Interferens av fenyletanoidglykosider från Cistanche Tubulosa med MTT-analysen

1. Introduktion

Den parasitära växtenCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceaefamiljen) är utbredd i nordafrikanska, arabiska och asiatiska länder [1]. De härstammar frånC. tubulosaochC. deserticolaär viktiga i traditionell kinesisk medicin, efter att ha använts för att behandla impotens, sterilitet, ryggraden och förstoppning på grund av kolontröghet [2]. Dessutom etanolextraktet avC. tubulosahar visat sig ha en signifikant skyddande effekt mot cerebral hypoxi hos möss [3].

Endotelceller spelar en avgörande roll i patogenesen av hypoxisk pulmonell hypertoni. Endotelcellinjen EA.hy926 liknar avsevärt primära endotelceller. Under vår studie av den antihypoxiska effekten av etanolextrakt av C. tubulosa på EA.hy926 endotelceller, märkte vi att 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl){{7 }},5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analys, som vanligtvis används för att bedöma cellviabilitet i studier av cytotoxicitet och cytostatisk aktivitet, genererade motstridiga resultat genom att visa ökad EA.hy926-cellviabilitet efter behandling.

Noggrann bedömning av cellviabilitet är avgörande för att identifiera potentiella cytotoxiska eller cytoskyddande effekter av ett läkemedel. Vi undersökte därför vilka komponenter som finns i C. tubulosa etanolextrakt som kan vara ansvariga för de motstridiga resultaten som observerats med MTT-analysen. Vi isolerade två huvudfenyletanoidglykosider (PhG)från C. tubulosa etanolextrakt,echinakosid (hädanefter förening 1) och akteosid (hädanefter förening 2). Vi bestämde deras effekt på EA.hy926-cellviabilitet med användning av en mängd olika metoder. Dessutom, för att ytterligare klargöra vilken substituent av föreningarna 1 och 2 som kan vara ansvarig för de motsägelsefulla resultaten, testade vi deras aglykoner, koffeinsyra (hädanefter förening 3) och 3,4-dihydroxylfenyletanol (hädanefter förening 4), på EA .hy926 cellviabilitet med samma metoder.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR HÄMNING AV APOPTOS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Resultat och diskussion

2.1. Identifiering av föreningar

Strukturerna för de två föreningarna isolerade frånC. tubulosa etanolextraktidentifierades med kärnmagnetisk resonans (NMR) och masspektrometri (MS) analyser, som visas i figur 1. Förening 1 identifierades som echinakosid genom jämförelse med tidigare rapporterad NMR (tabell 1) och MS (m/z 785 [M−H) ]− ) data [4]. NMR-spektra för förening 2 var mycket lika de för förening 1, förutom frånvaron av en -D-glukopyranosylgrupp (tabell 1). Förening 2 (m/z 623 [M-H]-) identifierades somakteosid[5]. Viktigt är att båda föreningarna har samma aglykon, vilket inkluderar koffeinsyra (förening 3) och 3,4-dihydroxylfenyletanol (förening 4).

2.2. Cellviabilitetsanalyser

MTT- och CCK{{0}}-analyser användes för att analysera effekten av föreningar 1–4 på EA.hy926-cellviabilitet. MTT-analysen visade att viabiliteten för EA.hy926-celler ökade signifikant efter behandling med 25 och 5 0 μM föreningar 1, 2 eller 3 (166,3 % och 174,1 % för förening 1, 205,8 % och 224,3 % för förening 2, respektive 164,8 % och 189,6 % för förening 3, jämfört med kontrollceller (Figur 2A). Vidare bestämde morfologisk inspektion av cellerna att behandling med 50 μM förening 1, 2 eller 3 ökade bildningen av lila formazankristaller, som är en direkt indikation på andelen levande celler (Figur 3). Omvänt antydde CCK-8-analysen att cellviabiliteten minskade signifikant efter behandling med 12,5, 25 och 50 μM förening 1, 2 eller 3 (75,5 %, 45,1 % och 43,7 % för förening 1, 85,5 %, 51,8 % och 34,3 % för förening 2, respektive 64,5 %, 48,2 % och 36,4 % för förening 3, jämfört med kontrollceller (Figur 2B). Förening 4 påverkade inte cellviabiliteten i varken MTT- eller CCK-8-analysen. Diskrepansen mellan resultaten som erhållits med de två analyserna tyder på att en av de två analyserna kanske inte exakt återspeglar effekterna av föreningarna 1 och 2 på EA.hy926-cellviabiliteten.

2.3. Apoptosbedömning av Hoechst

Färgning Hoechst 33342 är en cellpermeabel DNA-färgning som exciteras av ultraviolett ljus och avger blå fluorescens vid 460 till 490 nm. Det kondenserade kromatinet från apoptotiska celler färgas ljusare än kromatinet hos normala celler [6]. Medan kontrollceller uppvisade likformigt dispergerat kromatin, normala organeller och intakta cellmembran, visade celler inkuberade med 50 μM föreningar 1, 2 eller 3 i 48 timmar den typiska färgningen av apoptotiska celler (Figur 4A). Omvänt ökade inte exponering av celler för 50 μM av förening 4 antalet apoptotiska kärnor jämfört med kontrollbehandlingen.

2.4. Flödescytometrisk analys av apoptotiska celler

Annexin V-FITC/PI dubbelfärgningsanalysen identifierar apoptotiska celler genom högaffinitetsbindning av annexin V-FITC till fosfatidylserin, som externiseras i celler som genomgår apoptos [7]. I denna analys binder livsdugliga celler inte till vare sig annexin V eller PI och färgas därför inte (nedre vänstra kvadranten), tidiga apoptotiska celler färgas gröna genom bindningen av annexin V-FITC (nedre högra kvadranten) och sena apoptotiska celler färgas grönt och rött genom bindningen av annexin V-FITC till fosfatidylserin respektive PI till nekrotiska celler (övre högra kvadranten). Som visas i figur 4B, celler inkuberade med 50 μM föreningar 1, 2 eller 3 under 48 timmar, ökade andelen apoptotiska celler från 3,74 % (kontrollceller) till 10,32 %, 12,95 % respektive 11,30 %. Jämfört med kontrollceller ökade förening 4 inte procentandelen apoptotiska EA.hy926-celler.

I överensstämmelse med resultaten som erhölls med CCK-8-analysen och med Hoechst 33342-färgning, visade flödescytometrianalysen att föreningarna 1, 2 och 3 inducerade apoptos i EA.hy926-celler. Sammantaget tyder dessa observationer på att ökningen av EA.hy926-cellviabilitet som observerades med MTT-analysen efter behandling med föreningarna 1–3 representerade ett falskt positivt resultat.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖRBÄTKNING AV IMMUNITETEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Diskussion

1983 utvecklade Mosmann en kolorimetrisk MTT-mikroplattanalys för att mäta cellproliferation och cytotoxicitet [8]. Denna enkla analys, och dess modifieringar, används nu flitigt i cellbiologiska laboratorier runt om i världen. Fraktioneringsstudier i däggdjursceller indikerade att den reducerade pyridinnukleotidkofaktorn, NADH, är ansvarig för den mesta MTT-reduktionen. Detta stöddes av studier med hela celler [9]. MTT-reduktion är därför associerad med metaboliskt aktiva celler och är inte bara kopplad till mitokondriell andning utan även med cytoplasman och icke-mitokondriella membran inklusive endosom/lysosomkompartment och plasmamembran [10]. Den positiva nettoladdningen på MTT-molekylen är den primära faktorn för dess cellulära upptag via plasmamembranpotentialen.

Noterbart kan MTT-analysen ibland inte återspegla den faktiska effekten som en testad förening har på specifika celler. De kemiska strukturerna eller grupperna som kan orsaka motstridiga resultat i MTT-analysen har dock inte identifierats. Nyligen genomförda studier har visat att MTT-analysen kan underskatta den antiproliferativa effekten av (−)-epigallocatechin-3-gallat, den vanligaste polyfenolen i grönt te [11]. I studier som använder MTT-analysen för att detektera tumörkemokänslighet, visade kemoterapeutiska medel mot cancer, såsom epirubicin, paklitaxel, docetaxel och imatinibmesylat (Gleevec), ökad cellviabilitet [12,13]. Dessutom har flera studier rapporterat att vissa växtextrakt och redoxaktiva polyfenoler kan störa MTT-analysen eftersom de direkt reducerar MTT-tetrazoliumsaltet i frånvaro av celler [14].

Behovet av att solubilisera MTT-formazankristallerna före spektrofotometrisk analys i en mikroplattläsare och reaktionens inneboende slutpunktskaraktär begränsar användningen av MTT-analysen till vissa tillämpningar. Detta ledde till utvecklingen av tetrazoliumanaloger där fenyldelarna var dekorerade med negativt laddade sulfonatgrupper, såsom 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro- 5- sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid (XTT), ett negativt laddat inre salt [15] och 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5-(3-karboximetoxifenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS), ett svagt surt inre salt nära besläktat med MTT [16] . Dessa modifieringar resulterade i produktion av odlingsmediumlösliga formazanprodukter som eliminerade kravet på ett solubiliseringssteg före kvantifiering. På motsvarande sätt, eftersom den ökade negativa laddningen på dessa molekyler minskade deras förmåga att röra sig över cellmembran [17], intermediära elektronacceptorer (IEA), såsom 1-metoxi-5-metylfenazinmetylsulfat ({{25 }}metoxi PMS) krävdes för att underlätta reduktion av tetrazolfärgämne eller för att öka reduktionshastigheten.

På senare tid har en ny generation av vattenlösliga tetrazoliumsalter utvecklats där WST-1 är prototypen [18]. WST-1, ett negativt laddat disulfonerat innersalt som innehåller en jodrest, är mer stabilt än XTT och MTS i närvaro av 1-metoxi PMS, det är obligatoriskt IEA. Detta ledde till marknadsföringen av WST-1/1-metoxi PMS som ett bekvämt cellproliferationskit för enstaka reagenser. Flera andra tetrazoliumsalter i WST-serien har utvecklats, varav den mest användbara kanske är WST-8 [19]. WST-8 verkar ha mycket liknande cellulära reduktionsegenskaper som WST-1 och marknadsförs oberoende som CCK-8-analysen. WST-8 är cellogenomtränglig och reduceras därför extracellulärt, via elektrontransport från intracellulär NADH till WST-8 över plasmamembranet medierat av 1-metoxi-PMS. Även om både MTT- och WST-8/1-metoxi-PMS-reduktion drivs av intracellulär NADH, verkar källan till NADH skilja sig åt inom dessa två metoder. WST-8/1-metoxi-PMS-reduktion är mer beroende av malat/aspartat-skytteln som länkar mitokondriell trikarboxylsyracykel-NADH med det extramitokondriella utrymmet [20].

I preliminära experiment bekräftade vi att föreningarna 1, 2, 3 och 4 inte direkt kunde reducera MTT-tetrazoliumsaltet (ej visat). I föreliggande studie eliminerades den direkta påverkan av föreningarna själva med reagenset genom att noggrant tvätta mikroplattorna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innan MTT eller CCK-8-lösning tillsattes, enligt tillverkarens protokoll. Ändå var resultaten som erhölls med de två metoderna fortfarande motstridiga (Figur 2). Som förväntat ökade inkubation av celler med föreningarna 1, 2 och 3 reduktionen av tetrazoliumsaltet till lila formazan, jämfört med kontrollgruppen (Figur 3), vilket tyder på att enbart reduktion av tetrazoliumsaltet i närvaro av en specifik förening är inte tillräckligt för att bedöma föreningens förmåga att interferera med MTT-analysen.

För att bestämma om föreningarna 1, 2, 3 och 4 kunde inducera apoptos i EA.hy926-celler, utvärderades cellulära morfologiska förändringar och fosfatidylserinexternisering. I enlighet med minskningen av cellulär viabilitet som observerades med CCK-8-analysen, antydde resultaten av Hoechst-färgning och flödescytometrianalys med annexin V-FITC/PI att tillväxthämningen som observerades efter behandling med förening 1, 2 och 3 var på grund, åtminstone delvis, på EA.hy926-cellapoptos. Våra resultat stödde också idén att koffeylgruppen närvarande i både föreningarna 1 och 2 var ansvarig för de motsägelsefulla resultaten som erhölls med MTT-analysen.

I likhet med våra fynd uppvisade Rottlerin, en potent kaliumkanalöppnare med stor konduktans, inte reaktivitet mot MTT in vitro. Det förstärkte dock kraftigt bildandet av formazankristaller inuti celler, ett resultat som var i uppenbar konflikt med Rottlerin-hämning av NF-KB och cellproliferation observerad genom analys av [3H]-tymidininkorporering i DNA [21]. Mekanismen genom vilken Rottlerin förbättrade MTT-reduktionen tillskrevs dess mitokondriella frånkopplingseffekt [22]. Rottlerin har en cinnamoylsyrasubstituentgrupp. Jämfört med cinnamoylsyra har förening 3 ytterligare två hydroxylrester, som är belägna vid C-3 och C-4. Därför spekulerar vi att mekanismen genom vilken föreningar 1 och 2 orsakar motstridiga resultat i MTT-analysen också kan vara associerad med deras mitokondriella frikopplingseffekter. För att testa denna hypotes behövs jämförande studier mellan föreningarna 1 och 2, och en kemisk frånkopplare, såsom trifluorkarbonylcyanid fenylhydrazon (FCCP).

 NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Experimentell sektion

3.1. Reagens och kemikalier

Förening 3 (koffeinsyra-pulver, renhet=98.6%) köptes från Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Förening 4 (3,4-dihydroxylfenyletanol-olja, renhet=98,5%) erhölls från Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). MTT och dimetylsulfoxid (DMSO) erhölls från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). CCK-8-analysen köptes från Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Hoechst 33342 och annexin V-FITC/PI apoptosdetektionssatser köptes från Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kina).

3.2. Växtmaterial

C. tubulosastammar samlades in från Yutian Prefecture, Xinjiang Uygur autonoma region, Kina. Voucherprover deponerades i Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Kina) och autentiserades av Yi Zhang från Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, Kina).

3.3. Extraktion och isolering av växtmaterial

Lufttorkade C. tubulosa (0,6 kg) stjälkar pulveriserades och extraherades med 50% etanol under 2 timmar vid 70 grader. Efter avlägsnande av lösningsmedlet under reducerat tryck löstes det etanoliska extraktet (212,5 g) och suspenderades i vatten (2 1) och extraherades med n-butanol (2 1 x 3). N-butanolextraktet (110 g) kromatograferades på en polyamidkolonn och eluerades med etanol/vatten (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) vilket gav fem fraktioner (A–E) . Fraktion B (65 g) fraktionerades på en ODS-kolonn; eluering med etanol: vatten (1:9) separerade förening 1 (3 g). Fraktion D (10,5 g) fraktionerades på en ODS-kolonn; eluering med etanol/vatten (1:4) separerade förening 2 (1 g).

NMR-spektra registrerades på en Bruker Avance 600 spektrometer i CD3OD med tetrametylsilan (TMS) som intern standard. Masspektra utfördes på en BioTOF-Q-masspektrometer.

3.4. Cell kultur

EA.hy926-cellinjer erhölls från American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler odlades i RPMI 1640-medium, kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum och 1% (v/v) penicillin-streptomycin i en fuktad miljö med 5% CO2 vid 37 grader.

3.5. Cellviabilitet

Cellviabiliteten utvärderades med MTT- och CCK{{0}}-analyser. Föreningarna 1 och 2 och deras aglykoner, koffeinsyra (3) och 3,4-dihydroxylfenyletanol (4) löstes i DMSO till den slutliga DMSO-koncentrationen < 0,1 % (volym/volym) i odlingsmedia.

EA.hy926-celler såddes på 96-brunnsplattor med 4 × 103 celler/brunn. Efter inkubation i 24 timmar behandlades cellerna med 6,25–50 μM förening 1, 2, 3 eller 4 i 24 timmar. Odlingsmediet avlägsnades och cellerna tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Alikvoter (10 μL) av stam-MTT-lösning (5 mg·mL−1) sattes till varje brunn innehållande 100 μL medium och inkuberades med celler i 4 timmar. Efter inkubation avlägsnades mediet och 150 μL alikvoter av DMSO sattes till varje brunn för att solubilisera formazankristallerna. Absorbansen mättes vid 490 nm med användning av en mikroplattläsare (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Cellviabiliteten uttrycktes som procentandelen av MTT-reduktion, vilket tilldelade 100%-värdet till absorbansen hos kontrollcellerna. Alla experiment utfördes tre gånger och presenterades som medelvärde ± standardavvikelse (SD).

CCK-8-analysen utfördes enligt litteraturen med små modifieringar [23]. Specifikt behandlades celler med 6,25–50 μM föreningar 1, 2, 3 eller 4 i 24 timmar och tvättades två gånger med PBS innan tillsatsen av 10 μL CCK-8-lösning och 100 μL odlingsmedium. Efter inkubering av mikroplattan vid 37 grader under 2 timmar, mättes absorbansen vid 450 nm med användning av en mikroplattläsare. Cellviabilitet uttrycktes som procentandel viabla celler i förhållande till kontrollceller (100%). Alla experiment genomfördes tre gånger och uttrycktes som medelvärde ± SD.

3.6. Apoptosbedömning av Hoechst 33342 Färgning

Apoptotiska morfologiska förändringar observerades genom Hoechst 33342-färgning. Kortfattat såddes EA.hy926-celler på 48-brunnsplattor (2 × 104 celler/brunn) och behandlades med 50 μM förening 1, 2, 3 eller 4 i 48 timmar vid 37 grader, tvättades två gånger med PBS, och fixerad med 4% (v/v) paraformaldehyd under 15 min vid rumstemperatur. Efter sköljning två gånger med PBS färgades cellerna med Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) i 5 minuter vid rumstemperatur och tvättades två gånger med PBS. Hoechst-färgade kärnor visualiserades med användning av ett fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

3.7. Apoptosanalys genom flödescytometri

Apoptotiska celler detekterades genom annexin V-FITC/PI dubbelfärgning och flödescytometrianalys. Kortfattat, efter behandling med 50 μM förening 1, 2, 3 eller 4 i 48 timmar, skördades cellerna och återsuspenderades i PBS vid 1 × 105 celler·mL−1. Efter centrifugering vid 500 × g i 5 minuter vid 25 grader tillsattes 195 μL annexin V-FITC bindande buffert och 5 μL annexin V-FITC. Efter försiktig vortexblandning inkuberades blandningen i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker. Efter centrifugering vid 500 x g i 5 minuter vid 25 grader tillsattes 190 μL FITC-konjugerad annexin V-bindningsbuffert och 10 μL PI. Efter försiktig virvelblandning analyserades prover med en FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) inom 30 minuter.

3.8. Statistisk analys

Alla experimentella data uttrycktes som medelvärde ± SD. Betydelsen av skillnaderna mellan experimentella prover och motsvarande kontroll bedömdes genom envägsvariansanalys (ANOVA) med SPSS-mjukvaran (version 11.5). Statistisk signifikans sattes till p < 0.05.

4. Sammanfattningar

Våra resultat tyder på att en överskattning av antalet viabla celler som observerats i MTT-analysen kan maskera cytotoxiciteten hos vissa föreningar. Under läkemedelsscreeningsprocesser rekommenderar vi därför att du använder en mängd olika metoder för att bestämma effekten av den specifika föreningen på cellviabiliteten (som CCK-8- och 3 H-TdR-analyser) för att undvika att generera missvisande resultat.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FRÄMJA TESTOSTERONESEKRETION PHGS75% ECH 30% ACT 12%