Järntillskott fördröjer åldrande och förlänger cellulär livslängd genom förstärkning av mitokondriell funktion Ⅱ

3.2. Järntillskott ökar motståndskraften mot oxidativ stress

Klicka här för att få mer information om hur Cistanche minskar oxidativ stress i din kropp

Cellulärt åldrande är förknippat medökad oxidativ stresssom skadar de biologiska systemen och mildrar åldersrelaterade sjukdomar [34]. Eftersom järntillskott fördröjde åldrandet undersökte vi dess effekt påoxidativ stress. Vi använde enoxidativ stressinducerare förening, väteperoxid (H2O2), för att testa cellers oxidativa motstånd. Celler odlades först i närvaro av järn till det stationära fasen (72 timmar) i SD-medium. Efter det tvättades cellerna och inkuberades med olika koncentrationer av H2O2 i YPD-mediet och växte i 24 timmar.OxidativtStressbeständighet analyserades genom att jämföra celltillväxten hos de H2O2-behandlade cellerna med den obehandlade kontrollen. Vi fann att celler kompletterade med järn var resistenta mot oxidativ stress jämfört med kontrollen (figurer2a och S3). För att bekräfta att järntillskott ger motstånd mot oxidativ stress, tillsattes BPS till järn- och celltillväxt med H2O2 analyserades. Tillsatsen av BPS minskade den oxidativa stressbeständigheten hos järntillsatta celler (Figur2b). Dessa resultat korrelerar med järntillskottets roll för att fördröja åldrandet och förlänga den cellulära livslängden.

3.3. Järntillskott förstärker mitokondriella funktioner

Mitokondrier är det viktigaste cellulära navet för järnanvändning och metabolism [35-38]. En nedgång i mitokondriella funktioner är associerad med åldrande [39–43]. Järn fungerar som en kofaktor för flera mitokondriella proteiner, inklusive järn-svavelkluster och hem-innehållande proteiner [44-46]. Dessa järnhaltiga proteiner är involverade i mitokondriella trikarboxylsyra (TCA) cykeln och elektrontransportkedjan (ETC) (Figur 3a). Vi undersökte om ökningen av cellulär livslängd genom järntillskott krävde mitokondriella funktioner. För att testa detta analyserade vi uttrycket av mitokondriella TCA-cykelgener. Vi fann att järntillskott signifikant inducerar uttrycket av flera TCA-cykelgener (figur 3b och S4a). TCA-cykelmetaboliter -ketoglutarat och oxaloacetat kan producera glutamat och aspartat genom kataplerotiska reaktioner i mitokondrier (Figur 3a). Dessa aminosyror används i biosyntesen av proteiner, lipider och nukleotider [47-49]. Intressant nog minskade uttrycket av biosyntetiska gener för glutamat (GDH1 och GDH3) och aspartat (AAT1 och AAT2) i järntillsatta celler (Figur 3c). Denna uttrycksprofil antyder att järntillskott främjar konservering istället för konsumtion av TCA-cykelintermediärer. I överensstämmelse med denna idé ökade genuttrycket av de mitokondriella anaplerotiska väggenerna (PYC1, PYC2 och GDH2) signifikant i järntillsatta celler (Figur 3c). PYC1 och PYC2 kodar för pyruvatkarboxylas som omvandlar pyruvat till oxaloacetat. GDH2 kodar för glutamatdehydrogenas som syntetiserar -ketoglutarat från glutamat. Tillsammans tyder dessa resultat på att järntillskott konfigurerar cellerna i ett metaboliskt tillstånd som gynnar anapleros och förhindrar katapleros för att öka TCA-cykelns metaboliter.

Figur 3.Järntillskott förbättrar mitokondriella funktioner. (a) En översikt över mitokondriernaTCA (trikarboxylsyra) cykel och ETC (elektrontransportkedja) med de viktigaste kataplerotiska ochanaplerotiska reaktioner illustreras. (bDen prototrofa jäststammen inkuberades med 100µM FeSO4 och odlas i ett SD-medium i 8 timmar vid 30◦C. RNA extraherades från kulturerna och deuttryck av de angivna TCA-cykelgenerna analyserades med kvantitativ RT-PCR. (c) Uttryckanalys av kataplerotiska gener (GDH1, GDH3, AAT1,ochAAT2) och anaplerotiska gener (PYC1, PYC2,ochGDH220 RT-PCR. (d) Expressionsanalys av ETC-gener gjordes avkvantitativ RT-PCR. Statistisk signifikans (*p < 0.05) was determined by Student's t-testa.

TCA-cykelreaktioner genererar NADH och FADH2 som oxideras av ETC-komplex I och II och som krävs för TCA-cykelns funktionalitet (Figur3a). FastänS. cerevisiaesaknar komplex I, reducerande ekvivalenter överförs till andningskedjan genom NADH-dehydrogenaser. Succinatdehydrogenas spelar en central roll och deltar i både TCA-cykeln och ETC-komplexet II (Figur3a). Påfallande nog uttrycket av succinatdehydrogenas (SDH1ochSDH2) var starkt uppreglerad bland alla analyserade TCA-cykelgener (Figur3b,d). Dessa resultat indikerar att TCA-cykelflödet fortsätter mot ETC istället för att ackumulera en viss mellanprodukt. Likaså var uttrycket av alla andra gener av ETC-komplex starkt uppreglerat i järntillsatta celler (figur3d). ETC är förknippat med genereringen av reaktiva syrearter (ROS), som reglerar uttrycket avSOD2gen [50]. Det kodar för ett mangan-superoxiddismutas (MnSOD) som är den huvudsakliga rensaren av mitokondriell superoxid.SOD2genuttryck uppreglerades i järntillsatta celler (kompletterande figur S4a) vilket överensstämmer med uttrycket av ETC-gener. Vi analyserade vidare den mitokondriella membranpotentialen (MMP) som genereras av protonpumparna av ETC-komplex I, III och IV. Vi fann att järntillskott ökade MMP av cellerna (kompletterande figur S4b). Vi undersökte sedan strukturen av mitokondrier med fluorescensmikroskopi. Vi fann att järntillskott förhindrar fragmentering av mitokondrier (kompletterande figur S4c). Sammantaget indikerar dessa resultat att järntillskott potentierar de mitokondriella funktionerna hos celler.

3.4. Järntillskott ökar ATP-nivån som krävs för att förlänga cellulär livslängd

Mitokondriella TCA-cykelreaktioner producerar reducerande ekvivalenter NADH och FADH2 som överför elektroner till ETC och genererar adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) (Figur3a). Eftersom uttrycket av TCA-cykeln och ETC-gener förbättrades av järntillskott, testade vi dess effekt på ATP-syntes. I överensstämmelse med uttrycksprofilen för den mitokondriella TCA-cykeln var ETC-genexpression och ATP-nivåer höga i järntillsatta celler (Figur4a). Vi frågade sedan om ATP krävs för att förlänga livslängden för järntillsatta celler. Vi hämmade ATP-syntesen och mätte CLS för jäst. Antimycin A (AMA) är en hämmare av ATP-syntes som binder till komplex III och blockerar elektronöverföring i mitokondriella ETC [51]. Vi undersökte först ATP-nivån och fann att AMA-behandling hämmar ATP-syntes (Figur4b). Vi testade vidare effekten av AMA på den cellulära livslängden för järntillsatta celler. Jästceller inkuberades med järn och AMA i SD-mediet. Tillväxten av celler nådde mättnad efter 24 timmar (kompletterande figur S5). Därefter mätte vi överlevnaden och fann att AMA-behandling hämmar den järntillskottsmedierade förlängningen av livslängden (figur4c). Tillsammans visar dessa fynd att järntillskott ökar ATP-nivån som krävs för att förlänga cellulär livslängd. Vi observerade också att livslängden för AMA-behandlade celler var lägre än kontrollen (Figur4c), vilket ytterligare bekräftar att oförmågan att syntetisera ATP äventyrade livslängden.

3.5. Järntillskott förhindrar accelererat åldrande av AMPK Knockout Mutant

AMPK är huvudregulatorn för cellulär energihomeostas [20,21]. Den mycket konserverade humana analogen av AMPK i jästS. cerevisiaeär Snf1-proteinet [52]. AMPK aktiverar mitokondriella funktioner för att producera ATP under energibegränsade förhållanden. Färska rapporter har visat att nedgången i mitokondriella funktioner med åldern delvis sker genom den försämrade aktiviteten av AMPK i olika åldrade organismer [53,54]. Således påverkar frånvaron av AMPK-aktivitet mitokondriella funktioner och äventyrar många cellulära funktioner inklusive metabolism, motståndskraft mot stress och cellöverlevnad som är de mest kritiska bestämningsfaktorerna för åldrande och livslängd. I enlighet med tidigare studier har vifann attsnf1knockoutmutation äventyrade ATP-nivån, motståndskraften mot oxidativ stress och livslängden (Figur5a–c). 

Figur 5.Järntillskott räddar det accelererade åldrandet av AMPK knockout-mutanten. Dejäst prototrofisk vildtyp och AMPK knockout mutant (snf1∆) stammar odlades till stationärafas i SD-medium i 72 timmar vid 30◦C. (a) ATP-analys av vildtyp ochsnf1∆ stammar. (b) Oxidativtstressanalys av vildtyp ochsnf1∆ stammar med olika H2O2 koncentrationer. (c) Kronologisklivslängd (CLS) analys av vildtyp ochsnf1∆ stammar. (d) ATP-analys av vildtyp ochsnf1∆ stammarinkuberas med olika koncentrationer av FeSO4. (e) Oxidativ stressanalys av vildtyp ochsnf1∆ stammar inkuberade med olika koncentrationer av FeSO4. (f) CLS-analys av vildtyp ochsnf1∆ stammar inkuberade med olika koncentrationer av FeSO4. Statistisk signifikans (*p < 0.05) was determinedav studentent-testa.

Sedansnf1mutanten är defekt i mitokondriella funktioner, vi testade om järntillskott kan rädda de accelererade åldrande fenotyperna. Därför kompletterade vi järnet tillsnf1mutant och analyserade ATP-nivån, oxidativ stress och livslängd. Vi fann att järntillskott ökade ATP-nivån, motståndskraften mot oxidativ stress och livslängden (Figur5d–f). Sammantaget bekräftade dessa fynd att järntillskott fördröjer åldrande och förlänger cellulär livslängd genom att öka mitokondriernas funktioner.

4. Diskussion

Näringsämnen bestämmer cellers funktionella status och bristen på viktiga näringsämnen äventyrar människors hälsa [55,56]. Dessutom är näringsämnen de viktigaste regulatorerna av cellulär metabolism som styr flera biologiska processer inklusiveåldrande, en stor riskfaktor av flerakroniska sjukdomar. En nedgång imetabolisk aktivitetär ett av kännetecknen föråldrande [10]. Ny forskning på olika organismer, inklusive däggdjur, har visat att det är möjligt att fördröja åldrandet och öka hälsointervallet genom anti-aging interventioner inklusive administrering av rapamycin och metformin.11,16]. Dessa läkemedel riktar sig mot de näringsavkännande komplexen TORC1 och AMPK som är de viktiga metaboliska regulatorerna av cellerna [11,16]. 

Järn är ett viktigt näringsämne involverat i flera avgörande metaboliska reaktioner i cellerna [23–26]. Järnbrist försämrar metabolisk aktivitet vilket resulterar i försämrade cellulära funktioner, vilket leder till många sjukdomar, inklusive anemi, kognitiv försämring och förlust avmuskelstyrka [26,57–59]. Järnbrist är utbredd i äldre populationerStörre än eller lika med65 år [60–62]. 

Eftersom järn reglerar metaboliska processer, undersökte vi dess roll i åldrandet. Vi använde jäst som en modellorganism för att undersöka järnets roll i kronologiskt åldrande. Vi undersökte effekten av järntillskott på jästs CLS. Vi fann att både FeSO4 och FeCl3 ökade den cellulära livslängden. Med hjälp av olika salter av sulfat, klorid och järnkelator bekräftade vi att cellernas livslängd förlängs med järn. Åldrande är relaterat till en gradvis ackumulering av oxidativ stress, vilket är skadligt för cellulära funktioner och minskar cellöverlevnad [34]. Eftersom vi fann att järntillskott fördröjde åldrandet, testade vi om det kunde ge motståndskraft mot oxidativ stress. För att undersöka fenotypen oxidativ stress behandlade vi cellerna med det oxidativa inducermedlet H2O2 och mätte cellöverlevnaden. Vi fann att järntillskott ökade motståndet mot oxidativ stress jämfört med kontroll. Dessa fynd korrelerar med järntillskottets roll i förlängningen av livslängden.

Vi avslöjade ytterligare anti-aging-mekanismen för järntillskott. Mitokondrier är de huvudsakliga cellulära konsumenterna av järnanvändning och metabolism [35–38]. Vi analyserade först uttrycket av mitokondriella TCA-cykelgener. Vi fann att uttrycket av nästan alla TCA-cykelgener uppreglerades av järntillskott. Viktigt är att järntillskott nedreglerade uttrycket av mitokondriell anapleros och uppreglerade kataplerotiska metaboliska gener. Dessa resultat avslöjar att järntillskott förbättrar syntesen av TCA-cykelintermediärer och förhindrar deras cellulära utnyttjande. Dessa fynd stödde anti-aging-aktiviteten av järntillskott, eftersom regelbunden export av TCA-cykelintermediärer påverkar mitokondriell integritet [47]. Dessutom är det viktigt att fylla på den mitokondriella kolpoolen för att bibehålla de mitokondriella funktioner som krävs för överlevnad under cellulärt åldrande.

TCA-cykeln mellanliggande -ketoglutarat har visat sig förlänga livslängden för olika organismer [63]. Vi fann dock att järntillskott ökade uttrycket av -ketoglutarat dehydrogenas (KGD1ochKGD2) som konverterar - ketoglutarat för att bilda succinyl-CoA. Dessutom observerade vi att uttrycket av succinatdehydrogenasgener (SDH1ochSDH2) var starkt uppreglerad bland andra testade gener i TCA-cykeln. Viktigt är att succinatdehydrogenas deltar i både TCA-cykeln och ETC-komplexet II. Dessa resultat antydde att istället för att ackumulera en viss TCA-cykelmellanprodukt, kan anti-aging-aktiviteten av järntillskott involvera ETC-vägen.

Eftersom TCA-cykeln är funktionellt kopplad till ETC, analyserade vi uttrycket av ETC-gener. Vi fann att järntillskott kraftigt uppreglerade uttrycket av ETC-gener. TCA-cykelprodukterna NADH och FADH2 oxideras av ETC-komplex och genererar ATP genom OXPHOS. Vi fann att järntillskott ökar den cellulära ATP-nivån, vilket är korrelerat med uppregleringen av TCA-cykeln och ETC-gener. Därefter klargjorde vi om ökningen av ATP-nivån genom järntillskott krävs för att förlänga cellulär livslängd. Vi fann att förlängning av livslängden genom järntillskott avskaffades genom att hämma ATP-syntesen. Således tyder dessa fynd på att järntillskott ökar nivån av ATP som krävs för att förlänga cellulär livslängd. Våra resultat överensstämmer med de tidigare rapporterna som visar ATP:s roll i den cellulära livslängden [51,64,65]. Vidare använde vi järntillskott för att förbättra mitokondriella funktioner och räddade den korta livslängden och oxidativ stresskänsliga fenotypen av AMPK-mutanten. Sammantaget avslöjade dessa resultat att järntillskott potentierar de mitokondriella funktionerna som fördröjer åldrandet och ökar cellernas livslängd.

Nyligen genomförda studier har visat att järntillskott återställer mitokondriella defekter hos lysosomskadade mutanter och förhindrar mitokondriell minskning under åldrande [66,67]. Således stödjer våra resultat de tidigare fynden att järntillskott förbättrar mitokondriella funktioner. Intressant nog visade en av de tidigare studierna att järntillskott räddade det accelererade replikativa åldrandet av lysosomförsvagade mutanter; dockeffekt på vildtypscellerna inkluderades inte i rapporten [67]. Ändå är våra resultat korrelerade med tidigare fynd, och trots olika åldrandemodeller (kronologiskt åldrande) fann vi att järntillskott fördröjer åldrandet och ökar cellulär livslängd. Sålunda, kollektivt, tyder våra resultat och tidigare rapporter tydligt på att järntillskott kan vara ett potentiellt terapeutiskt medel för att rikta in sig på åldrande och öka hälsan.

Tilläggsmaterial:Figur S1: Tillväxt och kronologisk livslängdsanalys av järntillsatta jästceller; Figur S2: Tillväxtanalys av olika järn-, sulfat- och kloridhaltiga salter-kompletterade jästceller; Figur S3: Oxidativ stressresistensanalys av järntillsatta jästceller. Figur S4: Mitokondriellt genuttryck, membranpotential och strukturanalys av järntillsatta jästceller; Figur S5: Tillväxtanalys av järn- och antimycin A-kompletterade jästceller; Tabell S1: Lista över primrar som används för RT-PCR i denna studie.

Författarbidrag:JLJ: Metodik, formell analys, utredning och granskning; TCYN: Metodik, formell analys, undersökning och granskning; FN: Validering, formell analys och granskning; FE: Granskning, redigering och övervakning; MA: konceptualisering, datakurering, metodik, skrivande, granskning, redigering och handledning. Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:Detta arbete stöddes av Bioinformatics Institute (BII), A*STAR Career Development Fund (C210112008) och anslaget Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758-00).

Erkännanden:Vi tackar Maurer-Stroh Sebastian, Lee Hwee Kuan, Loo Lit Hsin, Chiam Keng Hwee och Prakash Arumugam för att de stöder denna forskning.

Intressekonflikt:Författarna förklarar inga konkurrerande finansiella och icke-finansiella intressen.

Referenser

1. Bloom, DE; Canning, D.; Lubet, A. Global befolknings åldrande: fakta, utmaningar, lösningar och perspektiv.Chall. Lösning. Perspektiv. Daedalus2015, 144, 80–92. 

2. Förenta nationernas avdelning för ekonomiska och sociala frågor, befolkningsavdelningen.Utsikter över världens befolkning 2019; Höjdpunkter (ST/ESA/SERA/423); FN: New York, NY, USA, 2019.

3. Robine, J.Åldrande befolkningar: Vi lever längre liv, men är vi friskare?FN, Department of Economics and Social Affairs, Population Division: New York, NY, USA, 2021; UN DESA/POP/2021/TP/NO.

4. Niccoli, T.; Partridge, L. Åldrande som riskfaktor för sjukdom.Curr. Biol.2012, 22, R741–R752. [CrossRef] [PubMed] 

5. Hou, Y.; Dan, X.; Babbar, M.; Wei, Y.; Hasselbalch, SG; Croteau, DL; Bohr, VA Åldrande som en riskfaktor för neurodegenerativ sjukdom.Nat. Rev. Neurol.2019, 15, 565–581. [CrossRef] [PubMed] 

6. Harman, D. Åldrandeprocessen: Stor riskfaktor för sjukdom och död.Proc. Natl. Acad. Sci. USA1991, 88, 5360–5363. [CrossRef] [PubMed] 

7. Partridge, L.; Deelen, J.; Slagboom, PE Att möta de globala utmaningarna med åldrande.Natur2018, 561, 45–56. [CrossRef] [PubMed] 8. Fontana, L.; Kennedy,

BK; Longo, VD; Seals, D.; Melov, S. Medicinsk forskning: Behandla åldrande.Natur2014, 511, 405–407. [CrossRef] [PubMed] 

9. Fontana, L.; Partridge, L.; Longo, VD Förlänger en hälsosam livslängd - från jäst till människor.Vetenskap2010, 328, 321–326. [CrossRef] [PubMed] 

10. López-Otín, C; Blasco, MA; Partridge, L.; Serrano, M.; Kroemer, G. Åldrandets kännetecken.Cell2013, 153, 1194–1217. [CrossRef] 

11. Partridge, L.; Fuentealba, M.; Kennedy, BK Strävan att bromsa åldrandet genom drogupptäckt.Nat. Rev. Drug Discov.2020, 19, 513–532. [CrossRef]

12. Zimmermann, A.; Hofer, S.; Pendl, T.; Kainz, K.; Gjord av.; Carmona-Gutierrez, D. Jäst som ett verktyg för att identifiera anti-aging föreningar.FEMS Jäst Res.2018, 18, foy020. [CrossRef] 

13. Kaeberlein, M.; Burtner, CR; Kennedy, BK Den senaste utvecklingen inom jäståldring.PLoS Genet.2007, 3, e84. [CrossRef] 

14. Longo, VD; Shadel, GS; Kaeberlein, M.; Kennedy, B. Replikativt och kronologiskt åldrande iSaccharomyces cerevisiae. Cell Metab.2012, 16, 18–31. [CrossRef] 15. Longo, VD; Fabrizio, P. Kronologisk åldrande i Saccharomyces cerevisiae.Åldrande Res. Jäst2011, 57, 101–121. [CrossRef] 

16. Kulkarni, AS; Gubbi, S.; Barzilai, N. Fördelar med metformin för att dämpa åldrandets kännetecken.Cell Metab.2020, 32, 15–30. [CrossRef] 

17. Alfatah, M.; Wong, JH; Krishnan, VG; Lee, YC; Sin, QF; Goh, CJH; Kong, KW; Lee, WT; Lewis, J.; Hoon, S.; et al. TORC1 reglerar transkriptionssvaret på glukos och utvecklingscykeln via Tap42-Sit4-Rrd1/2-vägen i Saccharomyces cerevisiae.BMC Biol.2021, 19, 1–22. [CrossRef] 

18. Saxton, RA; Sabatini, DM mTOR-signalering i tillväxt, metabolism och sjukdom.Cell2017, 168, 960–976. [CrossRef]