extraherbara polysackarider från Cistanche Deserticola som växtadjuvans in vitro

För mer information:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Key Lab of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang, Kina,

2 Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, Kina,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, Kina

Abstrakt

Ett säkert och effektivt vaccinadjuvans är viktigt i moderna vacciner. Olika kineserväxtbaserade polysackariderkan aktivera immunförsvaret.Cistanche deserticola(CD) är en traditionell kinesisk ört och en adjuvanskandidat. Här bekräftade vi detvattenextraherande polysackariderav CD (WPCD) kunde modulera immunsvar in vitro och in vivo. På ett dosberoende sätt främjade WPCD avsevärt mognaden och funktionen av murina märghärledda dendritiska celler (BM-DC) genom att uppreglera uttrycksnivåerna av MHC -II, CD86, CD80 och CD40, allogen T-cellsproliferation och utbytena av IL-12 och TNF- via toll-like receptor4 (TLR4), vilket indikeras av in vitro-experiment. Dessutom observerades dess immunmodulerande aktivitet även hos möss. WPCD förbättrade effektivt titrarna för IgG, IgG1 och IgG2a och ökade markant proliferationen av T- och B-celler, produktionen av IFN- och IL-4 i CD4 plus T-celler och uttrycksnivån för IFN- i CD8 plus T-celler bättre än alun. Dessutom kunde WPCD markant uppreglera uttrycksnivåerna för CD40 och CD80 på DCs i mjälten och nedreglera Treg-frekvensen. Studien tyder på att polysackarider av Cistanche deserticola är ett säkert och effektivt vaccinadjuvans för att framkalla både humoral immunitet och cellulär immunitet genom att aktivera DCs via TLR4-signalvägen.

Klicka för att Cistanche stamprodukter

Introduktion

Vacciner är viktiga för att kontrollera eller förebygga sjukdomar. Nygenererade och nuvarande utvecklande vacciner är höggradigt renade rekombinantaantigenermed högre säkerhet, men renade antigener kan inte stimulera en tillfredsställandeimmunsvarjämfört med försvagade eller inaktiverade patogenpreparat. Med hjälp av adjuvans kan vacciner inducera persistentimmunsvar[1,2]. Nya kraftfulla adjuvans är allmänt bekymrade i både vaccinutveckling och människors hälsa. Hittills har olika adjuvans identifierats och studerats omfattande. Dessa adjuvans ger vacciner flera fördelar, inklusive att minska den erforderliga mängden antigener, minimera antalet immuniseringar som krävs för normala immunsvar och inducera snabbare, bredare och starkareimmunsvar[3–5]. Även om många potenta adjuvans har utvecklats, såsom lipopolysackarid (LPS) och Freunds kompletta adjuvans (FCA), används de inte i stor utsträckning på grund av deras toxicitet. Därför är endast ett fåtal adjuvans, såsom alun, licensierade för klinisk användning [6]. Sammantaget bör effektivare och säkrare adjuvans utvecklas för att främja bättre profylaktiska och terapeutiska vacciner mot infektionssjukdomar och icke-infektionssjukdomar.

Säkerhet är en viktig faktor vid utvecklingen av adjuvanser. Kinesiska örtartade beståndsdelar inkluderar näringsämnen och viktiga aktiva kompositer, såsom fenolföreningar och polysackarider, som kan fungera som kraftfulla immunstimulerande medel [7–9]. Bland dem har polysackarider från traditionella kinesiska örter utforskats brett på grund av deras immunstimulerande aktiviteter och låga toxicitet. Till exempel är inulin ett immunadjuvans utan toxiciteten hos andra adjuvanser såsom FCA. AdvaxTM delta-inulinadjuvans har också framgångsrikt förbättrat immunogeniciteten hos vacciner [10,11]. Astragalus, även känd som Huangqi på kinesiska och Radix Astragali på latin, är brett spridd över hela världen. Polysackarid är en av dess viktigaste aktiva ingredienser som ansvarar för den immunmodulerande aktiviteten. Experimentella studier har visat att Astragalus polysackarid hade starka immunmodulerande effekter både in vitro och in vivo [12, 13]. Lycium barbarum polysackarider som vaccinadjuvans visade också goda förbättringar och stimulerande effekter [14, 15]. Dessa studier antydde att kinesiska växtbaserade polysackarider var idealiska kandidater för utveckling av adjuvans.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, "Rou Cong Rong" på kinesiska) är en värdefull traditionell kinesisk ört och vanligen betraktad som "öknarnas ginseng" på grund av dess överlägsna toniska effekter. Den är distribuerad i torra eller halvtorra regioner i Xinjiang. I Kina har dess torkade köttiga stjälk använts som stärkande föda i hundratals år [16, 17]. Under många år har kokt CD använts som en styrkande föda för att behandla överbelastningsinducerad funktionsnedsättning, vilket tyder på att det är säkert för oral administrering. Denna växt är allmänt oroad på grund av dess breda medicinska funktioner. Nyligen genomförda fytokemiska och farmakologiska studier visade att polysackarider var de huvudsakliga biologiskt aktiva komponenterna och hade olika biologiska effekter, inklusive immunmodulerande aktivitet, antioxidanteffekt och antiinflammatoriska effekter [18–21]. Den immunförstärkande aktiviteten hos vattenextraherbara polysackarider från C. deserticola i Xinjiang rapporterades dock sällan.

Det är välkänt att DC är viktiga antigenpresenterande celler (APC) som tillhandahåller signaler som krävs för att initiera immunsvar och modulera medfödda och adaptiva celler. Vissa adjuvanser som förbättrar antigenupptaget av DC kan öka samstimulerande eller MHC-molekyler och förbättra immuniteten. När DCs mognad börjar produceras fler samstimulerande molekyler och cytokiner och DCs visar distinkta fenotyper [22, 23].

I denna studie utnyttjade vi först om WPCD kunde främja aktivering av DCs viaTLR4-signalväg in vivo. Eftersom DCs var länken mellan medfödda och adaptiva immunsvar, antog vi att DCs aktivering stimulerad av WPCD skulle påverka resultatet av adaptiv immunitet. Vi undersökte det specifika immunsvaret mot ovalbumin (OVA) hos möss behandlade med WPCD, inklusive titrar av IgG, IgG1 och IgG2a underklass, T- och B-proliferation, och produktionen av cytokin. Vi undersökte om WPCD-behandling skulle öka aktiviteten hos DCs och Treg-celler i mjälten hos dessa möss. Våra resultat bevisade den potentiella immunmodulerande aktiviteten hos naturliga polysackarider från C. deserticola och utökade dess tillämpningsområde

Material och metoder

Djur

Åtta till tio veckor gamla C57BL/6, BALB/c eller ICR honmöss köptes från FirstHospital vid Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina). Mössen hölls under patogenfria förhållanden enligt riktlinjerna från Animal Care and Use Committee (ACUC) vid Xinjiang University for Animal Health and Wellbeing. Djurförsöksprocedurerna hade godkänts av AUCC vid Xinjiang University.

Extraktion av vattenhaltiga extrakt

C. deserticola är en växt i Xinjiang-provinsen i Kina. Den råa polysackariden erhölls genom vattenextraktion och etanolfällning. Kortfattat maldes 100 g torkad C. deserticola till pulver och filtrerades sedan. Pulvret återloppskokades med petroleumeter vid rumstemperatur upprepade gånger och återloppskokades sedan med vattenfri etanol under 1 timme för att avlägsna färgade ingredienser och lipider. Återstoder extraherades med kokande vatten tre gånger och extrakten slogs samman, centrifugerades vid 4000 rpm i 10 minuter och återloppskokades vid 60˚C i 4 timmar. Fyra gånger volymer av 95 procent etanol sattes till lösningen för att fälla ut orena polysackarider. De råa polysackariderna återupplöstes i destillerat vatten och behandlades med Savage-reagens för att avlägsna proteiner. Extrakten löstes i PBS och steriliserades genom 0,22-μm-filtret. Slutligen var den totala sockerhalten i WPCD 59,58 procent, vilket framgår av fenol-svavelsyraanalysen [24].

Generering av DC

BM-DC genererades enligt den tidigare beskrivna metoden med små modifieringar [25]. Benmärgs-DC från C57BL/6-möss spolades ut med RPMI-1640 komplett medium (Gibco) kompletterat med 10 procent fetalt kalvserum (Hyclone). De uppsamlade cellerna återsuspenderades i RPMI-1640-medium med 50 μM -merkaptoetanol (Sigma, St Louis, MO) och 20 ng/mL murin GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) och inkuberades vid 37˚ C i 5 procent CO2-atmosfär. Hälften av odlingsmediet ersattes med ett färskt medium innehållande GM-CSF var 1-2 dag. Celler samlades in på dag 6, behandlades med olika doser av WPCD, LPS (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) under 24 timmar och bedömdes sedan med flödescytometri.

Detektion av mognad av DC och T-cellsaktivering in vitro

In vitro-mognadseffekten av WPCD på BM-DCs utvärderades baserat på fenotypiska analysresultat av FAC. På dag 7 inducerades BM–DC från C57BL/6 i närvaro av GM-CSF och behandlades sedan med olika koncentrationer av WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0,05, 0,1 och 0,2 mg/ml) i 12 timmar i tre exemplar. LPS (100 ng/ml) användes som en positiv kontroll. Efter att BM-DC tvättats i PBS och Fc Block (BD Biosciences, CA) användes för att förhindra ospecifik antikroppsbindning, färgades celler i PBS genom att använda lämplig FITC-, PE- eller APC-konjugerad CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 och MHC-II antikroppar (BD) i 20 minuter vid 37˚C. De färgade cellerna detekterades av FACs Calibur (BD). Dataanalysen utfördes med programvaran FlowJo (Tree Star).

I DCS-mognadsexperimentet in vitro samlades även cellkultursupernatanter för att analysera IL-12 och TNF- genom att använda cytokinanalyssatser (Boster, Wuhan, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Absorbansen vid 450 nm mättes med en ELISA plattläsare (Bio-Rad, USA). Cytokinkvantiteter i proverna beräknades med standardkurvor för rekombinanta cytokiner enligt den linjära regressionsmetoden.

För att testa deras allogena stimulerande aktivitet utfördes experimentet med blandad lymfocytreaktion (MLR) enligt den tidigare metoden [26] med MTT (Sigma, St Louis, MO) analys. Kortfattat återvanns BM-DC från C57BL/6-möss som användes som stimulatorceller på dag 7 i RPMI-1640-medium plus GM-CSF och behandlades med olika koncentrationer av WPCD i 12 timmar vid 37˚C. Celler tvättades och återsuspenderades i RPMI-1640-medium innan de ströks ut på 24-brunnsplattan. Singleplenocytsuspension som svarsceller isolerades från BALB/c-möss. BM-DC blandades med splenocyter enligt förhållandena 1:5 och 1:10. Celler odlades vid 37˚C i en 5-procentig CO2-atmosfär under tre dagar i tre exemplar. LPS-behandling användes som en positiv kontroll. Kulturer tillsattes därefter med 20 μL MTT för den sista 4-h odlingen. Absorbanserna vid mätvåglängden (490 nm) och referensvåglängden (650 nm) mättes för T-cellsproliferationsanalys. Alla prover mättes mot en bakgrundskontroll.

Behandling med TLR4-hämmare in vitro

BM-DCs förbehandlades med 5 μM TAK-242 (hämmare av TLR4, Medchemexpress Inc.USA) i 1 timme och samodlades sedan med olika koncentrationer av WPCD (100 och 200 ug/ml) i 12 timmar i närvaro eller frånvaro av Golgi Stop i tre exemplar. I den positiva kontrollen tillsattes LPS. Celler och supernatanter detekterades av FAC för analys av ytmarkörer CD86och CD40 och med ELISA för analys av cytokinerna TNF-a respektive IL-12.

Immuniseringsprotokoll

Akut toxicitetstest. I det orala akuta toxicitetstestet i denna studie användes 40 friska vuxna ICR-möss. ICR-möss fastade (mat men inte vatten över natten) före dosering. WPCD administrerades oralt i doser på 0, 50, 500 respektive 5000 mg/kg kroppsvikt till varje djur under 7 dagar. Saltlösningsbehandlade och alunbehandlade möss inkluderades i kontrollgruppen. Djuren observerades dagligen inom 14 på varandra följande dagar. Mössen observerades individuellt för att registrera dödlighet och kliniska tecken. Dessutom mättes kroppsvikter och deras mat- och vattenförbrukning under hela experimentet. På dag 14 beräknades mjält- eller tymusindex som (mjälte eller tymusvikt/kroppsvikt) × 10.

Detektion av WPCD-immunmodulerande aktivitet in vivo. För att undersöka om WPCD hade den immunmodulerande aktiviteten användes ovalbumin (OVA) (Sigma) som modellantigen och ICR-honmöss separerades slumpmässigt i 7 grupper (negativ kontrollgrupp (0,9 procent NaCl och WPCD 400 ug) och den positiva kontrollen (alun 200 ug med OVA)). Mössen administrerades subkutant två gånger med enbart 10 ug OVA eller WPCD med OVA enligt dosen 20, 100 eller 400 ug med ett 2-veckorsintervall. Blodprover och mjälte erhölls efter boostervaccinationen för att detektera IgG-titrar, IgG-underklasserna, splenocytproliferation och cytokin, DCs ytmarkörer och Treg-frekvens

Detektion av OVA-specifika antikroppar

OVA-specifika IgG-titrar och underklasser undersöktes med ELISA enligt den tidigare metoden [27]. ELISA-plattor (Nunc, Thermo Fisher Scientific) belades över natten och blockerades sedan. Serumprover späddes i serie för IgG-titeranalys eller detektering av IgG1 och IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Plattorna inkuberades sedan med PBST innehållande HRP-konjugerad anti-mus IgG, IgG1 och IgG2a under 1 timme vid 37°C. Den kolorimetriska reaktionen utvecklades med tetrametylbensidin (TMB) och sedan mättes absorbanserna vid 450 nm/655 nm och uttrycktes som enheter för optisk densitet (OD).

Detektion av splenocytproliferation och cytokin

Splenocytproliferation bestämdes genom MTT-analysen. På dag 21 efter den första vaccinationen erhölls en enda splenocytsuspension. Celler odlades i RPMI-1640-medium i 96-brunnsplattor enligt koncentrationen av 1×106 celler/brunn i tre exemplar. Kulturerna stimulerades med OVA (slutkoncentration 10 ug/mL), ConA (slutkoncentration 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) och LPS (slutkoncentration 100 ng/ml) i 48 timmar vid 37 ˚C . Celler odlades i 48 timmar och 20 μL (5 mg/ml) MTT (Sigma, St Louis, MO) sattes till varje brunn och inkuberades i ytterligare 4 timmar. Efter att ha tillsatt 50 μL DMSO i varje brunn för att stoppa färgutvecklingen (Sigma), avlästes plattorna vid 570 nm av en mikrotiterplattläsare (Bio-Rad, CA, USA). Splenocytproliferation uttrycktes som stimuleringsindex (SI), vilket var OD570 nm-förhållandet för en stimulerad brunn till en ostimulerad brunn.

Utbytena av IL-4 och IFN- i T-celler mättes genom intracellulär cytokinfärgning enligt ett publicerat protokoll med mindre modifieringar [27, 28]. Enstaka splenocytsuspension bereddes på dag 21 efter den första vaccinationen. Efter lysering av röda blodkroppar inkuberades splenocyten (2×106 celler/ml) med OVA (10 ug/mL) för 4-h stimulering och Golgi stop (BD) tillsattes för 12 timmars inkubation, PMA som en positiv kontroll. Celler samlades in, tvättades med PBS, färgades med CD4-FITC/CD8-FITC och fixerades och permeabiliserades med Cytofix/Cytoperm-kit (BD) enligt tillverkarens instruktioner. Intracellulär cytokinfärgning utfördes med lämplig koncentration av IL-4-PE eller IFN- -APC-antikroppar vid 4˚C under 20 minuter. Färgade celler detekterades av FAC. Dataanalys utfördes i FlowJo.

Bedömning av DCs mognad och Treg-celler i mjälten

För analys av DCs mognad från splenocyter i möss utfördes cellytefärgning med CD11c-PE, CD40-FITC och CD80-APC-antikroppar. På dag 3 efter den första vaccinationen erhölls enkel splenocytsuspension (1 x 106 celler/ml) och cellerna utsattes för dubbelfärgning. De fluorescerande intensiteterna mättes med FACs Calibur och de uppmätta data analyserades med FlowJo.

För att observera om WPCD kunde nedreglera frekvensen av CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg-celler. Enstaka splenocytsuspension bereddes på dag 7 efter den andra vaccinationen. Splenocyten (2×106 celler/ml) utsattes för cellytefärgning med CD4-APC-antikropp, följt av nukleär cytokinfärgning med lämpliga CD25-FITC- och Foxp3-PE-antikroppar med musen reglerande T-cell färgning kit (eBios ciences) enligt tillverkarens instruktioner. Frekvensen av CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg-celler testades på FAC. Dataanalys utfördes i FlowJo.

Statistisk analys

Envägsanalys av varians (ANOVA) tester (Tukey's Multiple-Comparison Test) utfördes för att analysera skillnaderna mellan flera experimentella grupper. Alla värden uttrycks som medelvärde ±SD. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Resultat

WPCD främjade mognad och funktion av BM-DCs in vitro

Adaptiv immunitet bestäms av aktiveringen av DC, inklusive typerna av samstimulerande molekyler och cytokiner [29, 30]. Inledningsvis undersökte vi om WPCD kunde främja uttrycket av samstimulerande molekyler. Enligt olika doser av WPCD administrerades BM-DC från C57BL/6. Expressionsnivåerna för CD11c, CD86, CD80, CD40 och MHC-II i celler analyserades (Fig 1). Cellerna gated med SSC och FSC visade att behandlingen med olika doser av WPCD inte förändrade morfologin för BM-DCs (data visas inte). Expressionsnivåerna för CD86, CD80 och CD40 uppreglerades signifikant på ett dosberoende sätt jämfört med den obehandlade gruppen och nådde platån under dosen 20 ug/ml WPCD, men skillnaden var inte signifikant jämfört med LPS-gruppen (Fig 1A–1C). Expressionsnivån av MHC-II ökades signifikant till dess maximala värde under dosen 50 ug/ml (Fig 1D). Analysresultaten av cellulära ytmarkörer visade att DC som behandlats med LPS eller WPCD visade signifikant ökade expressionsnivåer av CD86, CD80, CD40 och MHC-II och främjade fenotypisk mognad.

Vissa adjuvanser kan öka samstimulerande molekyler på DC eller direkt inducera utsöndring av cytokiner. IL-12 och TNF- är de viktigaste cytokinerna för att aktivera Th1-immunsvaret. Vi analyserade utbytet av cytokin i BM-DCs vid WPCD-behandling. Efter att BM-DCs behandlats med olika innehåll av WPCD i 12 timmar, samlades supernatanten upp för att detektera innehållet av IL-12 och TNF- med ett ELISA-kit. WPCD kan dosberoende öka produktionen av IL-12 (fig 2A) och TNF- (fig 2B). Resultaten visade att WPCD kunde inducera funktionell mognad av DC

I ett immunsvar är det nödvändigt att funktionellt aktivera DCs. Sedan inducerades den högre nivån av allogen T-cellsproliferation av fullt mogna DC:er. Därför undersöktes det funktionella svaret av DCs på WPCD av MLR. Den allostimulerande förmågan hos WPCD-inducerade DCs, liknande LPS, förbättrades dramatiskt på ett dosberoende sätt vid det angivna förhållandet (Fig 2C och 2D). Resultaten indikerade att WPCD förbättrade antigenpresentationen och optimerade T-cellssvar genom MLR in vitro.

WPCD främjade mognad av DCs via TLR4-väg

Man kunde dra slutsatsen från ovanstående resultat att BM-DC aktiverade av WPCD indikerade liknande DCs ytmolekyluttryck som LPS (en TLR4-ligand). Vi antog således att BM-DC aktiveras av WPCD via TLR4-vägen. Efter att BM-DC förbehandlats med TAK-242 (TLR4-hämmare) och samodlats med WPCD och LPS i 12 timmar, uttrycket CD40, CD86, TNF-a eller IL{{12 }} detekterades med FAC eller ELISA. Som visas i figur 3A och 3B resulterade TAK-242-behandlingen i de signifikant nedreglerade uttrycken av CD40 och CD86 inducerade av LPS eller WPCD, och cytokinproduktion av IL-12 eller TNF-a minskade också signifikant (Fig 3C och 3D). Resultaten indikerade att WPCD kunde aktivera DC-mognad genom TLR4-vägen.

WPCD förbättrade humoral och cellulär immunitet

I jämförelsesyfte utvärderade vi effekterna av WPCD på framkallandet av humoralt immunsvar i OVA-immuniserade möss. Före vaccination och på dagarna 14, 21, 35 och 49 efter den första vaccinationen, samlades blod in för att detektera IgG-titer och IgG-underklassserum med ELISA. IgG-antikroppssvaret mot OVA ökade med ökningen av dosen av WPCD-administrering (100 och 400 ug) på ett dosberoende sätt (fig 4). Den optimala koncentrationen var 100 ug/ml WPCD och ökade IgG-svar med två gånger jämfört med enbart OVA på dagarna 21, 35 och 49 (fig 4A). Avsevärda ökningar av OVA-specifika IgG1- och IgG2a-antikroppsnivåer under 20 och 100 ug WPCD-administrering erhölls jämfört med OVA-gruppen i serum på dag 35 (fig 4B). Under tiden främjade Alun endast uttrycksnivåerna av OVA-specifika IgG- och IgG1-antikroppar i de immuniserade mössen. WPCD enbart utlöste inte OVA-specifika antikroppar. Ovanstående resultat indikerade uppenbarligen att WPCD genererade högre antikroppstitrar och mer balanserade Th1/Th2-svar än alun.

Splenocytproliferation är en annan indikator på cellulär immunitet. ConA stimulerar T-celler och LPS stimulerar B-cellsproliferation. På dag 21 efter den första vaccinationen erhölls enstaka splenocytsuspension och stimulerades med OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptid, ConA (5 ug/mL) respektive LPS (5 ug/ml) i 48 timmar. Därefter mättes proliferationen av T-celler med MTT-metoden. WPCD kunde signifikant främja OVA-antigen, Con A-mitogen och LPS mitogen-stimulerad splenocytproliferation hos mössen immuniserade med OVA och WPCD (Fig 5) och den optimala koncentrationen av WPCD var 100 ug/ml. Dessa data indikerade att WPCD som ett vaccinadjuvans i OVA-immuniserade möss mer effektivt kunde inducera aktiveringen av T-celler och B-celler än alun.

Alla testade WCPD-adjuvans formulerade med OVA-vaccin genererade lika stark humoral och cellulär immunitet (fig 4 och 5). På grundval av dessa data analyserade vi ytterligare cytokinuttryck i CD8 plus och CD4 plus T-celler genom flödescytometri för att ytterligare utvärdera WPCD-influenser på OVA-specifik T-hjälpar (Th) cellrespons (Fig 6). På dag 21 efter den första vaccinationen isolerades en enda splenocyt av möss och samodlades sedan med OVA (10 ug/ml). IL-4-utbytet i CD4 plus T-celler i gruppen som administrerades med 100 ug OVA/WPCD var signifikant högre än det i OVA/Alun-gruppen och OVA-gruppen och liknande det i PMA (Fig 6A). Dessutom förbättrades IFN-utbytet i CD8 plus och CD4 plus T-celler också signifikant i mössen som administrerades med OVA/WPCD (20, 100 och 400 ug) (Fig 6B och 6C). Jämfört med alunadjuvans visade WPCD en bättre förmåga att inducera IL-4- och IFN-sekret från T-celler.

WPCD stimulerade mognad av DCs och minskar Treg-frekvensen in vivo

DCS är erkänt som de mest potenta APC:erna som är involverade i att initiera primära immunsvar. Således, på dag 3 efter den första vaccinationen, undersökte vi också effekterna av WPCD på CD40 och CD80 på DCs i mjälten hos möss (Fig 7A och 7B). Mössen i 100-ug OVA/WPCD-gruppen producerade signifikant högre nivåer av CD40 och CD80 på DC än de i OVA/Alum-gruppen. Dessa data visade att WPCD kunde aktivera DCs och inducera DCs mognad hos möss. Treg-celler kan balansera toleransen och immunsvaret. För att ytterligare undersöka hur WPCD modulerade immunsvaret, färgades Treg-celler i mjälten hos möss med ett T-cellsfärgningskit för mus. På dag 21 efter den första vaccinationen observerades en minskad frekvens av CD25 plus Foxp3 plus Treg-celler i det totala antalet CD4 plus T-celler (fig 7C). Jämfört med OVA- och OVA/Alum-grupperna visade WPCD-gruppen en signifikant reducerad Treg-frekvens.

Säkerhetsutvärdering av WPCD i möss

För att uppskatta den orala akuta toxiciteten genomförde vi det akuta toxicitetstestet. Mössen som administrerades oralt med 5000 mg/kg kroppsvikt visade inget onormalt beteende eller biverkningar och ingen dödlighet hittades i toxicitetsutvärderingstestet. Ingen signifikant skillnad i kroppsviktsökning, tymusindex och mjältindex registrerades bland olika grupper av möss som administrerades med olika doser av WPCD och hade ingen signifikant skillnad (tabell 1). Ingen dödlighet observerades efter 14 dagar. Därför var LD50-värdet för WPCD mer än 5000 mg per kg kroppsvikt.

För att testa om WPCD hade negativa effekter på tillväxten av mössen, före och efter subkutan vaccination, bestämdes kroppsvikten för varje mus (tabell 2). I den efterföljande observationen av mössen observerades inte biverkningar eller onormalt beteende. Dessutom visade kroppsvikten hos mössen som administrerades med WPCD och mössen administrerade med saltlösning eller OVA/Alum ingen signifikant skillnad. Dessa observationsresultat visade att administreringen av WPCD var säker.

Diskussion

Adjuvans är nyckelkomponenter i vacciner [31]. På grund av framstegen inom genomik och proteomik identifieras fler och fler rekombinanter och syntetiska vaccinmolekyler. Därför krävs fler adjuvanser och formuleringar. Vissa potenta adjuvans är i allmänhet relaterade till ökad toxicitet, till exempel FCA. Därför är det nödvändigt att hitta en säker formulering som innehåller olika synergistiska komponenter som så småningom driver det önskade immunsvaret. Polysackarider från kinesiska örter är giftfria och visar inga signifikanta biverkningar [32,28]. Ett säkert adjuvans krävs för ett visst vaccin.

Cistanche deserticola är en viktig stärkande ört och finns allmänt i torra länder och varma öknar i nordvästra Kina. Cistanche deserticola är allmänt oroad på grund av dess bioaktiviteter inklusive immunmodulerande, antioxidativa, antibakteriella och antitumöreffekter [20,21]. Vissa framsteg har gjorts i den strukturella karaktäriseringen och immunologiska aktiviteten av Cistanche deserticola, som är en bra kandidat för att utveckla adjuvans. Vi utvärderade experimentellt adjuvanseffekterna och mekanismen för WPCD in vitro och in vivo. Subkutan administrering av WPCD främjade signifikant humorala och cellulära immunsvar genom att öka serumantikroppar och lymfocytproliferation, öka uttrycket av cytokiner, uppreglera DC-mognaden och nedreglera frekvensen av CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg-celler.

DCS är nyckel-APC för att prima naiva T-celler. Aktiveringen av DCs är viktig för adjuvans. DCS, särskilt murina märghärledda DCs, används ofta för att utvärdera adjuvans och vacciner. Flödescytometri kan särskilja de celler som har aktiverats efter att ha fångat ett antigen från omgivande celler. I FCM-analys är graden av aggregation av stimulerade celler en indirekt indikator för att utvärdera säkerheten hos immunmodulatorer [3]. Således kan WPCD-adjuvansaktivitetsdata i DCs in vitro ge värdefull information för djurmodeller. Baserat på BM-DC-modellen detekterades expressionsnivåerna av MHC-II, CD86, CD80 och CD40, cytokinproduktion och allogen T-cellsproliferation i det optimala WPCD-koncentrationsintervallet. Expressionsnivåerna av MHC-II, CD86, CD80 och CD40 uppreglerades i BM-DCs och utbytena av TNF-a och IL-12 ökade på ett dosberoende sätt. Den allogena T-cellsproliferationen observerades. Morfologin för BM-DC ändrades inte. Genom att inducera BM-DC-aktivering och utsöndring av inflammatoriska cytokiner in vitro, kan WPCD-adjuvans avsevärt öka mängden antigen och mängden APC och stimulera T-celler att utsöndra IFN-, vilket bidrar till förbättringen av immunmodulerande aktivitet.

Olika kinesiska örtartade polysackarider är kapabla att aktivera immunsystemet och har utmärkta adjuvansförmågor genom att stimulera DCs mognad genom TLR4-vägen [33,28]. Således antar vi att TLR4 deltar i signaleringsvägen för WPCD-inducerad DC-mognad. Som väntat resulterade behandlingar med TLR4-hämmare i en signifikant minskning av TNF-a och IL-12. Dessutom hindrade hämningen av TLR4-vägen också uttrycket av CD 40 och CD80 på DC, vilket indikerar att mognad av DCs var beroende av TLR4. Därför är det uppenbart att TLR4 deltar i den WPCD-inducerade DCs mognad.

Den optimala dosen av adjuvans och vaccinformulering bestäms empiriskt i många experiment. För att utforska dos-responsförhållandet mellan WPCD-adjuvans och OVA-antigener i möss valde vi olika WPCD-doser baserat på tidigare rapporterade data från BM-DCs in vitro för att subkutant administrera ICR-möss två gånger. Vi fann att WPCD signifikant ökade utbytet av OVA-specifika antikroppar och inducerade ett balanserat Th1/Th2-immunsvar med en förbättring av IgG1- och IgG2a-nivåerna. Speciellt var IgG2a-nivån högre än den som behandlades med alun i den optimala dosen. Därför resulterade WPCD i högre nivåer av specifika antikroppar och högre effektivitet med de lägre injektionerna.

Nya vacciner kräver induktion av starka cellulära svar, som involverar antikroppar, T-hjälparceller (Th) och cytotoxiska T-lymfocyter (CTL). Det terapeutiska vaccinet syftar till att inducera starkare T-cellssvar. Det ideala adjuvansen ökar vaccinets styrka och främjar cellmedierad immunitet utan att orsaka toxiska effekter [34]. Bland observationerna i immuniserade mössmodeller ledde WPCD till en ökning av OVA-specifik och icke-specifik splenocytproliferation jämfört med alun. Vissa adjuvanser uppreglerar cytokiner och immunförsvaret. Till exempel kan saponiner stimulera cellmedierade immunsvar mot ett antigen som normalt endast inducerar antikroppar. Vi valde IL-4 och IFN- som indikatorer för att indirekt utvärdera nivåerna av immunitet hos möss. WPCD kan inducera mer IL-4- och IFN-utsöndringar än alun. Sålunda observerades starka hjälpar-T-cellssvar och cytokinutsöndringar som ett resultat av WPCD-vaccination, vilket tyder på att WPCD mer effektivt kan stimulera lymfocyter att utsöndra cytokinet av Th1-typ och cytokinet av Th2-typ än Alun.

Adjuvanser som påverkar antigenpresentationen kan påverka komplexa immunprocesser. Treg-celler kan modulera Th1- och Th2-svar [35]. En lämplig dos av WPCD kan främja mognad av DC hos möss genom att öka expressionsnivåerna av CD80 och CD40 och förstärka förmågan hos OVA-antigenpresentation i det tidiga immunsvaret. De experimentella resultaten av DCS-aktiveringen och Treg-frekvensen visade att WPCD inducerade mognad av DCs och minskade Treg-frekvensen i mjälten hos möss. Dessa resultat visade att WPCD förbättrade effektiviteten av OVA-vacciner genom att öka riktade antigenpresenterande celler och främja T-cellsspecifik aktivering.

Vid utvecklingen av adjuvans är det svårt att selektivt inducera det lämpliga immunsvaret mot motsvarande infektion. Lämpligt adjuvans bör ha låga biverkningar och toxicitet för människor eller djur. Därför bör WPCD-säkerhet övervägas, inklusive omedelbara och långvariga biverkningar. I denna studie undersökte vi den akuta toxiciteten hos WPCD och den negativa effekten av WPCD på möss tillväxtprestanda i 110 dagar. Resultaten av akut toxicitet av WPCD visade att kroppsvikt, tymusindex eller mjältindex inte hade någon signifikant skillnad. LD50-värdet för WPCD var mer än 5000 mg per kg kroppsvikt. Under den experimentella efterföljande observationen av mössen hittades inga biverkningar eller onormalt beteende hos möss. Dessa resultat indikerade att WPCD var säker.

Sammanfattningsvis, i denna studie uppvisade WPCD, en rå polysackarid extraherad från C. deserticola från Xinjiang, vissa egenskaper hos adjuvans. Till exempel förbättrade WPCD både Th1- och Th2-svar genom att aktivera DCs, öka antikroppssvaren, förbättra cytokinproduktionen. Dessutom undersökte vi mekanismen för WPCD-effektivitet genom att analysera DCs mognad och funktion via TLR4-vägen in vitro. Hos mössen som endast behandlats med WPCD observerades inga uppenbara biverkningar. Därför hade WPCD den högre immunstimulerande aktiviteten i cellulära och humorala immunsvar. Adjuvans är en blandning av flera föreningar. En blandning av flera råextrakt kan ha större fördelaktiga effekter än ett enda växtextrakt. Det är nödvändigt att systematiskt utforska WPCD-extrakt, testa deras effektivitet och säkerhet och belysa mekanismerna för deras effekter.

Stödjande information

S1 fil. ANKOMST Checklista. (DOCX)

Erkännanden

Med särskilt tack till Bing Wang och Daocheng Wu för att de gav bra idéer i experimenten.

Författarbidrag

Konceptualisering: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Datakurering: Xiumei Yang, Yu Yang. Formell analys: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Finansieringsförvärv: Ailian Zhang. Projektadministration: Ailian Zhang.

Resurser: Ailian Zhang, Gan Zhao.Writing – originalutkast: Ailian Zhang.

Skrivande – recension och redigering: Ailian Zhang, Daocheng Wu.