Njursjukdomsassocierade varianter av Apolipoprotein L1 visar funktionsökning i katjonkanalaktivitet

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno och John C. Edwards

Varianter i Apolipoprotein L1 (ApoL1) är kända för att vara ansvariga för ökad risk för vissa progressivanjuresjukdomarbland människor med afrikansk härkomst. ApoL1 är ett amfitropiskt protein som kan infogas i fosfolipidmembran och ge anjon- eller katjonselektiv permeabilitet till fosfolipidmembran beroende på pH. Huruvida dessa aktiviteter skiljer sig mellan varianterna eller om de bidrar till sjukdomspatogenes är okänt. Vi använde analyser av spänningsdrivet jonflöde från fosfolipidvesiklar och stabilmembranassociation för att bedöma skillnader mellan ApoL1isoformer. Det finns en signifikant (ungefär tvåfaldig) ökning av den katjonselektiva jonpermeasaktiviteten för de två njursjukdomsassocierade varianterna jämfört med referensproteinet. Däremot finner vi ingen skillnad i den anjonselektiva permeasaktiviteten vid lågt pH bland isoformerna. Jämfört med referenssekvensen visar de två sjukdomsassocierade varianterna ökad stabil association med fosfolipidvesiklar under förhållanden som stöder katjonpermeasaktiviteten, vilket tyder på att ökad aktivitet kan bero på mer effektiv membranassociation och -insättning. Det finns ingen skillnad i membranassociation mellan isoformer under optimala förhållanden för anjonpermeasaktiviteten. Dessa data stödjer en modell där förbättrad katjonpermeabilitet kan bidra till de progressiva njursjukdomar som är associerade med högrisk ApoL1-alleler.

Två distinkta varianter av proteinet ApoL1 är kända för att vara ansvariga för den erkända ökade risken för progressiv proteinurisknjuresjukdomhos människor av afrikansk härkomst, särskilt på grund av fokal segmentell glomeruloskleros, hypertensiv nefroskleros och HIV-associerad nefropati (1–3). ApoL1:s funktionella roller i mänskliga celler, inverkan av de sjukdomsassocierade varianterna på dessa funktioner och hur eventuella sådana förändringar inaktivitet kan accelereranjursjukdomär otydliga (4, 5).

Den enda biokemiska aktiviteten som ApoL1-proteinet är känt för att ha är att fungera som en jonkanal. Den N-terminala domänen av ApoL1 har noterats ha strukturell likhet med bakteriellt kolicin A1 (6). Liksom colicin A1 är ApoL1 ett amfitropiskt protein som under vissa omständigheter kan tränga in i ett lipidmembran från en vattenlösning och sedan fungera som en jonpermeas (6–9). Renad rekombinant ApoL1 av vildtyp är stabil i tvättmedelslösning vid neutralt pH (8, 9). Vid lågt pH kan ApoL1 komma in i fosfolipidmembran och öka membranens anjonselektiva permeabilitet (6, 7, 9). När cis-pH höjs tillbaka till neutralt undertrycks den anjonselektiva permeabiliteten och en katjonselektiv kanal aktiveras (8, 9). Dessa data stöder en modell i vilken ApoL1, som presenteras för ett surt fack längs antingen de exocytiska eller endocytiska vägarna, kunde infogas i organellens begränsande membran vilket leder till ökad anjonpermeabilitet. Efterföljande transport av proteinet till andra membranavdelningar där cis-pH skulle vara neutralt (såsom plasmamembranet eller mitokondriella membran) skulle undertrycka anjonpermeabiliteten och aktivera katjonpermeaset. Huruvida dessa jonpermeasaktiviteter spelar en roll i patogenesen av ApoL1-associeradnjur-sjukdomarär oklart.

Vi använde vesikelbaserade metoder för att analysera skillnader i jonpermeasaktiviteter och membranbindning mellan deras referenssekvens (vildtyp), betecknad G0, och de tvåsjukdomsassocierade varianterna, betecknade G1 och G2. Vi finner att jämfört med G0 visar både G1 och G2 isoformer ökad specifik aktivitet av katjonpermeasaktiviteten vid neutralt pH utan att ändra den anjonselektiva permeasaktiviteten vid lågt pH. Vidare visar de sjukdomsassocierade isoformerna G1 och G2 ökad stabil membranassociation jämfört med G0 under förhållanden som stödjer katjonpermeasaktiviteten men inte under förhållanden som stöder teanjonpermeasaktivitet. Vi finner ingen effekt på mönstret av pH-känslighet för vare sig bindningssteget eller utflödessteget av katjonkanalaktiviteten, och vi finner ingen effekt på pH-känsligheten för den anjonselektiva permeasaktiviteten. Vi drar slutsatsen att de sjukdomsassocierade varianterna av ApoL1 selektivt förbättrar katjonkanalaktiviteten hos proteinet, troligen åtminstone delvis genom att förbättra membraninsertion. Vi föreslår att denna förbättrade kanalaktivitet bidrar till progressivnjuresjukdomhos personer som bär på högriskgenotyper.

Cistanche kan behandlanjursjukdom

Resultat

Rekombinanta isoformer av ApoL1 med den N-terminala signalsekvensen avlägsnad och ersatt med en 6His/T7epitop-markör uttrycktes och renades. Alla tre visade identiska kromatografiska egenskaper genom reningen och kunde inte särskiljas genom gelelektrofores Figur 1.

Toppfraktioner späddes till 100 ug/ml och utsattes för tovesikelutflödesanalyser för förmågan att ge klorid- och kaliumpermeabilitet. Analysen består av två separata steg. I associationsstadiet blandas ApoL1 med KCl-laddade fosfolipidvesiklar och tillåts införas i membranen. Extravehikulär KCl och buffert avlägsnas sedan genom passage genom en avsaltningsspinkolonn jämviktad i isoton sackaros, vilket genererar stora inifrån-till-utvändiga gradienter av både Kand Cl-joner. I utflödessteget späds spinnkolonn-eluatet ut i en isotonisk buffrad sackaroslösning som håller KCl-gradienten vid det önskade pH-värdet. Extravehikulär Cl-koncentration övervakas med en klorid-selektiv elektrod. Även om antingen K- eller Cl-selektiv permeabilitet är närvarande, kommer ingendera att kunna lämna vesiklarna på grund av bristande motjonrörelse. Spänningsdrivet jonutflöde initieras genom tillsats av en mättande koncentration av en motjonofor. Tillsatsen av den K-selektiva jonoforen, valinomycin(Val), kommer att inducera en stor inre negativ membranpotential som, om Cl-permeabilitet är närvarande, kommer att driva KCl-utflöde som kommer att detekteras av den kloridselektiva elektroden; sålunda efter Val reflekterar hastigheten för Cl-utflöde Cl-permeabilitet. Omvänt kommer tillsatsen av den Cl-selektiva jonoforen, Chloride Ionophore 1(CI1), att inducera en inre positiv membranpotential som kommer att driva KCl-utflödet om en K-permeabilitet är närvarande. Följaktligen, efter tillsatsen av Cl1, reflekterar hastigheten för Cl-utflödet K-permeabilitet. Denna analys kan således fungera som antingen en Cl- eller K-permeabilitetsanalys, beroende på vilken jonofor som används. Den initiala hastigheten för jonflöde efter tillsatsen av jonofor tas som den specifika permeabiliteten för vesiklarna. Observera att Cl-utflöde före tillsatsen av jonofor indikerar viss permeabilitet för både Kand Cl. Även i detta fall representerar hastigheten för Cl-utflöde efter tillsats av ett överskott av motjonoforen permeabiliteten för jonen av intresse - Cl efter tillsats av Val och K efter tillsats av Cl1.

Cistanche kan behandlanjursjukdom

Kloridpermeasaktivitet

Våra tidigare studier visade att anjonpermeabiliteten är störst när både membranassocieringssteget och utflödessteget utförs vid pH 5.0, och dessa betingelser användes för att jämföra Cl-permeabilitetsaktiviteten för de tre isoformerna, med hjälp av Val för att initiera Cl permeabilitetsberoende utflöde. Exempel på rådata visas i figur 2A, som visar utsignalen från den Cl-selektiva elektroden i millivolt plottad mot tiden. Registreringen börjar före tillsatsen av spinkolonneluatet som innehåller vesikler och protein, varvid mV-värdet återspeglar 10 μM Cl-koncentrationen. Det Cl-fria spinkolonneluatet tillsätts vid den första pilen, vilket späder ut Cl, vilket återspeglas i den uppåtriktade avböjningen av mV-spårningen. Val läggs till vid den andra pilen, vilket utlöser Cl-utflöde om Cl-permeabilitet är närvarande, vilket återspeglas av det progressiva fallet inmV. Triton X-100 läggs till vid den tredje pilen och frigör all återstående intravesikulär klorid. Efter omvandling från mV till kloridkoncentration med användning av en standardkurva genererad för elektroden under analysbetingelserna, bestäms den fraktionella initiala hastigheten för Cl-frisättning efter tillsats av Val och tas som kloridpermeabiliteten. Jämfört med kontrollen utan protein (blå spårning) indikerar den höga hastigheten för Cl-frisättning efter tillsats av Val att ApoL1 ger betydande Clpermeabilitet som verkar jämförbar bland de tre isoformerna (röda, gröna och gula spår). Den mycket låga utflödeshastigheten före Val indikerar att kaliumpermeabiliteten är mycket lägre än Cl-permeabiliteten. Ett intervall av koncentrationer av ApoL1-isoformerna analyserades med avseende på Cl-permeasaktivitet (Fig. 2B). Som tidigare rapporterats för G0 finner vi att Clpermeasaktivitet är linjärt relaterad till proteinmassan i analysen för alla tre isoformer. Permeasaktiviteten vid varje koncentration är inte annorlunda bland de tre isoformerna. Koncentrationskurvan utfördes två gånger med användning av två olika uppsättningar av proteinberedningar, vilket gav samma resultat.

Sex oberoende preparat av de tre proteinerna analyserades med avseende på Cl-permeasaktivitet vid pH 5. 0 som sammanfattas i figur 2C. I ingen av uppsättningarna av preparat hittade vi en signifikant skillnad i Cl-permeasaktivitet bland isoformerna (p > 0.05 för jämförelse av G0 med G1 eller G2 i varje uppsättning) . Den genomsnittliga utflödeshastigheten för alla sex preparaten (märkta med ALL i fig. 2C) var 1,21 ± 0,32 procent/s för referenssekvensen G0, 1,36 ± 0,41 procent/s för G1 och 1,18 ± 0.34 för G2(medelvärde ± SD, n=6 för vardera; p=0.47 och 0.94 för jämförelse av G0 med G1 och G2, respektive). För att bestämma huruvida de sjukdomsassocierade mutationerna ändrar pH-känsligheten för teanjonpermeasen, analyserades Cl-permeabiliteten tillförd av varje isoform genom en rad pH-värden, med användning av det indikerade pH-värdet för både associations- och utflödessteg i analysen (Fig. 2D). betydande skillnader mellan isoformerna. Detta experiment utfördes två gånger med två olika uppsättningar av proteinberedningar, vilket gav samma resultat. Således är Clpermeas-aktiviteten inte signifikant olik mellan de tvåsjukdomsassocierade varianterna och referenssekvensen.

Kaliumpermeasaktivitet

Våra tidigare studier indikerade att katjonpermeabiliteten är störst när membranassocieringssteget utförs vid pH 6.0 och utflödessteget utförs vid pH 7,5, och vi använde dessa förhållanden om inte annat anges. Exempel på rådata från en K-permeasanalys visas i figur 3. Liksom med Cl-permeabilitetsanalyserna tillsätts spinkolonneluatet vid den första pilen, jonoforen (i det här fallet Chloride Ionophore1, CI1) tillsätts vid den andra pilen, och tvättmedel tillsätts vid den tredje pilen. De initiala utflödeshastigheterna efter tillsatsen av jonofor, som representerar K-permeabiliteten, visas med de grå streckade linjerna. Det blå spåret är från kontrollen utan protein, vilket visar den endogena bakgrundspermeabiliteten för enbart vesiklarna. Det röda spåret visar aktiviteten hos G0(vildtyp)-varianten, vilket tydligt visar närvaron av Kpermeabilitet som är större än kontrollvesiklar tillförda av proteinet som tidigare rapporterats (9). De gula och gröna spåren visar aktiviteten hos G1- respektive G2-varianterna. De initiala lutningarna efter tillsatsen av jonofor är klart större för G1 och G2 än för G0, vilket indikerar att de sjukdomsassocierade varianterna stöder större K-permeasaktivitet än vad G0 gör.

I motsats till Cl-permeabilitetsanalysen, och som tidigare rapporterats för G0-isoformen (9), under K-permeas-analysförhållandena, finns det ett visst utflöde före jonofor i vesiklarna som innehåller någon av de tre isoformerna, representerade av den nedåtgående lutningen av inspelningarna efter tillsats av prov och före tillsats av jonofor. Medan den höga utflödeshastigheten efter tillsatsen av jonofor indikerar närvaron av betydande K-permeabilitet, indikerar utflöde före jonofor närvaron av viss Cl-permeabilitet också, vilket tillåter båda jonerna att läcka ut ur vesiklarna i frånvaro av jonofor. Detta läckage svarar sannolikt för både den trubbiga ökningen av elektrodutgången omedelbart efter tillsatsen av spinkolonneluatet och den efterföljande nedåtgående lutningen före CI1 som ses med alla inspelningar som innehåller ApoL1. Om man antar att detta läckage börjar när provet passerar genom centrifugeringskolonnen, skulle det också förklara skillnaderna i den slutliga Cl-koncentrationen efter tillsats av tvättmedel, eftersom varje förlust av KCl på centrifugeringskolonnen skulle innebära mindre total KCl tillsatt till analysen. Den kvantitativa tolkningen av jonoforhastigheten är inte enkel, annat än att den måste vara en funktion av permeabiliteterna för både Kand Cl. Som tidigare (9) tillskriver vi denna aktivitet den kvarvarande Cl-permeasaktiviteten som vi ser vid pH 7,5 som i figur 2D (se även Bruno et al. (9), figur 4D).

Kaliumpermeasanalyser utfördes över ett intervall av proteinkoncentrationer (Fig. 4A). Aktiviteten var linjärt relaterad till proteinmassan i analysen för varje isoform, men de två sjukdomsassocierade isoformerna visade väsentligt ökad effluxaktivitet jämfört med G0. Denna koncentrationskurva reproducerades med tre separata uppsättningar av proteinberedningar, vilket gav mycket liknande resultat.

Sex oberoende preparat av de tre isoformerna analyserades med avseende på K-utflödesaktivitet med användning av 2 ug protein i varje analys. I var och en av de sex uppsättningarna var aktiviteten för G1- och G2-isoformerna signifikant större än den för G0 (Fig. 4B). Genomsnittet av alla sex datauppsättningar gav utflödeshastigheter på 0.349 ± 0.063 procent /s för G{{10}}, {{15} }.709 ± 0,176 procent /s för G1 och 0.673 ± 0,142 procent /s för G2 (medelvärde ± SD, n=6 för varje; p < 0,00001="" för="" jämförelse="" av="" g0="" med="" antingen="" g1="" eller="" g2).="" de="" specifika="" aktiviteterna="" för="" k-permeasen="" för="" g1="" och="" g2="" är="" 2.03-="" respektive="" 1.93-faldigt="" större="" än="" g0="" med="" denna="">

Beroendet av K-permeasaktiviteten på pH i membranassocieringssteget och jonutflödessteget analyserades separat. Även om vi bekräftade att den totala utflödesaktiviteten för G1 och G2 är större än den för G0 under "standard"-förhållanden (bindning vid pH 6, utflöde vid pH 7,5), fann vi ingen signifikant skillnad i formen på kurvan aktivitet kontra externt (cis) pH för antingen membranassocieringssteget (fig. 4C) eller jonutflödessteget (fig. 4D). Vi hittade heller inga skillnader mellan isoformerna i aktivitetens beroende av högt intravesikulärt (trans) pH eller nödvändigheten av närvaron av tvåvärd katjon (Fig. 4E), och noterar vidare att antingen kalcium eller magnesium är lika effektiva för att tillhandahålla den nödvändiga tvåvärda katjonen för full aktivitet. Vart och ett av dessa experiment utfördes två gånger med användning av olika uppsättningar av renat protein, vilket gav identiska resultat.

Stabil membranförening

Vi har tidigare visat att renad rekombinant ApoL1 spontant binder till fosfolipidmembran som visar liknande beroende av pH och fosfolipidsammansättning som det för jonpermeasaktiviteterna (9). Med hjälp av liknande metoder jämförde vi lipidvesikelbindningsegenskaperna för referensversionen av ApoL1 med njursjukdomsassocierade varianter under förhållanden som stöder optimala Cl- eller K-permeasaktiviteter (Fig. 5). För Clpermease-betingelserna inkuberades proteinet med lipidvesikler vid pH 5.0 före kaotropisk extraktion för att avlägsna proteiner som inte var stabilt associerade med vesiklarna. Membranbundet protein isolerades genom flotation genom en sackakudde och bedömdes genom kvantitativ Western blotting. Resultaten visas i figur 5A. Det fanns ingen signifikant skillnad i mängden protein bundet till vesiklar mellan G{{10}} och antingen G1- eller G2-isoformer. Av de 500 ng-proteinet i varje reaktion var mängden bunden till vesiklar 223 ± 33 ng för G0, 239 ± 38 ng för G1 och 191 ± 28 ng för G2 (medelvärde ± SD ; n=8 för varje grupp, p=0.35 och 0.076 för jämförelse av G0 med G1 respektive G2). Ungefär 40–50 procent av proteinet i analysen är bundet till membran under dessa förhållanden. Detta experiment gjordes två gånger och gav mycket liknande resultat.

För att bedöma bindning under optimala förhållanden för Kpermease-aktiviteten, inkuberades proteinet med vesiklar vid pH6.0, skiftades sedan till pH 7,5 före kaotropisk extraktion för att avlägsna icke-stabilt insatt protein. Membranbundet protein isolerades genom flotation av membranvesiklarna genom asukroskudde och bedömdes genom kvantitativ Western blotting. Resultaten visas i figur 5B. De sjukdomsassocierade varianterna visar betydligt effektivare bindning jämfört med G0. Av de 500 ng protein som sattes till varje reaktion var mängden bunden till vesiklar 43,5 ± 14,5 ng (n=8) för G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) för G1 och 69,3 ± 10,3 ng (n=8) för G2(medelvärde ± SD; p=0.00076 och 0,0018 för jämförelse av G0 med G1 respektive G2). Ungefär 9 procent av G0-proteinet i reaktionen var stabilt associerat med vesiklerna jämfört med cirka 14 procent av G1 och G2 under dessa förhållanden. Detta experiment gjordes två gånger med användning av oberoende preparat som gav liknande resultat.

Diskussion

Vi presenterar här resultat från studier av jonpermeasaktiviteter hos ApoL1 och dessnjure-sjukdom-associerade varianter som gav flera signifikanta resultat. För det första finner vi att de sjukdomsassocierade varianterna av ApoL1 har avsevärt ökad Kpermease-aktivitet, vilket är ungefär dubbelt så högt som för G0-isoformen i våra analyser. För det andra, i motsats till Kpermeaset, finns det inga signifikanta skillnader i den specifika aktiviteten av Cl-permeasaktiviteten vid pH 5.0 bland isoformerna. För det tredje finns det inga skillnader i pH-känsligheten för vare sig K- eller Cl-permeasaktiviteterna, eller kravet på högt trans-pH och nödvändigheten av tvåvärd katjon för Kpermeasaktiviteten bland isoformerna. För det fjärde, under optimala förhållanden som stöder K-permeaset, visar de sjukdomsassocierade varianterna förbättrad stabil membranassociation jämfört med G0, men ingen skillnad i membranassociation under optimala förhållanden för Cl-permeasaktiviteten.

Våra fynd som visar ökat K-permeas utan effekt på Cl-permeas är mycket robusta. Genom att använda optimala förhållanden för varje permeasaktivitet fann vi i huvudsak identiska resultat bland sex oberoende uppsättningar av preparat, med Kpermease-aktiviteten för de sjukdomsassocierade varianterna betydligt större än G0 i varje. Varje uppsättning bereddes och analyserades samtidigt med användning av vanliga reagens. Giltigheten av proteinkoncentrationerna bestämda med BCA-analysen bekräftades av den jämförbara intensiteten av Coomassie-färgning på SDS-PAGE. Dessa data inkluderar alla framgångsrika försök samtidigt rening - vi har aldrig framgångsrikt genererat tillgång av alla tre varianter där dessa relativa aktiviteter inte observerades.

På samma sätt var frånvaron av skillnader i den anjon-permeasspecifika aktiviteten vid pH 5 konsekvent bland alla uppsättningar av preparat. Sålunda är vår primära slutsats att de sjukdomsassocierade varianterna av ApoL1 ger selektiv vinst av funktion i K-permeasaktiviteten utan att påverka Cl-permeasaktiviteten, som analyserats under optimala förhållanden för var och en av dessa aktiviteter. Förekomsten av betydande skillnader i katjonkanalaktiviteten hos ApoL1-varianter som korrelerar med förmågan att driva sjukdom har konsekvenser för möjliga patogena mekanismer. Den selektiva naturen hos den ökade jonpermeabiliteten indikerar att ökad katjonpermeasaktivitet hos de sjukdomsassocierade varianterna kan bidra till sjukdom, men att anjonpermeasaktiviteten vid lågt pH, som inte skiljer sig mellan isoformerna, sannolikt inte kommer att spela en kritisk roll.

Undersökningarna av effekterna av varianterna på aktiviteternas pH-känslighet och omfattningen av stabilmembranbindning av proteinet belyser mekanismen genom vilken K-permeasaktiviteten kan förstärkas. För det första, förutom att bekräfta den ökade aktiviteten av K-permeasen under optimala förhållanden, fann vi inga skillnader i formerna på kurvorna som visar pH-effekter på membranassociations- och utflödesstegen för K-permeasaktiviteten eller av effekten av pH på den totala Cl-permeasaktiviteten. Vidare fanns det inga skillnader i kravet på förhöjt pH i det inre av vesiklarna eller i kravet på närvaron av tvåvärd katjon i reaktionen för K-permeasaktiviteten bland alla isoformer. Således hittade vi inga bevis för en skillnad i själva kanalens inneboende egenskaper. Däremot visade varianterna signifikant ökad stabil association med fosfolipidvesiklar under förhållanden som stöder Kpermease-aktiviteten, med omfattningen av denna effekt är ungefär samma område som förändringsinaktiviteten. Sammantaget tyder data på att grunden för den ökade K-permeasaktiviteten helt enkelt är effektivare membraninsättning under de förhållanden som stöder aktiviteten, utan att behöva åberopa grundläggande förändringar i egenskaperna hos det insatta proteinet.

Tre domäner har identifierats i ApoL1-strukturen(6). Jonkanalaktiviteten tros ligga i den kolicinhomologa "porbildande" domänen, som upptar cirka 60 procent av proteinet vid dess N-terminal. De sjukdomsassocierade sekvensvariationerna finns inte i den porbildande domänen utan ligger på ett avstånd därifrån i en coiled-coil-domän, som omfattar cirka 16 procent av proteinet vid C-terminalen. Borttagning av denna domän har ingen effekt på trypanolytisk aktivitet men är mycket konserverad bland Apol-isoformer både inom och mellan arter (10). Det har föreslagits att denna region fungerar som en kontrollerad domän (10), och våra data indikerar att sjukdomsorsakande mutanter i denna domän verkligen har ökad membranbindning under förhållanden som stöder katjonkanalaktivitet och ökad katjonkanalaktivitet. En tolkning är att den C-terminala domänen tjänar till att undertrycka den membranassociation/insättning som är nödvändig för katjonpermeasaktivitet, och mutation av denna domän slappnar av denna undertryckning.

Cistanche kan behandlanjuresjukdom

Observationerna av membranbindning har ytterligare implikationer och belyser vissa aspekter av förhållandet mellan anjon- och katjonpermeasaktiviteter. Vi finner här att avsevärt mer protein är bundet till membran vid optimala anjonpermeasaktivitetsförhållanden (pH 5.0) än vid optimala bindningsförhållanden som stöder katjonpermeasaktivitet (pH 6.0), och detta gäller för alla isoformer (fig. 5). Notera skillnaden i pH-känsligheten för anjonpermeasaktiviteten (Fig. 2D) och membranbindningssteget för katjonpermeasaktiviteten (Fig. 4C): anjonpermeas ökar dramatiskt under pH 6, medan förmågan hos protein som sätts in i membranet för att stödja katjon genomsyra aktiviteten minskar avsevärt. Våra tidigare rapporterade data visade att stabil membranassociation av G0 stiger avsevärt när pH faller inom samma pH-intervall, och det är det område där inre proteinfluorescens är mest dramatiskt undertryckt(9), vilket indikerar en signifikant övergång i proteinets struktur . Sammantaget tyder data på att membraninsättning vid pH 6.0 är fundamentalt annorlunda än membraninsättning vid pH 5.0. Vid pH 6.0 associeras en mindre del av proteinet med membran, åtföljd av endast en mindre förändring i inneboende fluorescens och begränsad anjonpermeasaktivitet, men med förmågan att övergå till en katjonpermeabel form när cis-avdelningen titreras till pH7 .5. Vidare är effektiviteten av denna bindning större för de sjukdomsassocierade varianterna, parallellt med den ökade katjonpermeasaktiviteten efter pH-förskjutning. Däremot, vid pH 5. 0 är en mycket större del av proteinet associerad med membranen; denna bindning åtföljs av en stor förändring i inneboende fluorescens och uppkomsten av mycket större anjonpermeasaktivitet. Varken membranbindning eller anjonpermeasaktivitet är olika bland isoformer. Kapaciteten för detta insatta protein att övergå till katjonpermeasbekräftelsen är avsevärt minskad. Vi antar att den tidigare rapporterade förändringen i inneboende fluorescens när pH sjunker från 6 till 5 reflekterar en strukturell transformation till en form som inte kan övergå till katjonpermeaskonformationen, och skillnader mellan isoformerna har ingen effekt på jonpermeasegenskaperna hos denna konformation.

En ytterligare ny observation är att kalcium- och magnesiumjoner är lika effektiva för att stödja katjonkanalaktiviteten hos ApoL1. Detta tyder starkt på att rollen för tvåvärd katjon inte är genom någon högaffinitetsbindning av proteinet, utan mer sannolikt en mindre specifik laddningsöverbryggande effekt som tillåter negativt laddat protein att interagera med den negativt laddade ytan av fosfolipidmembran.

Andra undersökningar som utvärderar skillnader i jonkanalaktivitet hos ApoL1-isoformer har publicerats. Thompson och Finkelstein (8) använde elektrofysiologiska metoder med plana lipiddubbelskiktstekniker för att bedöma kanalaktiviteten hos renad rekombinant ApoL1, och rapporterade inga skillnader i kanalegenskaper mellan isoformerna. Det är viktigt att notera att plana lipiddubbelskiktsmetoder och vesikelbaserade effluxanalyser, medan båda är kanalanalyser, ger olika typer av information och kan ses som komplementära experimentella system. Lipiddubbelskiktsmetoder är ett oöverträffat tillvägagångssätt för att definiera enkanalsegenskaper hos renat protein men är mindre kraftfulla verktyg för att kvantifiera specifik aktivitet, medan vesikelutflödesanalyser kan ge kvantitativa data om aktiviteten hos en population, men lite information om enkanalsegenskaper. Således är observationerna av Thomp son och Finkelstein inte oförenliga med våra, som inte heller visar några uppenbara skillnader i kanalens inneboende egenskaper, utan bara en skillnad i specifik aktivitet på ungefär tvåfaldig, en skillnadsskala som skulle vara ganska svår att upptäcka i lipiddubbelskiktssystem.

Undersökningar med renat protein och lipider har fördelen att avslöja egenskaper som tydligt beror på själva proteinet och som inte förändras av några andra komponenter, uttryckskinetik eller membranhandel som äventyrar mer komplexa system. Men de är nödvändigtvis tysta om den slutliga effekten dessa aktiviteter har på levande celler. Studier som använder cellbaserade expressionssystem för att avskaffa jonkanalaktiviteter för ApoL1 har rapporterats (recensat i Friedman och Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al.(11) uttryckte ApoL1-isoformer i HEK-celler och bedömde intracellulär kaliumkoncentration vid steady-state. De hittade lägre intracellulärt kalium i celler som uttrycker G1 och G2 jämfört med celler som uttrycker G0. Även om denna observation kan vara förenlig med ökad plasmamembran K-permeabilitet, kan det lägre intracellulära K också vara en ospecifik konsekvens av den större cytotoxiska effekten av varianten genom vilken mekanism som helst, vilket leder till mindre aktiv NaK ATPas-aktivitet och/eller nedbrytning av plasmamembranintegriteten. O'Toole et al. (12) noggrant kalibrerade uttrycksnivåer i HEK-celler och bedömde utseendet på plasmamembrankatjonkanalaktivitet, och hittade nodifferenser mellan isoformerna. Shah et al. (13) rapporterade inriktning av ApoL1 till mitokondrier där de sjukdomsassocierade varianterna inducerade öppning av den mitokondriella permeabilitetsövergångsporen, i överensstämmelse med nya bevis för trypanosomcytotoxicitet. Huruvida denna effekt kräver jonkanalaktivitet hos ApoL1 är oklart. Med var och en av dessa studier, på grund av komplexiteten hos cellbaserade expressionssystem, kan det inte vara säkert om några skillnader som noteras beror på proteinets inneboende egenskaper eller på andra interagerande komponenter som finns i celler.

Patogena gain-of-function mutationer visar typiskt dominant arvsmönster, medanfenotyp av njursjukdomassocierad med ApoL1-varianter är recessiv. En mekanism genom vilken en mutation av funktionsförstärkning kan bero på är om proteinet fungerar som en homomultimer, och WT kan utöva en dominant-negativ effekt på den aktiverade varianten. Huruvida ApoL1 fungerar som en kanal som en monomerer en multimer är för närvarande okänt.

Våra data tyder på att ökad katjonpermeabilitet vid liknande nivåer av proteinuttryck kan bidra till tocytotoxicitet i podocyter eller andra celler. Det kan dock verka osannolikt att bara en dubbel ökning av aktiviteten skulle kunna omvandla en till synes godartad molekyl till en körsjukdom. Icke desto mindre tenderar sjukdomarna förknippade med ApoL1-varianter att långsamt progrediera, och subtila skillnader över en längre tidsperiod (månader till år) kan tänkas ha en stor kumulativ effekt. Andra potentiella mekanismer för ApoL1action ansvarar förnjureskadahar föreslagits och stöds av bevis (3–5, 11–16), inklusive effekter på apoptos, autofagi, mitokondriell funktion, intracellulär membranhandel och medierande effekter av extracellulära signalmolekyler, bland annat. Den relativa betydelsen av skillnader i ApoL1-kanalaktivitet som beskrivs här kontra andra potentiella verkningsmekanismer vid körning av sjukdom återstår att fastställa.

Cistanche kan behandlanjuresjukdom

Experimentella procedurer

Uttryckskonstruktioner

pET-ApoWT som kodar för N-terminal 6His och T7-epitopmärkt ApoL1 (G0-version) har tidigare beskrivits (9). Det kodade proteinet är identiskt med det för Genbank accession#BC143038 (haplotyp 150K, 228I, 255K) från aminosyra 28 till 398, vilket eliminerar signalsekvensen i aminosyrorna 1–27 och med tillägg av N-terminal {{ 17}}His och T7-epitoptaggar kodade av pET28a-plasmiden. Plasmider som kodar för G1- och G2-varianterna genererades från pET-ApoWT genom substitution av AleI- till Xhol-restriktionsfragmentet med fragment innehållande variantsekvenserna, syntetiserade av Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, och identiteten för de resulterande plasmiderna bekräftad genom direkt sekvensering. Alla tre konstruktioner var identiska förutom S342G- och I384M-aminosyrasubstitutionerna i G1-isoformen och N388-Y389-deletionen i G2-isoformen. Rekombinanta ApoL1-isoformer uttrycktes i bakterier och renades enligt beskrivning(8) förutom att S200-kolonnbufferten innehöll 0,03 procent n dodecyl- -D-maltosid (DDM) (Millipore-Sigma). För alla uppsättningar av experiment som jämförde isoformer, preparerades materialen samtidigt under identiska förhållanden med användning av samma reagens. Proteinkoncentrationen bestämdes med BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) med användning av bovineserumalbuminstandard. För totalt protein som i figur 1 färgades geler med Instant Blue (Expedeon Inc). Protein i S200-buffert snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid –80 C. Alikvoter tinades på is och späddes i S200-buffert före analyser.

jonoforer

Valinomycin (Millipore Sigma) löstes vid 5 0 mM inabsolut etanol och späddes till 1 mM i absolut etanol omedelbart före användning. Kloridjonofor 1 (MilliporeSigma) löstes vid 100 mM i 1-hexanol och späddes till 0,2 mM i absolut etanol omedelbart före användning.

Membran vesiklar

Asolektin (sojabönfosfatidylkolin typ II, Sigma) extraherades med aceton enligt beskrivning (30), torkades och löstes sedan i kloroform och lagrades vid –20 C. En alikvot av fosfolipider i kloroform torkades under en ström av kväve och suspenderades vid 20 mg/ml i 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8,0 genom fem frys-upptiningscykler och kraftig vortexning. Denna suspension lagrades vid –20 grader. För att generera KCl-laddade unilamellära vesiklar med cirka 200 nm diameter passerades lipidsuspensionen 15 gånger genom ett 200 nm porepolykarbonatmembranfilter med användning av en extruderkammare (Avanti Polar Lipids) och protokollet tillhandahållet av tillverkaren (17, 18). Extruderade vesiklar hölls på is och användes inom 24 timmar.

Aktivitetsanalyser

Jonpermeasaktivitetsanalyser med användning av membranpotentialdrivet KCl-utflöde detekterat med en kloridselektiv elektrod utfördes som tidigare beskrivits (9). Tjugo mikroliter ApoL1 i S200-buffert (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8,3, 0,3 procent DDM) tillsätts till 380 ul reaktionsblandning bestående av 82 mM KCl, 127 mM sackaros, 42,1 mM buffert vid angivet pH (MES för pH 5–6,5, HEPES för pH 7,0–8,0), 2,63 mMCa(glukonat)2 och 1,84 mg/ml extruderas vesiklar. Blandningen inkuberas vid rumstemperatur under 4 minuter innan passage genom en 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) spinkolonn jämviktad i 330 mM sackaros. Eluatet tillsätts omedelbart till 2 ml 330 mM sackaros, 10-5 M KCl, 2,5 mM Ca(glukonat)2 och 10 mM buffert (MES för pH 5–6,5; HEPES för pH 7–8) enligt anvisningarna, med kontinuerlig övervakning med en kloridselektiv elektrod och registreras enligt beskrivningen. Efter 20 s initierades spänningsdrivet utflöde genom tillsats av en jonofor (2,5 ul av antingen 1 mM valinomycin eller 0,2 mMklorid jonofor 1 i etanol) och fick fortsätta i 30 s följt av tillsats av Triton X-100 till 0,1 procent för att frigöra kvarvarande intravesikulär klorid. Rådata i mV omvandlades till Cl-koncentration med användning av en standardkurva genererad för elektroden under analysens betingelser. Initial fraktionerad kloridfrisättning härleddes från 3 s under det maximala omedelbara svaret på tillsatsen av jonofor.

Alla aktivitetsjämförelser utfördes med användning av material från samtidiga beredningar av de tre isoformerna som hade spätts ut till 100 ug/ml protein i S200-buffert före analysen. Alla analyser som användes för direkt jämförelse mellan varianterna utfördes på samma dag med användning av samma nyberedda reagens.

Membranassociationsanalys

Membranassociationsanalyser utfördes separat under betingelser optimala för Cl-permeasaktiviteten och för K-permeasaktiviteten. För tillstånd som stöder Clpermease-aktivitet, 5 ul av 100 ug/ml protein i 1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl , 0,03 procent DDM sattes till 95 ul reaktionsblandning (3,4 mg/ml isolektinvesiklar (laddade med 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca(glukonat) 2, 100 mM KCl, 100 mM sackaros) och inkuberades vid rumstemperatur under 1 min. Protein-till-lipid-förhållandet i analysen är 1:680 massa/massa. Provet späddes utan pH-förskjutning genom tillsats av 200 ul 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sackaros och inkuberades i 20 sekunder. Hundra mikroliter 8 M urea tillsattes, blandades och inkuberades sedan vid rumstemperatur under 15 min. Sackaroskoncentrationen bringades till 40 procent genom tillsats av 1,6 ml 50 procent sackaros. Provet på 2 ml skiktades under 1 ml 30 procent sackaros i 8 mM MES pH 5,0, vilket i sin tur var under 1,7 ml sackarosfritt 8 mM MES pH 5,0. De branta gradienterna centrifugerades vid 200,000g i en Beckman Coulter TLA-110rotor under 90 minuter vid 4 C. Vesiklerna samlades upp från gränsytan mellan 0 och 30 procent sackaros. Lika delar av proverna späddes fyra gånger och centrifugerades vid 100,000g under 1 timme. Membranpelletarna torkades, separerades med SDS-PAGE, blottades till polyvinylidenfluoridmembran och undersöktes genom westernblotting med antikropp mot T7-epitopen (MilliporeSigmaproduktnr 69522-3) med kemiluminescensdetektion med användning av ett digitalt bildsystem. Serieutspädningar av renat protein inkluderades på gelén för att generera en isotyp och blötspecifik standardkurva för varje protein.

För tillstånd som stöder K-permeasaktivitet tillsattes 5 ul 100ug/ml protein i 10 mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03 procent DDM till 95 ul av reaktionsblandning (3,4 ug/ml isolektinvesiklar (laddade med 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6,0, 2,5 mM Ca(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sackaros) och inkuberades vid rumstemperatur i 1 min. Provet späddes med pH-förskjutning till 7,5 genom tillsats av 200 ul 60 mM HEPES pH 8,0, 2,5 mM Ca(glukonat) 2 100 mM KCl, 100 mM sackaros och inkuberades i 20 s. Etthundra mikroliter av 500 mM Na2CO3 tillsattes och inkuberades vid rumstemperatur under 15 minuter. Sackaroskoncentrationen bringades till 40 procent genom tillsats av 1,6 ml 50 procent sackaros. 2 ml provet skiktades under 1 ml 30 procent sackaros i 8 mM Tris pH 8,3, vilket i sin tur var under 1,7 ml sackarosfritt 8 mM Tris pH 8,3. Sackaroskuddar centrifugerades och ett prov uppsamlades och bearbetades enligt ovan.

Statistik

Betydelsen av skillnader mellan par av medelvärden inom datamängder bestämdes med användning av variansanalys (ANOVA)(19). Statistiska parametrar bestämdes med hjälp av en funktion inbäddad i Excel. P-värden beräknades med hjälp av socscistatistics.com. Alla datapunkter presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD), bestämt med STDEV.S-funktionen i Excel för varje enskild grupp av repliker.

DatatillgänglighetAll data som stöder detta dokument kommer att delas på begäran till Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche kan behandlanjuresjukdom

Erkännanden—Vi tackar avdelningen för nefrologi och avdelningen för internmedicin vid Saint Louis University för det stöd som är nödvändigt för att utföra detta arbete.

Författarbidrag—JCE tänkte ut och övervakade studien, säkrade finansiering, utförde utflödesanalyser, tolkade data och skrev uppsatsen; JB renade proteinerna, utförde membranassociationsanalyserna, tolkade data, förberedde figurerna och redigerade papperet.

Finansiering och ytterligare information— Arbetet finansierades av institutionella resurser vid Saint Louis University och av NationalInstitutes of Health-anslag R01 DK120651 till JCE. Innehållet i denna artikel är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Intressekonflikt—Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt med innehållet i denna artikel.

Förkortningar—De förkortningar som används är: ApoL1, apolipoproteinL1; C11, kloridjonofor 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltosid;PVDF, polyvinylidenfluorid; SD, standardavvikelse; Val, valinomycin.

Från: 'Njure-sjukdom-associerade varianter av Apolipoprotein L1 visar funktionsökning i katjonkanalaktivitet' avJonathan Bruno och John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (2021) 296 100238

Referenser

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Association of trypanolytic ApoL1 variants withnjuresjukdomhos afroamerikaner. Science 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) APOL1 riskvarianter, ras och progression av kroniskanjuresjukdom. N. Engl. J. Med. 369, 2183-2196
3. Friedman, DJ och Pollak, MR (2020) APOL1 ochnjuresjukdom: Från genetik till biologi. Annu. Rev. Physiol. 82, 323-342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF och Sedor, JR (2017) Identifiering av den intracellulära funktionen hos APOL1. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. och Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nephropathies: 2017 in review. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. och Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI främjar trypanosomlys genom att bilda porer i lysosomala membran. Science 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. och Hajduk, SL (2009) Membranpermeabilisering av trypanosom lytisk faktor, ett cytolytiskt humant högdensitetslipoprotein. J. Biol. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R. och Finkelstein, A. (2015) Human trypanolytisk faktor APOL1 bildar pH-styrda katjonselektiva kanaler i plana lipidbilager: Relevans för trypanosomlys. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., och Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1 ger pH-växlingsbar jonpermeabilitet till fosfolipidvesiklar. J. Biol. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B., och Pays, E. (2006) Funktionen av apolipoproteiner L. Cell Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ och Pollak, MR (2016) APOL1njuresjukdomriskvarianter orsakar cytotoxicitet genom att tömma cellulärt kalium och inducera
stressaktiverade proteinkinaser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA och Sedor, JR. (2018) ApoL1-överuttryck driver variantoberoende cytotoxicitet. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR och Friedman, DJ (2019) APOL1njureriskvarianter inducerar celldöd via mitokondriell translokation och öppning av den mitokondriella permeabilitetsövergångsporen. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 2355-2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Ett tredelat komplex av suPAR, APOL1 riskvarianter och alphavbeta3 integrin på podocyter förmedlar kroniskanjure sjukdom. Nat. Med. 23, 945-953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) APOL1 njurriskvarianter inducerar mitokondriell dysfunktion. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1093-1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. och Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, en ny Bcl-2 homologidomän {{4 }}endast lipidbindande protein, inducerar autofagisk celldöd. J. Biol. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. och Cullis, PR (1985) Produktion av stora unilamellära vesiklar genom en snabb extruderingsprocedur: Karakterisering av storleksfördelning, instängd volym och förmåga att upprätthålla en membranpotential. Biochim. Biophys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ och Papahadjopoulos, D. (1979) Framställning av liposomer med definierad storleksfördelning genom extrudering genom polykarbonatmembran. Biochim. Biophys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Storbritannien