In vitro anti-aging-aktiviteter av etanolextrakt från rosa rambutan (Nephelium Lappaceum Linn.) för hudapplikationer Del 1

abstrakt

Hudens åldrande kännetecknas av egenskaper som rynkor, förlust av elasticitet, slapphet, grov struktur, melasma och fräknar. Flera typer av forskning har fokuserat på att förebygga och behandla hudens åldrande med många naturliga ingredienser. Denna studie syftade till att bedöma anti-aging-aktiviteterna för anti-hudåldring av etanolextrakten av rosa rambutan (PR) (Nephelium lappaceum Linn.) från löv (L), grenar (B), frön (S) och skal från mogna (R) och unga (Y) frukter. Extraktionsutbytena för all rosa rambutan (PR) extraherad genom Maceration (M) och Soxhlet-extraktion (Sox) med 95 procent etanol som lösningsmedel, varierade från 10,62 procent till 30 .63 procent . Flavonoider hittades som de viktigaste fytokemikalierna i nästan alla PR-extrakt. PR-YM- och PR-Y-Sox-extrakten gav det högsta totala fenolhalten med Folin-Ciocalteu-analysen på 67,6 0 ± 4,38 mgGAE/g, och totalt flavonoidinnehåll med den modifierade aluminiumkloridkolorimetriska analysen på 678,72 ± 23,59 mgQE/g, respektive. PR-LM-extrakten visade de tre högsta antioxidativa aktiviteterna; fria radikaler (SC50 av 0.320 ± 0.{{40}}70 mg/mL) lipidperoxidationsinhibering (LC50 av 0,274 ± 0,029 mg/ml) och metallkeleringsaktivitet (MC50 på 0,203 ± 0,021 mg/ml). Alla PR-extrakt vid 0,01 och 0,1 mg/ml visade ingen cytotoxicitet på B16F10-celler respektive humana hudfibroblaster. På samma sätt uppvisade PR-R-Sox-extraktet den högsta anti-melanogenesen på B16F10-celler (52,7 ± 0,9 procent), och svamptyrosinasinhiberingsaktiviteten (IC50 på 0,04 ± 0,02 mg/ml), vilket var signifikant jämförbart med kojinsyra (p < 0,05). PR-Y-Sox-extraktet visade kollagenbiosyntes med Sirius Red-metoden och stimulering av anti-aging-gener (Sirt1 och Foxo1) på humana hudfibroblaster med RT-PCR-metoden, som liknade standarderna ʟ-askorbinsyra och resveratrol, respektive. Denna studie tyder på att PR-R-Sox- och PR-Y-Sox-extrakten kan vidareutvecklas som naturliga anti-aging-medel för blekning och anti-rynkor inom kosmetika-, kosmetika- och läkemedelsindustrin. 2023 Författaren/författarna. Utgiven av Elsevier BV på uppdrag av King Saud University.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranets funktion. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en god renande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenerationen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinacoside i Cistanche en betydande förmåga att avlägsna DPPH-fria radikaler och har förmågan att avlägsna reaktiva syrearter och förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning, och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tymin-fria radikaler.

Klicka på Var kan jag köpa Cistanche

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Introduktion

Globalt växer den åldrande befolkningen i världen snabbare än alla andra åldersgrupper. Världshälsoorganisationen uppskattade att världens befolkning över 60 år och äldre skulle vara 2,1 miljarder år 2050 och kommer att ställas inför vanliga tillstånd, inklusive artros, diabetes, hörselnedsättning, Alzheimers sjukdom, kroniska obstruktiva lungsjukdomar (KOL), depression och demens , cancer och neurologiska och kardiovaskulära sjukdomar (Darawsha et al., 2021, WHO, 2021). Huden är ett av de mest synliga organen under åldringsprocessen. Hudens åldrande är relaterat till social kommunikation eftersom ett gott utseende gör ett positivt intryck och förbättrar självförtroendet. Hudens åldrande påverkas av miljömässiga eller externa faktorer som luftföroreningar, främlingsfientliga ämnen, UV-strålning och rökning, och av interna faktorer som genetik, cellulär metabolism, hormoner och metaboliska processer (Darawsha et al., 2021). Många nya typer av forskning har fokuserat på att bibehålla frisk hud genom att skjuta upp, förebygga och behandla åldrande för att förbättra hudens utseende genom att regenerera och stimulera naturliga fysiologiska processer för att skydda huden från åldrande.

De reaktiva syrearterna (ROS) från den cellulära oxidativa stressen kan orsaka induktion av apoptotisk celldöd genom aktivering av inflammatoriska processer och deras signalvägar, ökande metalloproteinaser (MMPs) nivåer, nedbrytning av omättade lipider och förändring av fibrillära strukturer. proteiner inklusive kollagener och elastin som beror på hudens åldrande (Miastkowska och Sikora, 2018, Darawsha et al., 2021). Efter melanogenes är melanin ett polyfenoliskt pigment som produceras i melanosomer av melanocyter som finns i djurs ögon, hår och hud, och som kan skydda huden som skadats av ultraviolett strålning (Ali och Naaz, 2018). Tyrosinas är det kopparinnehållande enzymet som kan omvandla L-tyrosin till L-dopa och L-dopa till odopaquinon-H plus genom hydroxylering och oxidationsreaktioner, och sedan passerar genom intermediärer till slut till melanin (Solano, 2018). ROS spelar också en betydande roll i regleringen av cellulär oxidativ stress i melanocyter som är dendritiska celler som lokaliseras i det basala lagret av epidermis i huden. De inflammatoriska mediatorerna i huden som interleukin (IL), prostaglandin E2, tumörnekrosfaktor och interferon-gamma som huvudsakligen utsöndras av Th-celler, lymfocyter, dendritiska celler och monocyter, reglerar stimulerande tyrosinasaktivitet och uppreglerar TYRP{{11 }} och TYRP-2 uttryck och främjande av melanocytproliferation som relaterade till melaninproduktion (Fu et al., 2020). Däremot orsakar överproduktionen och den höga ansamlingen av melanin hudens åldrande såsom melasma, fräknar, mörka fläckar, lentigo och hyperpigmenteringsstörningar, vilket kan vara estetiskt oönskat (Ali och Naaz, 2018).

Sirtuiner är nukleär nikotinamidadenindinukleotid (NAD plus)-beroende klass III histondeacetylas som reglerar cellålderdom och apoptos, och celltillväxt genom att kontrollera p53, gaffelhuvudstranskriptionsfaktorer (FOXOs) och peroxisomproliferatoraktiverad receptor gamma (PPAR-c) som involverar regleringar av metabolism, celldifferentiering, överlevnad och åldrande. (Son et al., 2021). SIRT1, SIRT6 och sällan SIRT7 i sirtuin-familjen har reglerats för dermatologiska problem, inklusive hudinflammation, kutan infektion, cancer, autoimmuna sjukdomar, ärftliga dermatologiska sjukdomar, särskilt hudens åldrande (Son et al., 2021). FOXO1 är också en transkriptionsfaktor som finns i cytoplasman. SIRT1 deacetylerar FOXO1 och aktiverar FoxO1-transkriptionen i flera vägar som MAPK (mitogenaktiverat proteinkinas), proteinkinas (AKT) och pankreas- och duodenal homeobox-1 (Pdx1)-vägar (Sin et al., 2015) . Ökningen av Sirt1 och Foxo1 mRNA-uttryck reglerar glukosmetabolism, DNA-reparation, neuroprotection, differentiering, vaskulärt skydd och insulinutsöndring; och minskar åldrande och åldersrelaterade sjukdomar som oxidativ stress, cellulär senescens, neurodegeneration, inflammation, insulinresistens, hjärt-kärlsjukdomar, fett och leversteatos samt hudens åldrande (Son et al., 2021).

Pharmaceuticals (Drugs) and Cosmetics Act från 1940 definierar ett läkemedel som ''alla läkemedel för inre eller externa användningar av människor eller djur, och alla substanser som är avsedda att användas för, eller för diagnos, behandling, mildring eller förebyggande av någon sjukdom eller störning hos människor eller djur." Kosmetik är varje artikel som är avsedd att gnuggas, hällas, spritsas eller sprayas på, införas i eller appliceras på någon del av människokroppen för att rengöra, försköna, främja attraktivitet eller ändra utseende, och inkluderar alla föremål som är avsedda att användas som en komponent i kosmetika. Cosmeceuticals är kosmetiska-farmaceutiska hybrider avsedda att förbättra hälsa och skönhet genom ingredienser som påverkar hudens biologiska strukturer och funktioner (Joshi och Pawar, 2015). För närvarande anti-aging kosmetika, kosmetika och läkemedel innehåller aktiva föreningar som neutraliserar fria radikaler som vitamin E, vitamin C, glutation och coenzym Q10; och fördröjer hudens åldrande från rynkor och melasma som nukleinsyror, proteinhydrolysat, algextrakt, växtoljor, fytohormoner , cytokiner och neuropeptider (Kim et al., 2015, Miastkowska och Sikora, 2018), såväl som polyfenoler och flavonoider från olika naturliga växtextrakt, såsom extrakten av Vigna subterranean, Stichopus japonicus, Citrus aurantifolia, Ananus comhotosus, esculenta (Chutoprapat et al., 2020; Ding et al., 2020 Boonpisuttinant et al., 2022, Jampa et al., 2022).

Rosa rambutan eller Ngo See Chom Pu (Nephelium lappaceum L.) är en växt från familjen Sapindaceae, som är den inhemska växten i Klung-distriktet, Chanthaburi-provinsen, i östra delen av Thailand. Rosa rambutan (PR) frukter är söta och har en god smak. De har ett tunt skal med gulrosa svål och ljusrosa ryggrad med ljusgrön spets, vilket skiljer sig från de andra arterna som Ngo Rongrien och Ngo Nasarn, som har ljusröda svålar och taggar. De viktigaste fytokemikalierna som finns i rambutanväxter är ellaginsyra, korilagin, geraniin, quercetin och rutin (Phuong et al., 2019, Phuong et al., 2020). Det har tidigare rapporterats att skalen av rambutan från de andra arterna har visat sig ha en hög halt av fenoliska föreningar och har många biologiska aktiviteter såsom DPPH-radikalavlägsnande, antiinflammatorisk, antiviral, anticancer och antibakteriell (Chingsuwanrote et al. ., 2016; Hernández-Hernández et al., 2019; Rohman, 2017; Sukmandari et al., 2017; Thitilertdecha och Rakariyatham, 2011). De rosa rambutanextrakten har dock ingen vetenskaplig rapport för biologiska aktiviteter, särskilt anti-aging-aktivitet för hudhälsa och estetiska ändamål. Därför syftade den aktuella studien till att bedöma och utvärdera potentialen för PR-extrakt i hudapplikationer inom kosmetika, kosmetika och läkemedel. Undersökningarna av biologiska aktiviteter mot åldrande in vitro inklusive tyrosinashämning och antimelanogenes, kollagenbiosyntes och stimulering av Sirt1- och Foxo1-mRNA-uttryck, och de tre antioxidativa aktiviteterna såväl som cytotoxiciteten på humana dermala fibroblaster, indikerar effektiviteten och säkerheten för PR-extrakten som kan vidareutvecklas till naturliga hudvårdsprodukter.

2. Material och metoder

2.1. Beredning och extraktion

De fem delarna av rosa rambutan (PR) inklusive löv (L), grenar (B), frön (S) och skal från mogna (R) och unga (Y) frukter samlades in från Klung District, Chantaburi, Thailand från juni till Augusti 2017. Verifikationsexemplaren identifierades av en botanist vid Forest Herbarium of Thailand och registrerades vid herbariet (kod: RSPG-RMUTT-0102) för Innovative Natural Products från Thai Wisdom Research Unit, Faculty of Integrative Medicine, RMUTT , Pathum Thani, Thailand. Alla delar av den rosa rambutanen skars, tvättades med kranvatten, torkades vid 60 grader i en varmluftsugn och maldes till pulver med en kvarn. Alla delar av rosa rambutaner extraherades genom Maceration och Soxhlet-extraktion med 95 procent etanol som lösningsmedel, vilket är det vanligaste som används för extraktion av medicinalväxter eftersom det är säkert och ekonomiskt. Kortfattat extraherades 10 g av vart och ett av PR-pulvret genom (1): Maceration (M) i 100 ml 95 % (v/v) etanol (Bangkok Alcohol Industrial, Thailand) med skakning vid 200 rpm vid rumstemperatur (25 ± 2 grader) under 48 timmar; och (2): Soxhlet-extraktionen (Sox) med 100 ml 95 % (v/v) etanol vid 80 ± 5 grader C under 24 timmar. Därefter filtrerades extrakten först genom bomullsull och passerades sedan genom ett filterpapper kopplat till en vakuumpump. Filtraten uppsamlades, slogs samman och torkades med en rotationsindunstare. PR-råextrakten förvarades i glasflaskor och förvarades vid 4 grader i kylskåp tills de användes. Extraktionsutbytena utfördes baserat på torrviktsbasis. Den 95 procentiga etanolen användes som lösningsmedel för att lösa upp PR-extrakten före experimenten.

2.2. Fytokemikalier, totala fenoler och flflavonoider och innehåll av quercetin

Fytokemikalier såsom antrakinoner, alkaloider, karotenoider, glykosider, flavonoider, tanniner och xantoner i PR-extrakten undersöktes som tidigare beskrivits (Boonpisuttinant et al., 2022). De kvalitativa resultaten uttrycks som ( plus ) för närvaron och (-) för frånvaron av fytokemikalier. Det totala fenolhalten (TPC) analyserades med Folin-Ciocalteu-analysen som tidigare beskrivits (Boonpisuttinant et al., 2022). Kortfattat tillsattes 50 l av PR-extrakten, 75 l Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, USA) och 75 l av 7,5 % (vikt/volym) Na2CO3 (Loba Chemie, Indien) till en {{13} }brunnsmikroplatta, försiktigt blandad och sedan inkuberad vid rumstemperatur på en mörk plats i 90 min. Sedan mättes absorbanserna vid våglängden 725 nm med en mikroplattläsare. Fenolhalterna beräknades från standardkurvan för gallussyra (Sigma-Aldrich, USA). Resultaten utfördes som mg gallussyraekvivalenter (GAE)/g extrakt.

Den totala flavonoidhalten (TFC) med den modifierade aluminiumkloridmetoden analyserades enligt Shraim et al. (2021). Kortfattat tillsattes 50 1L av PR-extrakten, 25 1L 10 procent AlCl3 (BDH Prolabo Chemicals, Belgien) och 100 1L 5 procent NaNO2 (Loba Chemie, Indien) till en 96-brunnsmikroplatta. Efter 5 minuters inkubation tillsattes plattorna 25 1 1 M NaOH (BDH Prolabo Chemicals, Belgien). Reaktionen tilläts genom inkubering vid rumstemperatur under 10 min. Sedan mättes absorbanserna vid våglängden 450 nm med en mikroplattläsare. Flavonoidinnehållet beräknades från standardkurvan för quercetin (Sigma-Aldrich, USA). Resultaten utfördes som mg Quercetin-ekvivalenter (QE)/g extrakt.

Quercetininnehållet i PR-extrakten undersöktes med HPLC-metoden (Shaikh och Jain, 2018). Kortfattat löstes en noggrant uppvägd mängd av standardquercetinet i metanol i en 100 ml mätkolv för att erhålla en stamlösning på 1,000 lg/ml. Standardlösningarna späddes därefter 2-faldigt i serie till 3,125 mg/ml. För provberedning löstes 2,5 g av extrakten i 25 mL metanol i 25 mL av mätkolven för att erhålla 1,000 mg/ml. All analys utfördes på ett Agilent 1260 infinity HPLC-system (Waters, Milford, MA, USA) utrustat med en fotodiodmatrisdetektor. Den analytiska kolonnen som användes var en Agilent Zorbax förlängd kolonn C18 (5 1 x 100 mm x 4,6 mm) med en mobil fas av metanol: 0,1 procent ortofosforsyra (75:25) vid en flödeshastighet av 0,6 ml/min. Kolonntemperaturen hölls vid 25 grader och detektionsvåglängden inställdes på 370 nm. Alla lösningar och lösningsmedel filtrerades genom ett 0,22 lm filter och avgasades. Provinjektionsvolymen var 10 1L och körtiden var 8 min.

2.3. Antioxidant aktivitet

2.3.1. Aktivitet för att avlägsna fria radikaler

Den fria radikalfångande aktiviteten hos PR-extrakten analyserades med 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-metoden av Boonpisuttinant et al. (2019). En mängd av 100 l av PR-extrakten eller ʟ-askorbinsyra (Sigma-Aldrich, USA) som positiv kontroll och 100 l av 0,1 mg/ml DPPH-lösning (Sigma-Aldrich, USA) i absolut etanol sattes till en 96 brunnars mikroplatta. Efter inkubation vid rumstemperatur på ett mörkt ställe under 30 minuter, mättes absorbanserna vid våglängden 515 nm med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen av DPPH radikalfångande aktivitet beräknades enligt följande formel:

procent DPPH radikal rensningsaktivitet {{0}}[A0 -A1/A0]×100 (1)

Där A0 är absorbansen för kontrollen och A1 är absorbansen för proverna. Koncentrationerna som tillhandahåller 50 procent rensning (SC50) beräknades sedan från grafen som plottades mellan procentandelen fria radikaler och provkoncentrationerna.

2.3.2. Lipidperoxidationshämning

Lipidperoxidationsinhiberingen av PR-extrakten analyserades med ferri-tiocyanatmetoden Boonpisuttinant et al. (2019). En mängd av 50 l av PR-extrakten eller a-tokoferol (Sigma-Aldrich, USA) som den positiva kontrollen och 50 l linolsyra i 50 procent (v/v) DMSO (Sigma-Aldrich, USA) tillsattes till en 96 brunnars mikroplatta. Reaktionen initierades genom tillsats av 50 µl 5 mM NH4- SCN och 50 µl 2 mM FeCl2. Efter inkubation vid 37 grader på ett mörkt ställe under 60 minuter, mättes absorbanserna vid en våglängd av 490 nm med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen av lipidperoxidationsinhibering beräknades enligt följande formel:

Där A0 är absorbansen för kontrollen och A1 är absorbansen för proverna. Koncentrationerna som ger 50 procent av lipidperoxidationsinhiberingen (LC50) beräknades från grafen som plottades mellan procent lipidperoxidationsinhibering och provkoncentrationerna.

2.3.3. Metallkelering

Metallkeleringen av PR-extrakten analyserades genom ferrojonkelateringsmetoden (FIC) av Boonpisuttinant et al. (2019). En mängd av 50 l av PR-extrakten eller EDTA (Loba Chemie, Indien) som positiv kontroll, 1 mg/ml FeCl2 och 50 l 1 mg/ml ferrozin i 1 procent HCl (TCI, USA) tillsattes till en mikroplatta med 96 brunnar. Efter inkubation vid rumstemperatur på ett mörkt ställe under 60 minuter, mättes absorbanserna vid våglängden 570 nm med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen av metallkelering beräknades enligt följande formel:

Där A0 är absorbansen för kontrollen och A1 är absorbansen för proverna. Koncentrationerna som gav 50 procent av metallkelering (MC50) beräknades från grafen som plottades mellan procent metallkelering och provkoncentrationerna.

2.4. Svamptyrosinashämning

Svamptyrosinasinhiberingsaktiviteten hos PR-extrakten analyserades med den modifierade dopakrommetoden (Boonpisuttinant et al., 2022). En mängd av 50 lL av PR-extrakten eller kojinsyra (Sisco Research Laboratories (SRL), Indien) som positiv kontroll, 50 lL av 0,1 mg/ml L-tyrosin (Sigma- Aldrich, USA), 50 1L 0,1 mM fosfatbuffert och 50 1L 0,1 mg/ml svamptyrosinas (Sigma-Aldrich, USA) sattes till en 96-brunnsmikroplatta. Före och efter inkubation vid 37 grader C på ett mörkt ställe under 60 minuter, mättes absorbanserna vid våglängden 450 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Procentandelen av svamptyrosinasinhibering beräknades enligt följande formel:

procent Svamptyrosinasinhibering=[(A - B)-(C - D)]/=(A - B)×100 (4)

Där A är absorbansen för blindprovet efter inkubation, B är absorbansen för blindprovet före inkubation, C är absorbansen för proverna efter inkubation och D är absorbansen för proverna före inkubation. Koncentrationerna som gav 50 procent tyrosinasinhibering (IC50 mg/ml) beräknades från grafen som plottades mellan procent tyrosinasinhibering och provkoncentrationerna

2.5. In vitro anti-aging aktiviteter på cellkulturer

2.5.1. Cellkulturer

Murina melanom (B16F10) och humana hudfibroblaster användes för att undersöka anti-melanogenes, kollagenbiosyntes och anti-aging av Sirt1 respektive Foxo1 mRNA-uttryck. Dessa två celler erhölls från American Type Culture Collection (ATCC), Virginia, USA. Cellerna odlades i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich Biotechnology, St. Louis, MO, USA) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA) ), 100 IU/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) under standardbetingelserna vid 37 C under 5 procent CO2-inkubatorn före experiment.

2.5.2. Cytotoxicitetstest på humana hudfibroblaster

De olika koncentrationerna av PR-extrakten undersöktes för cytotoxicitet på murina melanom (B16F10) och humana hudfibroblaster av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl )-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys som den tidigare beskrivna Boonpisuttinant et al. (2022). De mänskliga hudfibroblasterna med en täthet av 1 × 104 celler per brunn ströks ut i 96-brunnsplattor, justerade volymen till 180 l med DMEM och inkuberades vid 37 grader under en 5 procentig CO2-atmosfär i 24 timmar. Extrakten i olika koncentrationer tillsattes sedan. Cellerna inkuberades vid 37 grader C under en 5-procentig CO2-atmosfär under 24 timmar. Därefter tvättades cellerna med 10 mM PBS vid pH 6,8 under 3 gånger och tillsattes 1 ml 0,5 mg/ml MTT-lösning (Sigma-Aldrich, USA). Efter inkubation vid rumstemperatur under 3 timmar avlägsnades MTT-lösningen och 100 1L dimetylsulfoxid (DMSO) sattes till varje brunn. Plattorna skakades försiktigt vid 200 rpm under 15 min. Absorbanserna vid våglängden 570 nm av lösningarna mättes med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen av cellviabiliteten beräknades enligt följande formel:

Där Akontroll är absorbansen för kontrollen och A-provet är absorbansen för proverna.

2.5.3. Anti-melanogenes på B16F10-celler

Anti-melanogenesen på B16F10-celler av PR-extrakten undersöktes med den tidigare beskrivna metoden av Boonpisuttinant et al. (2022). B16F10-cellerna med en täthet av 2,5 × 105 celler per brunn såddes i 6-brunnsplattor och inkuberades vid 37 grader under en 5-procentig CO2-atmosfär över natten. Extrakten i en koncentration av 0,01 mg/ml tillsattes sedan. Kojinsyra användes som en positiv kontroll. Cellerna inkuberades vid 37 grader under en atmosfär av 5 procent CO2 i 72 timmar. Därefter samlades supernatanterna upp i de rena mikrofugrören, medan cellerna tvättades med 10 mM fosfatbuffertsaltlösning (PBS) vid pH 6,8 i 3 gånger, löstes i 200 l 10 procent NaOH och inkuberades vid 60 grader 1 timme. . Absorbanserna vid våglängden 450 nm hos supernatanterna och cellysaten mättes med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen av melaninhalten beräknades enligt följande formel:

2.5.4. Kollagenbiosyntes på fibroblaster i mänsklig hud

Kollagenbiosyntesen av PR-extrakten undersöktes som den tidigare beskrivna metoden av Boonpisuttinant et al. (2022). De mänskliga hudfibroblasterna med en densitet av 5 × 105 celler per brunn såddes i 6-brunnsplattor och inkuberades vid 37 grader under en 5-procentig CO2-atmosfär över natten. Extrakten i en koncentration av 0,1 mg/ml tillsattes sedan. ʟ-askorbinsyra användes som en positiv kontroll. Cellerna inkuberades vid 37 grader under en atmosfär av 5 procent CO2 i 24 timmar. Därefter tvättades cellerna med 10 mM PBS vid pH 6,8 i 3 gånger, tillsattes 1 ml 0,1% (vikt/volym) Sirius röd lösning (Sigma-Aldrich, USA) i den mättade pikrinsyran (Sisco Research Laboratories (SRL) ), Indien), och inkuberades sedan vid rumstemperatur under 1 timme. Färgen avlägsnades och plattorna tvättades med 1 ml 10 mM HCl (Merck Millipore, Tyskland) 5 gånger. Därefter löstes cellerna genom tillsats av 1 ml 0,1 M NaOH. Absorbanserna vid våglängden 450 nm hos supernatanterna och cellysaten mättes med användning av en mikroplattläsare. Procentandelen av kollagenmängden beräknades enligt följande formel:

Där Csample var kollagenhalten i proverna och Ccontrol var kollagenhalten i kontrollen.

2.5.5. Stimulering av anti-aging gener på fibroblaster i mänsklig hud

Stimuleringen av anti-aging gener (Foxo1 och Sirt1) av PR-extrakten bestämdes med RT-PCR som tidigare beskrivits av Polouliakh et al. (2020). De mänskliga hudfibroblasterna med en täthet av 5 × 105 celler per brunn såddes i 6-brunnsplattor inkuberade vid 37 grader C under en 5-procentig CO2-atmosfär över natten. Extrakten i koncentrationen 0,01 mg/ml tillsattes sedan. Efter inkubation i 24 timmar extraherades det totala RNA:t med NucleoSpin RNA Plus (Macherey Nagel, Dueren, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Mängden totalt RNA kvantifierades med Qubit 2.0 fluorometer (Invitrogen, Massachusetts, USA). De specifika primrarna för RT-PCR inklusive Foxo1, Sirt1 och b-aktin köptes från Macrogen Oceania, Australien. Sekvenserna för de specifika primrarna följdes; Foxo1: 5'-GAC GCC GTG CTA CTC GTT-3'(Framåt) och 5'-CGG TTC ATA CCC GAG GTG-3'(Bakåt); Sirt1: 5′ -TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′(Fram), 5′ -ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′ (Bakåt); och b-aktin: 5' TCA TGC AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3' (framåt), 5'-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG -3'(bakåt). PCR-blandningarna innehöll 1x SuperScriptTM III One-Step RT-PCR-system med PlatinumTM Taq DNA Polymerase Supermix (Invitrogen, Massachusetts, USA), 250 nM specifika primrar och 2 lg RNA. Alla RT-PCR-reaktioner utfördes på TProfessional Basic Gradient 070–601 (Biometra GmbH, Göttingen, Tyskland) under amplifieringsförhållandena: 60 grader C 30 min för omvänd transkription; sedan 40 cykler vid 94 grader för 15 s denaturering, 55 grader C för 30 s glödgning och 68 grader för 30 s förlängning; och slutligen vid 68 grader C i 5 min. Efter RT-PCR-processer separerades PCR-produkterna sedan på en 1,5 procent agarosgel blandad med Novel Juice 6x DNA Loading Buffer (GeneDireXTM, Kina), sågs med en transilluminator och fotograferades sedan med Quantity One 4.6.8 (grundläggande) (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien). Därefter kvantifierades bandtätheten med hjälp av Image J (version 1.47, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), och normaliserades till hushållningsgenen, b-aktin.

2.6. Statistisk analys

Alla experiment uttrycktes som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD) för de oberoende experimenten (n {{0}}). Statistiska skillnader analyserades med ANOVA med Tukey-testet (p < 0,05). Relationerna mellan bioaktiviteterna testades med Pearsons korrelationskoefficient.

3. Resultat

3.1. Extraktionsutbytena, fysikaliska egenskaper och fytokemiska innehåll av PR-extrakten

Extraktionsutbytena, fysikaliska egenskaper och fytokemiska innehåll av PR-extrakten visades i tabell 1. Extraktionsutbytena för PR-extrakten varierade från 10,62 procent till 30,63 procent. De huvudsakliga fytokemiska komponenterna i PR-extrakten var flavonoider. Exceptionellt, de rosa rambutanextrakten från frön (PR-SM och PR-S-Sox) innehöll inte flavonoider utan visade endast glykosider som sina fytokemikalier. Endast PR-extrakten från de mogna och unga peelingarna från Maceration (M) visade närvaron av xantoner, som är en värmelabil polyfenol. Dessutom verkade extraktionsutbytena av PR-extrakten genom Soxhlet-extraktionen (Sox) vara högre än Macerationen (M).

3.2. Totalt innehåll av fenol (TPC), flavonoid (TFC) och quercetin i PR-extrakten

PR-extraktet från skal av unga frukter från Maceration (PRY-M) gav det högsta totala fenolhalten genom FolinCiocalteu-analysen på 67,6 0 ± 4,38 mgGAE/g, medan PR-extraktet från skal av unga frukter av Soxhlet-extraktion (PR-Y-Sox) gav det högsta totala flavonoidinnehållet genom den modifierade aluminiumkloridkolorimetriska analysen på 678,72 ± 23,59 mgQE/g (Fig. 1) (p < 0.05). PR-BM-, PR-SM- och PR-S-Sox-extrakten visade dock inget fenolinnehåll. Det visade sig att alla PR-extrakt visade quercetininnehållet som bestämts genom HPLC-analysen. Dessutom gav PR-extraktet från skal av mogna frukter genom Maceration (PR-RM) det högsta quercetininnehållet på 190,10 ± 0,28 lg/ml. (Fig. 2).

3.3. Antioxidant- och svamptyrosinashämmande aktiviteter av PR-extrakten

Tabell 2 visade de tre antioxidativa aktiviteterna, inklusive den fria radikal-fångande aktiviteten genom DPPH-metoden, lipidperoxidationsinhiberingen genom ferritiocyanatmetoden; metallkeleringen med FIC-metoden; och svamptyrosinasinhiberingen av PR-extrakten. De flesta av PR-extrakten utom PR-LM-, PR-BM- och PR-S-Sox-extrakten visade överlägsen fria radikalfångande aktivitet med SC5{{10}}-intervallet 0.{ {18}}23 – {{20}}.045 mg/mL, vilket var jämförbart med standard ʟ-askorbinsyra (SC50 av 0. 036 ± 0.{{40}}03 mg/ml) vid p < 0.05. Dessutom visade PR-LM-extraktet den högsta lipidperoxidationsinhiberingen med LC50 på 0.274 ± 0.029 mg/ml, och metallkeleringsaktiviteten med MC50 på 0,203 ± 0,021 mg/ml, vilket var jämförbart med standard a-tokoferol (LC50 på 0,122 ± 0,015 mg/ml) respektive EDTA (MC50 på 0,518 ± 0,034 mg/ml) (p < 0,05). Alla PR-extrakten visade svamptyrosinasinhiberingsaktiviteten, medan PR-R-Sox-extraktet visade den högsta aktiviteten med IC50 på 0,04 ± 0,02 mg/ml, vilket var jämförbart med standard kojinsyra (IC50 på 0,02 ± 0,01 mg) /ml) (p < 0,05).

3.4. Cytotoxicitet hos PR-extrakten

Fig. 3 showed the cytotoxicity on the B16F10 cells (A) human skin fibroblasts by the MTT assay of the PR extracts. All of the PR  extracts at the concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL had no cytotoxicity on the B16F10 cells and human skin fibroblasts, respectively since they gave>80 procent relativ livskraft jämfört med den obehandlade gruppen. Trots detta ansågs de högre koncentrationerna av alla PR-extrakt vara cytotoxiska på dessa celler. Den högre koncentrationen än 1 mg/ml testades inte eftersom den inte kunde lösas upp helt i lösningsmedlet.

3.5. Anti-melanogenes av PR-extrakten

In this study, there is a screening method from many samples,  therefore we highlight only the highest concentration that had no cytotoxicity on both cells and might have the highest anti-melanogenesis activity. This concentration is the highest concentration that showed no cytotoxicity on the B16F10 cells after being treated with the PR extracts and kojic acid (>80 procent cellviabilitet) (data visas inte). Fig. 4 uppvisade anti-melanogenesen på de murina melanomcellerna (B16F10) av PR-extrakten vid en koncentration av 0,01 mg/ml. Alla PR-extrakt uppvisade antimelanogenes på B16F10-celler. PR-extrakten från löv, grenar, frön och mogna och unga frukter genom Soxhlet-extraktionen (PR-L-Sox, PR-B-Sox, PR-S-Sox, PR-R-Sox och PR-Y-Sox ) visade den högsta anti-melanogenesen på 50,6–54,1 procent, vilket var dramatiskt överlägsen standardkojinsyran (37,9 ± 3,9 procent) med cirka 1,5 gånger, medan aktiviteten hos RB-M- och PR-YM-extrakten var jämförbar med standard kojinsyra (p < 0,05).

3.6. Stimulering av kollagenbiosyntes av PR-extrakten

Alla PR-extrakt i koncentrationen {{0}},1 mg/ml visade stimulering av kollagenbiosyntes på fibroblaster i mänsklig hud bestämd med Sirius Red-metoden. Koncentrationen av 0,1 mg/ml av PR-extrakten och ʟ-askorbinsyra är den högsta koncentrationen som inte visade någon cytotoxicitet på humana hudfibroblaster. PR-extrakten från löv och grenar genom Soxhlet-extraktionen (PR-LM- och PR-BM-extrakten) visade den högsta kollagenbiosyntesen (16,46 ± 0.{{20}}7 procent och 14,66 ± 0,09 procent respektive), vilket var lägre än standard ʟ-askorbinsyra (34,07 ± 0,03 procent) med cirka 2 gånger (p < 0,05) (Fig. 5).

3.7. Stimulering av anti-aging gener

Fig. 6 visade stimuleringen av anti-aging-gener inklusive Sirt1- och Foxo1-gener på humana hudfibroblaster av PR-extrakten vid 0.01 mg/ml bestämdes med RT-PCR-tekniken. Koncentrationen av {{20}}.01 mg/ml av PR-extrakten och resveratrol är den högsta koncentrationen som inte visade någon cytotoxicitet på humana hudfibroblaster. Intressant nog uppvisade PR-L-Sox-, PR-S-Sox-, PRR-M-, PR-R-Sox-, PR-YM- och PR-Y-Sox-extrakten vid 0,01 mg/ml den högsta stimuleringen av Foxo1 anti-aging mRNA-uttryck (495 bp), vilket var dramatiskt överlägset standardresveratrol med cirka 2 gånger (p < 0,05). Å andra sidan uppvisade PR-S-Sox- och PR-Y-Sox-extrakten den högsta stimuleringen av Sirt1 anti-aging mRNA-uttryck (160 bp), vilket var lägre än resveratrol (p < 0,05). Även om nästan alla PR-extrakt visade stimulering av anti-aging genuttryck, stimulerade PR-R-Sox- och PR-BM-extrakten inte Sirt1- respektive Foxo1-uttryck.

4. Diskussion

Flera naturliga växter har vanligtvis screenats för sina fytokemikalier, bioaktiva föreningar och biologiska egenskaper för att hitta nya lovande naturliga ingredienser för medicin, kosttillskott och kosmetiska tillämpningar. Rosa rambutan är en av de lokala frukterna i Klung-distriktet, Chanthaburi-provinsen, Thailand. Det finns några vetenskapliga rapporter om dess biologiska och farmaceutiska aktiviteter, särskilt dess anti-aging-aktivitet. I denna studie extraherades de fem delarna av rosa rambutan, inklusive löv, grenar, frön och skal från mogna och unga frukter, genom Maceration och Soxhlet-extraktionen med 95 procent etanol som lösningsmedel. Flera nyupptäckta fytokemikalier, inklusive quercetin, som är sekundära metaboliter av växter, har studerats för anti-aging effekter i celler, djur och människor (Phuong et al., 2020). Från resultaten av denna studie var flavonoider de viktigaste fytokemikalierna i PR-extrakten. Det har tidigare rapporterats att extrakten från de andra arterna av rambutan presenterades med fytokemikalier inklusive flavonoider, tanniner och karotenoider, som korrelerade med deras antioxidantegenskaper (Rohman, 2017). Frånvaron av xantoner genom Soxhlet-extraktionen kan bero på höga temperaturer (Yuvanatemiya et al. 2022, Sankeshwari et al., 2018). Quercetin är en av de mest förekommande fenol- och flavonoidföreningarna som finns i många frukter och grönsaker, såväl som i rambutan (Phuong et al., 2020). I denna studie kan den högre temperaturen (80 grader C) i Soxhlet-processen extrahera en icke värmelabil substans inklusive quercetin mer än den kalla processen. Mängden quercetin som bestäms genom HPLC-analys kan användas som en markör för kvalitetskontroll av PR-extrakten på produktionsskalan. Pearsons korrelationskoefficient (R2 ) mellan TFC och TPC för PR-extrakten var 0,825 vilket klassificerar ett mycket starkt samband (R2=± 0,80 till ± 1.00) (p < 0,01) vilket betyder om TFC ökas, skulle TPC också ökas dramatiskt. Dessutom var R2-koefficienten mellan TPC och quercetininnehållet i PR-extrakten 0,650, vilket klassificerade ett starkt samband (R2=± 0,60 till ± 0,79) (p < 0,05). Skillnaden i extraktionsutbyten, fytokemikalier, såväl som TPC, TFC och quercetin från PR-extrakten kan påverkas av lösningsmedlen, extraktionsprocesserna och temperaturerna (Chutoprapat et al., 2020). Flera studier har funnit att flavonoid- och fenolföreningar, såväl som quercetin, har ett brett utbud av biologiska och farmaceutiska aktiviteter, inklusive antimikrobiell, antioxidant-, antiinflammations- och anti-aging-aktivitet (Panche et al., 2016, Shahidi och Yeo, 2018, Musika et al., 2021, Wang et al., 2022).

Som tidigare nämnts kan radikala syrearter, eller ROS, orsaka åldersrelaterad skada på cell- och vävnadsnivåer, påskynda kronologiskt och miljömässigt åldrande som kännetecknas av rynkor och atypisk pigmentering (Papaccio et al., 2022). Naturliga antioxidanter kan ta bort fria radikaler, vilket resulterar i minskade antiinflammatoriska effekter, förebyggande av cancer, diabetes och hjärnsjukdomar, sänkning av blodtryck och åderförkalkning och bromsning av hudens åldrande (Miracle Uwa, 2{{20} }17). Rengöring av fria radikaler, hämning av lipidperoxidation och metallkelering har undersökts allmänt som system för att undersöka antioxidantaktiviteten hos naturliga produkter. För DPPH-fria radikaler reduceras de udda elektronerna i DPPH-molekyler genom att ta emot en väteatom från antioxidanter för att bli hydrazinmolekyler (Ionita, 2021). Lipidperoxidationsmetoden är baserad på oxidation av koppar (II) till koppar (III) joner som passeras av en linolsyraemulsion (Bakir et al., 2017), medan metallkeleringsmetoden är baserad på oxidation av koppar (II) för att bilda ett järn-ferrozinkomplex (Wong et al., 2014). Närvaron av flavonoid- och fenolhalt i PR-extrakten från denna studie kan ha bidragit till de tre antioxidativa aktiviteterna. Det visade sig att fenolföreningarna (t.ex. corilagin, ellaginsyra, geraniin och quercetin) från rambutanextrakten uppvisar antioxidantaktivitet genom DPPH-radikalavlägsnande och lipidperoxidationshämning (Hernández-Hernández et al., 2019, Phuong et al. 2019, Monrroy et al., 2020, Araujo et al., 2021). Detta liknar de tidigare rapporterna att skalextrakten från andra arter av rambutan uppvisar hög TPC och TFC, samt visar starkare antioxidantaktiviteter såsom ABTS, DPPH, O2-renande, järnreducerande analyskraft (FRAP) ), kelatbildare och lipidperoxidation (Lourith et al., 2017, Rohman, 2017, Monrroy et al., 2020). Intressant nog visade R2-koefficienten mellan metallkeleringen och lipidperoxidationsinhiberingen av PR-extrakten en mycket stark positiv korrelation på 0,953, vilket klassificerade ett starkt samband vid en signifikant nivå av p < 0,01.

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】