Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang och Hang-Ching Lin

Abstrakt

Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt(CTE) används redan som ett botaniskt receptbelagt läkemedel för behandling av demens i Kina. Våra tidigare studier rapporterade att fenyletanoidglykosider av CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt) har anti-Alzheimers sjukdom (AD) aktivitet genom att hämma amyloid peptid (A) aggregation och avsättning. Nyligen genomförda studier ansåg dock att fenyletanoidglykosiderna kan metaboliseras av tarmbakterier eftersom alla analysresultat visade att biotillgängligheten av fenyletanoidglykosider är extremt låg. I den här studien visar vi hur järnkelering spelar en avgörande roll i A-aggregations- och avsättningsinhiberingsmekanismen förfenyletanoidglykosiderav CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt). Dessutom bevisade vi ytterligare att fenyletanoidglykosider (1–3) kunde nå hjärnan. Aktiv CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)Bekräftelse av komponent och verkningsmekanism kommer att vara till stor hjälp för produktkvalitetskontroll och biotillgänglighetsstudier i framtiden. Samtidigt tillhandahåller vi en ny analysmetod användbar för att bestämma fenyletanoidglykosider (1–3) i växter, livsmedel, blod och vävnader för kemiska fingeravtryck och farmakokinetisk forskning.

Nyckelord: Cistanche tubulosa; fenyletanoidglykosider; Alzheimers sjukdom; järnkelering

Cistanche tubulosa

1. Introduktion

Demens är en av de vanligaste kroniska åldrandesjukdomarna. År 2015 uppskattade World Alzheimer Report att cirka 46,8 miljoner människor led av demens, och antalet förväntas vara 74,7 miljoner år 2030 och 131,5 miljoner år 2050 [1]. Den globala demenspopulationen kommer att öka år för år och bli utom kontroll i framtiden. De globala hälsovårdsutgifterna för att behandla demens uppgick till nästan 604 miljarder US-dollar 2010 och beloppet förväntas uppgå till 1000 miljarder år 2030 [2]. Demenspatienter löper större risk för oavsiktlig död [3] och kräver därför mer medicinsk vård. Detta är en tung börda för familjevårdare med demenspatienter. Demensinverkan på vårdgivare, familj och samhälle kan orsaka stor fysisk, psykologisk, livs- och ekonomisk stress. Det finns två huvudformer av demens, Alzheimers sjukdom (AD) och vaskulär demens [4,5]. AD är den vanligaste demenssjukdomen och är en irreversibel och progressiv neurodegenerativ störning [4–6]. AD var den sjätte vanligaste dödsorsaken i USA 2015 [6].

Nyligen genomförda studier stöder att neurontoxiciteten inducerad av amyloidpeptid (A) (plack) och protein tau (tangles) aggregation är nära relaterad till AD patogenes. Ansamlingen av A och protein tau i hjärnan kan leda till neuronskador och minnesförlust [7]. Olösliga A-oligomerer aggregerar i extracellulära plack och rapporterades leda till synaptisk dysfunktion, neurontoxicitet och celldöd [8]. Tyvärr finns det ingen effektiv behandling tillgänglig än så länge för att rensa A och protein tau, eller hämma bildningen eller oligomeriseringen av A, och suspendera eller bota den irreversibla neuronskadan. De nuvarande terapeutiska medlen, såsom galantamin och donepezil, som är acetylkolinesterashämmare, kan endast tillfälligt förbättra minnesförlusten genom att höja neurotransmittornivån. Under 2012 kunde inga läkemedelskandidater minska A-effekten i stora kliniska studier av AD-patienter [9]. Därför behövs forskning för en ny behandling för att undertrycka förekomsten av Alzheimers sjukdom akut. Metalljoner ansågs nyligen vara en nyckelfaktor nära besläktad med A-aggregation [10]. Metallkelatorer som betraktas som potentiella blyföreningar ger en helt ny strategi för anti-AD-metoden [9,11-15].

Den torkade stammen av Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, skördas i stor utsträckning i Xinjiang, Kinas öken. Det är en viktig traditionell kinesisk medicin som tillhör tonic kinesisk medicin indexerad i China Pharmacopeia och använts i tusentals år för behandling av fysisk svaghet, njurbrist, infertilitet, glömska, impotens och senil förstoppning [16,17].Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt(CTE) kapslar har godkänts som ett botaniskt läkemedel för vaskulär demens i Kina. Enligt en klinisk prövning av 18 patienter diagnostiserade med mild till måttlig AD, CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)kapslar gav patienterna ett mer stabilt minnestillstånd jämfört med acetylkolinesterashämmare [18]. I vår tidigare studie, CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)minskad amyloid peptid (A) deposition och förbättrad minnesförlust hos Alzheimers sjukdom-liknande råttor [19]. Fenyletanoidglykosider, echinakosid (1), akteosid (2) och iso-akteosid (3) anses vara huvudkomponenterna i CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)[20]. Förening 1 har neuroprotektiv aktivitet mot toxiciteten av 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) [21], 1-metyl -4-fenylpyridiniumjon (MPP plus ) [22], och 6-Hydroxidopamin (6-OHDA) [23]. Vår tidigare rapport visade att 1 undertryckte A-oligomerisering och toxicitet i en in vitro-studie och hämmade A-avsättning, vilket förbättrade nedsatt minne och kognitiv dysfunktion hos A-inducerade råttor [24]. Föreningarna 2 och 3 ökade A-nedbrytningen och minskade A-oligomeriseringen in vitro [25]. Förening 3 minskade A-avsättning i A-inducerade råttor [25]. Baserat på dessa studier har C. tubulosa redan visat att den har potential att behandla AD. CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)är nära relaterat till anti-A-aggregation och avsättning [24,25]. För att bättre förstå CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)mekanism måste vi ha en bekväm och effektiv metod för att identifiera den aktiva komponenten, såväl som innehållet i hjärnvävnadsprover. De flesta studier utformades för kvantitativ bestämning av echinakosid, acteosid och iso-acteosid i örter eller livsmedel genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC) [26–28], men endast två studier var för bestämning i serum eller vävnader [29, 30]. Det finns dock ingen rapport om samtidig analys av 1–3 i hjärnvävnad efter CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)muntlig administration. Dessutom är det fortfarande oklart från nyare studier om CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)aktiva komponenter eller deras metaboliter passerade framgångsrikt genom blod-hjärnbarriären och verkade på hjärnans neuroner. Därför ger denna forskning en avancerad och känslig metod med övertygande bevis som tydligt illustrerar den underliggande mekanismen för CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)mot A-aggregation och avsättning.

Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt

2. Resultat

2.1. Isolering och identifiering av tre huvudföreningar (1–3)

Torkade stjälkar av C. tubulosa extraherades med 75 % EtOH vid rumstemperatur. Det kondenserade 75-procentiga EtOH-extraktet utsattes för harts- och C18-kolonnkromatografi för att ge tre huvudföreningar, echinakosid (1), acteosid (2) och iso-acteosid (3). Deras strukturer klargjordes genom analys av NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spektroskopi och ESI-MS (Electrospray joniseringsmassa) och genom jämförelse med litteraturdata [31-33] (Figur 1, Kompletterande material Figurer S3-S11).

2.2. Innehållsanalysen för fenyletanoidglykosider (1–3) från CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)

Analysmetoden validerades för analys av fenyletanoidglykosider. Föreningarna 1–3 (5,0 mg) vägdes noggrant och blandades med 50 procent metanol (40 ml). Blandningarna sonikerades i 5 min. Tre fenyletanoidglykosider (1–3) standardlösning blandades som standardstamlösning (100 µg/ml). Standardstamlösningen användes för att framställa fem olika koncentrationer (5, 10, 25, 50 respektive 100 µg/ml) av de angivna lösningarna, genom att späda med serievolymer på 50 procent metanol. Fenyletanoidglykosiderna (1–3)-kurvorna upprättades med hjälp av ultra-performance-vätskekromatografi (UPLC) från 5–100 µg/ml och var linjära respektive (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Precisionen inom dagen och mellan dagar [procent RSD (relativ standardavvikelse) var från 0,1 till 1,8 procent] och noggrannheten (95,6–104,2 procent) var acceptabel av UPLC för 1–3. UPLC kvantifierade 1, 2 och 3 för CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)innehållet ska vara 254, 38 respektive 41 mg/g (Figur S2)

2.3. UPLC/MS/MS-validering

Fenyletanoidglykosiderna (1–3) blandades och spetsades med råtthjärnvävnadshomogenat och analyserades med hjälp av Ultra Performance vätskekromatografi-tandem masspektrometer (UPLC/MS/MS) med fastfasextraktion. Den nedre detektionsgränsen (LLOQ) på 1–3 var 0,2 ng/mL. Återvinningen av fenyletanoidglykosider spetsades med hjärnvävnadshomogenat (10 ng/ml) vid 91,39 procent för 1, 89,54 procent för 2 respektive 96,81 procent för 3 (Figur 2).

2.4. Analys av AD-liknande råtthjärnavävnader

Efter 14 dagars CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)oral administrering (200 mg/kg/dag), AD-liknande hjärnvävnader från råtta samlades upp och delades upp i två delar, hippocampus och striatum, och båda homogeniserades [19]. Eftersom hippocampus- och striatumhomogenaten från varje råtta var för få för att kunna laddas in i fastfasextraktion och för att undvika alltför stora experimentella fel, blandades hippocampus- och striatumhomogenaten från fyra individuella råttor till ett analyserat prov för UPLC/MS/MS med hjälp av fastfasextraktionsmetod (Figur 3A, B). Fenyletanoidglykosiderna (1–3) observerades i hippocampus (Figur 3A) och striatum (Figur 3B). Det fanns ingen signifikant topp i tomma hjärnvävnader (Figur 3C). I hippocampus var echinakosidhalten 11,97 ± {{20}},34 ng/ml, akteosidhalten var 1,25 ± 0,16 ng/mL och isoakteosidhalten var 1,38 ± 0,08 ng/ ml. I striatum var echinakosidhalten 22,60 ± 1,69 ng/ml, akteosidhalten var 2,03 ± 0,61 ng/ml och isoakteosidhalten var 4,90 ± 0,64 ng/ml. Som visas i figur 4, CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)skulle passera genom blod-hjärnbarriären enligt de signifikanta detekterbara mängderna 1–3 i hippocampus och striatum. Halten av 1 är mycket högre än 2 och 3 i CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)genom UPLC-analys (Figur S2). Därför är det rimligt att observera att 1 är högst i hjärnvävnad efter oral CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)administrering. Molecules 2019, 24, x FOR PEER GRANSKNING 4 av 12 2.4. Analys av AD-liknande råtthjärnavävnader efter 14 dagars CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)oral administrering (200 mg/kg/dag), AD-liknande hjärnvävnader från råtta samlades upp och delades upp i två delar, hippocampus och striatum, och båda homogeniserades [19]. Eftersom hippocampus- och striatumhomogenaten från varje råtta var för få för att kunna laddas in i fastfasextraktion och för att undvika alltför stora experimentella fel, blandades hippocampus- och striatumhomogenaten från fyra individuella råttor till ett analyserat prov för UPLC/MS/MS med hjälp av fastfasextraktionsmetod (Figur 3A, B). Fenyletanoidglykosiderna (1–3) observerades i hippocampus (Figur 3A) och striatum (Figur 3B). Det fanns ingen signifikant topp i tomma hjärnvävnader (Figur 3C). I hippocampus var echinakosidhalten 11,97 ± {{20}},34 ng/ml, akteosidhalten var 1,25 ± 0,16 ng/mL och isoakteosidhalten var 1,38 ± 0,08 ng/ ml. I striatum var echinakosidhalten 22,60 ± 1,69 ng/ml, akteosidhalten var 2,03 ± 0,61 ng/ml och isoakteosidhalten var 4,90 ± 0,64 ng/ml. Som visas i figur 4, CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)skulle passera genom blod-hjärnbarriären enligt de signifikanta detekterbara mängderna 1–3 i hippocampus och striatum. Halten av 1 är mycket högre än 2 och 3 i CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)genom UPLC-analys. Därför är det rimligt att observera att 1 är högst i hjärnvävnad efter oral CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)administratör.

2.5. Fenyletanoidglykosiderna (1–3) metallkelaterande aktivitet

I litteraturen utfördes bestämningen av de fria från föreningarna och deras metallkomplex med hjälp av HPLC [34,35]. Måttet på kelationsaktivitet analyserades med UPLC i denna studie. Lösningarna på 50 µg/mL av varje fenyletanoidglykosid (1–3) sattes till en 10 µg/ml lösning av koppar (Cu), kalcium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), järn (Fe) eller råttserum respektive. Varje förening med varje metalllösning eller serum analyserades med UPLC. Fenyletanoidglykosiderna (1–3) uppvisade metallkelaterande aktivitet med järn och serum (Figur 5, Tilläggsmaterial Figur S1). Molecules 2019, 24, x FOR PEER REVIEW 5 av 12 prov från AD-liknande råttor efter CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)oral administrering (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 min), 2 (tR= 5.13 min) och 3 (tR= 5.68 min)] . (c) Tom hjärnvävnad. Figur 4. Fenyletanoidglykosiderna (1–3) kunde detekteras i råtthjärnvävnader [19] med UPLC/MS/MS. Data representerade medelvärde ± SD, n=3 för varje grupp. 2.5. Fenyletanoidglykosider (1-3) metallkelaterande aktivitet. I litteraturen utfördes bestämningen av de fria från föreningarna och deras metallkomplex med hjälp av HPLC [34,35]. Måttet på kelationsaktivitet analyserades med UPLC i denna studie. Lösningarna på 50 ug/mL av varje fenyletanoidglykosid (1–3) sattes till en 10 ug/mL lösning av koppar (Cu), kalcium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), järn (Fe) eller råttserum respektive. Varje förening med varje metalllösning eller serum analyserades med UPLC. Fenyletanoidglykosiderna (1–3)

2.6. Analys av Echinacoside (1) i råttserum in Vivo

För att förstå fördelningen av echinakosid i råttserum samlades serumet från den initiala tiden till 720 minuter efter echinakosid (1) oral administrering (100 mg/kg) och serumet samlades från den initiala tiden till 720 minuter efter echinakosid (1) oral administrering (100 mg/kg) och analyserad med UPLC. Figur 6 visade koncentrations- kontra tidsprofiler för echinakosid i råttserum.

3. Diskussion

Demens, särskilt AD, är en oåterkallelig åldrande och kronisk sjukdom som leder till en gordisk mängd frågor. Denna oöverstigliga sjukdom leder till allvarliga ekonomiska problem med en enorm och ökande ekonomisk börda. Över hela världen lägger AD-forskare mycket ansträngning på att undersöka nya anti-AD-läkemedel men misslyckades i flera stora kliniska prövningar inriktade på A 2012 [9]. Förutom direkt inriktning på A anses metalljonhomeostas i hjärnan vara den viktigaste orsaken relaterad till A-aggregation och avsättning som leder till AD-bildning [9,10]. Därför spelar metalljoner en viktig roll i patogenesen av AD, och metallkelationshypotesen har blivit en viktig forskningsriktning [9,13-15].

Enligt våra tidigare studier [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)visade potentiell antidemensaktivitet. Även i humana kliniska studier, efter 1 års behandling med CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)kapslar för måttliga AD-patienter, skulle Alzheimers sjukdomsbedömning Scale-cognitive subscale (ADAS-cog) poäng inte visa någon signifikant försämring jämfört med före behandling [18]. CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)höll ADAS-kuggpoängen för AD-patienter stabilt, men andra receptbelagda läkemedel gjorde det inte. Det enda valet av receptbelagda läkemedel som är licensierade för AD-behandling är acetylkolinesterashämmare (AChEI) som donepezil och galantamin som förbättrar AD-symtom på kort sikt, men försämring sker efter 1 års behandling [36]. Baserat på kliniska studier, CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)har möjlighet att vara en potentiell behandling för utveckling av anti-AD medel. Baserat på våra tidigare rapporter [24,25] skulle echinakosid (1), acteosid (2) och iso-acteosid (3) skydda neuroner från skador av A, minska A-oligomerisering in vitro och signifikant förbättra kognitiv dysfunktion inducerad av A in vivo. In vitro-studien visade att de aktiva doserna på 1–3 var upp till 50 ug/ml [24,25]. Men tidigare studier ansåg att den orala biotillgängligheten av 1 och 2 var mycket låg (0,83 procent för 1 och 0,12 procent för 2) hos råttor [29,30]. Förening 1 kunde inte ens identifieras i humant serum efter oral administrering av echinaceatabletter [37]. Aktuella studier visar att 1–3 hade dålig membranpermeabilitet och absorption i tarmceller [38] och de flesta av 1 skulle metaboliseras i mag-tarmkanaler [39]. Innehållet av förening 2 i råttserum var endast cirka 4,5 ug/ml efter 15 minuters intravenös injektion med en dos på 10 mg/kg akteosid [30]. Denna studie visar dock att 1–3 skulle detekteras i hippocampus och striatum hos råtthjärnvävnader efter CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)oral administrering (figur 3 och 4). Dessutom visade figur 6 att innehållet av förening 1 i råttserum ökade cirka 5 gånger från 15 minuter till 720 minuter efter oral administrering av förening 1 (100 mg/kg). Vi övervägde fenyletanoidglykosider av CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)skulle passera genom blod-hjärnbarriären och det skulle finnas kelatverkan mellan CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)och metallen. Kelering är en reversibel kemisk reaktion. Järn är det väsentliga elementet i serum och hjärnan [10,40]. Figur 5 visar att tre fenyletanoidglykosider skulle ha metallkelaterande aktivitet med järn och serum. Järn och serum förändrar uppenbarligen toppretentionstidsytan för tre fenyletanoidglykosider. Järnkelatbildning kan vara den avgörande orsaken som leder till felaktig identifiering av den mycket låga biotillgängligheten av fenyletanoidglykosider. Därför bör metallkelateringsaktiviteten beaktas i blodserum- och hjärnanalys av de tre CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt)fenyletanoidglykosider för att återställa den verkliga biotillgängligheten och farmakokinetiken. Dessutom indikerade resultaten att tre fenyletanoidglykosider (1–3) skulle passera genom blod-hjärnbarriären och anlände till hjärnvävnad genom kroppscirkulationen. Denna studie utvecklade en mycket snabb och känslig metod för 1–3-analys med UPLC/MS/MS och gav kraftfulla bevis för att bevisa att fenyletanoidglykosider (1–3) är de viktigaste bioaktiva beståndsdelarna i CTE(Cistanche tubulosa vattenhaltigt extrakt).

Cistanche tubulosa extrakt

4. Material och metoder

4.1. Växtmaterial

Stammar av C. tubulosa samlades in i maj 2016 från Hangzhou, Kina. Anläggningen identifierades av Dr. Lin HC Voucherprover (nr 20016CT) har deponerats hos Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina.

4.2. Isolering och rening

Den torkade C. tubulosa-stammen maldes till pulver och extraherades sedan fem gånger med 75 procent EtOH. Efter lösningsmedelsavdunstning under reducerat tryck utsattes det råa extraktet för Macroporousresin AB-8 kolonnkromatografi med H2O/EtOH-gradientlösningsmedelssystem från 20 procent EtOH upp till 100 procent EtOH. Enligt tunnskiktskromatografin uppsamlades fyra fraktioner (Fr.1~Fr.4) för ytterligare separation. Fr. 2 utsattes för preparativ högpresterande vätskekromatografi (HPLC) på en COSMOSIL® 5C18-AR-II-kolonn (250 mm × 20 mm id, 5 µm) med användning av en 18 procent acetonitril som mobilfassystem. Medelhastigheten var 15 ml/min. Tre stora toppar av intresse samlades selektivt in. Fraktionerna som innehöll målföreningarna kondenserades ytterligare till torrhet och gav 1, 2 respektive 3.

4.3. Experimentell analys

1H och 13C NMR-spektra erhölls med användning av Bruker Avance DRX 500 MHz spektrometrar (Billerica, MA, USA) med tetrametylsilan (TMS) som intern standard. Preparativ HPLC utfördes med användning av en omvänd faskolonn (Cosmosil C18-AR-II kolumn, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japan) på en Shimadzu LC-6AD-serie apparat med Prominence HPLC UV-Visdetektorer (Kyoto, Japan).

Echinacoside (1):vitt pulver; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H{{10} }), 2,79 (2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha{{20}}), 3,79 (1H, m, H-30),3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J=7,9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2.0 Hz,H-6), 6.67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H{ {86}} ), 6,94 (1H,dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}}), 5 7,59 (IH, d, J=15,9 Hz, H-700); 13C-NMR(CD3OD, 125 MHz): 5 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 124}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2),76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 188}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 203}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 218}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (Figur S3–S5)

Akteosid (2):vitt pulver; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94(3H, d, J =5.9 Hz, H{{1{{ 156}}}}), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{20}}), 4,70 (1H, t, J=9,0 Hz, H-400), 5,01 (1H, s, H-1000), 6,18 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7.9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, d, J=7 .1Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz , H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60), 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H , d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 5 18,2 (C-6000), 35,1(C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{94} } ), 69,2 (C-400), 70,3 (C-3000), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000), 70,6 (C{{109} } ), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{{124} } ), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{{139} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{154} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6(C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{{169} } ) (Figurerna S6–S8).

Iso-akteosid (3):vitt pulver; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 1.07 (3H, d, J=6.1 Hz, H{{10} }), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H{{ 24}} ),6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,73(1H, d, J=1,6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60) , 7,04 (IH, s, H-20), 7,46 (IH, d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 5 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9(C-300), 100,7 (C-1000), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6(C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (Figurerna S9–S11).

4.4. Beredning av Cistanche Tubulosa vattenextrakt (CTE)

Stammen av Cistanche tubulosa-pulver extraherades två gånger genom återloppskokning med vatten i 1,5 h, och extraktlösningen filtrerades. Den filtreradeCistanche tubulosavattenhaltigt extrakt(CTE) förvarades vid 4 ◦C före användning.

5. Slutsatser

Denna studie visade att 1–3 är den aktiva komponenten i CTE för anti-AD-aktivitet. Järnkelering har blivit det nya konceptet för att designa en ny generation läkemedel för behandling av AD [41]. CTE är en potentiell botanisk anti-AD kinesisk medicin som riktar in sig på järnkelation-inducerad A-aggregation och deposition. Dessutom bevisade vi ytterligare att 1–3 skulle nå hjärnan genom blod-hjärnbarriären (BBB). Aktiva komponenter och underliggande mekanismbekräftelse av CTE kommer i hög grad att hjälpa kvalitetskontroll och biotillgängligheten av produktstudier i framtiden. Samtidigt kommer den avancerade och effektiva analysmetoden som presenteras att vara användbar för att bestämma 1–3 i växter, livsmedel, blod och hjärnvävnader för kemiska fingeravtryck och farmakokinetisk forskning.

Referenser

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et al. Den förändrade prevalensen och förekomsten av demens över tiden – aktuella bevis. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Demens: Tidig diagnos och tidig intervention. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Överlevnaden och egenskaperna hos äldre personer med och utan demens som är inlagda på sjukhus efter avsiktlig självskada. Int. J. Geriatr. Psych. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Prevalens av Alzheimers sjukdom och vaskulär demens: samband med utbildning. Rotterdamstudien. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Hall, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potocnik, F.; et al. Alzheimers sjukdom och vaskulär demens i utvecklingsländer: Prevalens, hantering och riskfaktorer. Lansett. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. Fakta och siffror om Alzheimers sjukdom 2018. Alzheimers demens. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Amyloidhypotesen om Alzheimers sjukdom: Framsteg och problem på vägen mot terapi. Science 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM Alzheimers sjukdom. N. Engl. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metallostas vid Alzheimers sjukdom. Fri radikal. Biol. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Metalljoneffekter på A- och Tau-aggregation. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Reglering av koppar- och järnhomeostas av metallkelatorer: En möjlig kemoterapi för Alzheimers sjukdom. A. Chem. Res. 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Koppar(I)-kelatorer för Alzheimers sjukdom. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Nya framsteg inom multifunktionella metallkelatorer som potentiella läkemedel för Alzheimers sjukdom. Coord. Chem. Upps. 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metallomics för behandling av Alzheimers sjukdom: Användning av en ny generation av kelatorer som kombinerar metall-katjonbindande och transportegenskaper. Eur. J. Med. Chem. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Metal-involverade terapeuter: En framväxande strategi för att bekämpa Alzheimers sjukdom. Coord. Chem. Upps. 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN kinesisk farmakopé; Chemical and Industrial Publisher: Beijing, China, 2005; sid. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): En av de bästa farmaceutiska gåvorna inom traditionell kinesisk medicin. Främre. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. En öppen, icke-placebokontrollerad studie på Cistanche tubulosa glykosidkapslar (memo regain (R)) för behandling av måttlig Alzheimers sjukdom. Am. J. Alzheimers Dis. Andra Demen. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversering av vattenhaltiga extrakt av Cistanche tubulosa från beteendebrister i Alzheimers sjukdomsliknande råttmodell: Relevans för amyloidavsättning och central neurotransmittorfunktion. BMC komplement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Analys av fenyletanoidglykosider i extraktet av herba Cistanchis genom LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Neuroprotektiva effekter av echinakosid i mus-MPTP-modellen av Parkinsons sjukdom. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Ja, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside skyddar mot MPP(plus)-inducerad neuronal apoptos via ROS/ATF3/CHOP-vägreglering. Neurosci. Tjur. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside skyddar mot 6-hydroxidopamin-inducerad mitokondriell dysfunktion och inflammatoriska svar i PC12-celler genom att minska ROS-produktionen. Evid. Baserat komplement. Alternativ. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside förbättrar minnesförsämringen och kolinergiska underskottet som induceras av amyloid-beta-peptider via hämning av amyloidavsättning och toxikologi. Matfunktion. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Akteosid och iso-akteosid skyddar amyloid-beta-peptid-inducerad cytotoxicitet, kognitiva underskott och neurokemiska störningar in vitro och in vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. [CrossRef]