Njursjukdom: Hur framkallar nickel autofagi i njurarna?

För mer information:Ali.ma@wecistanche.com

Del Ⅰ: Nickel inducerar autofagi via PI3K/AKT/mTOR- och AMPK-vägar i musnjure

Heng Yin, Zhicai Zuo & et al.

1. Introduktion

Nickel(Ni), ett naturligt element, är brett distribuerat i miljöområden inklusive jord, vatten och luft (Schrenk et al, 2020). Ni (Nickel)föreningar och metalliskt Ni (Nickel)har många industriella och kommersiella tillämpningar, såsom legeringsproduktion, galvanisering, nickel-kadmium-batterier och katalysatorer inom kemi- och livsmedelsindustrin (Genchi et al., 2020). Men den stora industriella användningen av Ni (Nickel)leder till omfattande miljöföroreningar, vilket ökar risken för människors exponering för Ni genom mat och dricksvatten (Das et al, 2018). Även om Ni (Nickel) är ett viktigt mikronäringsämne för människor och djur, överexponering för Ni är extremt farligt för människors hälsa (Das et al., 2018).

Med den ökande förekomsten av Ni (Nickel)kontaminering under de senaste åren har Ni-toxicitet, inklusive immuntoxicitet, levertoxicitet, nefrotoxicitet och pulmonell toxicitet, väckt ökad uppmärksamhet (Gathwan et al., 2013; Deng et al., 2016; Hasanein och Felegari, 2017; Guo et al., 2020a . 2020b). Denjure, som ett viktigt målorgan i Ni (Nickel)toxikologi, med en ansamling av Ni (Nickel)och Ni (Nickel)föreningar däri genom kronisk exponering kan inducera betydande njurskador (Elangovan et al, 2018). Befintlig forskning från vårt forskarlag har visat induktion av oxidativ stress, apoptos, inflammation och cellcykelstopp injureav broilers av NiCl2 (Nickelklorid 2) i livsmedel som överstiger 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a, 2016b). Flera studier har föreslagit att mekanismen för Ni renal toxikologi inkluderar oxidativ skada, DNA-strängbrott och apoptos (Lee et al, 2001; Chen et al., 2010).

Spelar en avgörande roll i cellulär homeostas,autofagihar visat sig ha ett samband med förekomsten och patogenesen av olika sjukdomar (Martin et al, 2019). Nyligen genomförda studier har visat att celldöd kan förmedlas genom utomkontroll eller överstimulering avautofagi(Denton och Kumar, 2019). Som en komplex och högordnad intracellulär process,autofagibörjar från att bilda dubbelmembranvesiklar kända som autofagosomer som uppslukar delar av cytosol och organeller (Martin et al, 2019). Därefter deltar autofagosomerna i proteolysen av uppslukade ämnen efter att de flyttat till lysosomer.

Autofagiär känslig för olika typer av cellulär stress, såsom tillväxt eller brist på näringsfaktorer, hypoxi, DNA-skador, reaktiva syrearter (ROS), proteinaggregation, intracellulära patogener eller skador på organeller (Dodson et al, 2013). Det är en extremt komplex process att regleraautofagi, som involverar många signalvägar, inklusive adenosinmonofosfataktiverat proteinkinas (AMPK), fosfatidylinositol 3-kinas-I(PI3K) och däggdjursmål för rapamycin (mTOR)-vägar (Cao et al2021). Och mTOR-vägen har en avgörande effekt iautofagiinitiering. mTOR-aktiviteten är en central kontrollpunkt förautofagi, vars hämmande effekt leder till defosforylering av ULK1-lindrandeautofagihämning (Parzvch och Klionsky, 2014). Dessutom är PI3K/Akt och AMPK de viktigaste uppströmsregulatorerna för mTOR (Gong et al, 2020; Xu et al, 2020). Tidigare undersökningar antydde att tungmetaller (som Cd, Hg, Cu och Pb) kan inducera förekomsten avautofagi(Su et al, 2017). Även om Huang et al.(2016) och Son et al. (2017) har funnit att Ni (Nickel)exponering effektivt kan framkallaautofagii bronkiala epitelceller är den exakta mekanismen fortfarande oklar,

Effekten av Ni (Nickel)påautofagihar sällan rapporterats, och endast ett fåtal studier finns tillgängliga om effekterna av Ni på njurarnaautofagiav möss in vivo. Därför syftar det nuvarande arbetet till att bekräfta om NiCl2 (Nickelklorid 2)behandling kan framkallaautofagioch att utvärdera den potentiella mekanismen för NiCl (Nickelklorid)-induceradautofagi, inklusive AMPK- och PI3K/AKT/mTOR-vägar.

Nickel påverkar njurarna och orsakar njursjukdomar

Klicka till Cistanche för njursjukdom

2. Material och metoder

2.1. Kemikalier och antikroppar

Nickelklorid(NiCl) tillhandahölls av Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (Chengdu, Kina). I immunoblotanalysen köptes alla antikroppar från Cell Signaling Technology (CST, USA), inklusive anti-kanin mikrotubuli-associerad protein1 lätt kedja 3B(LC3B)(kat nr. 43566T), anti-kanin p62(SQSTM1)(Cat nr.5114D), anti-kanin Beclin1 (kat nr. 3495T), anti-kaninautofagirelaterat protein12 (Atg12) (kat nr. 4180T), anti-kanin Atg5 (kat nr. 12994T), anti-kanin Atg16L1 (kat nr. 8089T), anti-kanin Atg7 (kat nr. 8558T), anti-kanin Atg3 ( Katt nr. 3415T), anti-kanin däggdjursmål för rapamycin (mTOR) (Katt nr. 2983T), anti-kanin p-mTOR (Katt nr. 5536T), anti-kanin unc-51 som kinas 1 (ULK1 )(Katt nr.8054D), anti-kanin p-UIK1(Katt nr.5869T), anti-kanin PI3K(Katt nr.4292S),anti-kanin p PI3K(Katt nr.4228T,anti-kanin Akt(Katt nr. .9272S), anti-kanin p-Akt (kat nr. 4060T), anti-kanin mTOR (kat nr. 2972S), anti-kanin p-mTOR (kat nr. 5536S), anti-kanin AMPK (kat nr. 5831S) ), anti-kanin p-AMPK (kat nr 2535S) och -aktin (kat nr 4970T).

2.2.Djur och behandlingar

Totalt 160 friska ICR-hanmöss på åtta veckor gamla tillhandahölls av Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, Kina). Alla djuren hölls under konstanta förhållanden (temperatur 25±2C; 12-h ljus-mörk cykel) i aseptiska miljöer och matades med standardpelletsdiet och vatten ad libitum. Mössen klassificerades i fyra grupper slumpmässigt, var och en innehållande fyrtio mikrofoner efter acklimatisering i sju dagar. Destillerat vatten gavs intragastriskt till kontrollen, medan Ni (Nickel)(NiCl2 (Nickelklorid 2).6H2O) med doser på 7,5, 15 och 30 mg/kg gavs intragastriskt för djur i experimentgrupper. Ni som antas här bestämdes enligt värdet av den dödliga mediandosen (LD50, 306,11 mg/kg) som uppnåtts i forskningen om den akuta orala toxiciteten hos möss av hankön. NiCl (Nickelklorid),.6HZO späddes med användning av destillerat vatten innan experiment genomfördes. De fyra grupperna administrerades med en sondmatningsdos på 1 ml per 100 g kroppsvikt en gång om dagen i 28 dagar. Efter behandling i 14 och 28 dagar, offrades alla djur humant för att samla in sinanjureprover för analys i avsnitten nedan. Alla försöksdjur och försök utfördes efter avtalet som erhöll godkännande från djuromsorgen och etikkommittén vid Sichuan Agricultural University (godkännandenr:2012-024, Chengdu, Kina).

2.3. Bestämning av njurindex och funktioner

Alla möss vägdes varje vecka och avlivades humant när behandlingen avslutades, och sedannjurarklipptes och vägdes. Denjureindex som användes var ett förhållande mellannjurevikt och kroppsvikt.

Forskare mätte ureakväve i blodet (BUN) och nivåer av serumkreatinin (CRE) enligt instruktionerna i de kommersiella kiten som producerats av Naniing Jiancheng Bioengineering Institute of China (Nanjing, Kina),

2.4. Bestämning av njurackumulering av Ni (Nickel)

Njureprover togs den 28:e dagen under experimentet. Därefter, 1 mL HCIO och 9 mL HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co.,Ltd., Kina) användes för att våtsmälta 0,5 g del av prover under 24 timmar i rör med hög temperaturbeständighet. Därefter placerades dessa rör på en varm platta för att förånga all vätska, följt av suspension av återstoden med användning av 10 ml 0,1 M/L HNO. Efteråt analyserade forskare prover i termer av Ni (Nickel)med hjälp av en flamatomabsorptionsspektrofotometer (AAS700, PerkinElmer, USA).

2.5. Histopatologisk och ultrastrukturobservation

Efter att ha samlats in och sedan fixerats i 4 procent paraformaldehyd,njureprover dehydrerades med alkohol, inbäddades i paraffin, skivades vid 5 um och bearbetades för att färgas med hematoxylin och eosin. En digitalkamera (Nikon DS-Ri1, Japan) användes för att observera skivorna och ta fotografier för histopatologiska förändringar. Tio mikroskopiska fält av varjenjuregranskades. Bilderna som visades i tidningen var representativa.

För ultrastrukturell utvärdering applicerades 2,5 procent glutaraldehyd för fixeringnjurevävnader (cirka 1 mm5) vid rumstemperatur. Detta följdes av efterfixering av dessa vävnader i 1 procent osmiumtetroxid, dehydrerade i aceton och inbäddade i epoxiharts. De förberedda ultratunna skivorna sattes på koppargaller och färgades sedan med uranylacetat och blyacetat. Ultrastrukturbilder togs med ett JEM-1400blixttransmissionselektronmikroskop (JEOL, Japan).

återställa och förbättra njurfunktionen: cistanche

2.6. Immunhistokemiskt

Efter att ha avvaxats med användning av xylen, rehydrerades paraffinskivorna med användning av en graderad uppsättning etanollösning. Detta följdes av tvättning med destillerat vatten och PBS, och 15 min blockering av endogena peroxidasaktiviteter (EPA) genom inkubation med användning av 3 procent H,O. i metanol för att släcka EPA. För att underlätta antigenåtervinningen behandlade vi skivorna genom mikrovågsuppvärmning i 15 minuter i 0.01 M natriumcitratbuffert med pH på 6,0. Efter att ha mättats med normala 10 procents getsera i 30 minuter, skivorna genomgick sedan inkubation med primära antikroppar över natten vid 4 grader. Den 1 procent biotinylerade get-anti-kanin/mus IgG-sekundära antikroppen (Boster, Wuhan, Kina) användes för att inkubera skivor tvättade med PBS vid 37 grader i 1 timme, och sedan vid 37 grader, streptavidin-biotinkomplexet (SABC;Boster) , Wuhan, Kina) användes i 30 min. Detta följdes av nedsänkning av skivor i diaminobensidinhydroklorid (DAB; Boster, Wuhan, Kina) för visualisering av immunreaktion. Slutligen, efter lätt motfärgning med användning av hematoxylin, dehydratiserades skivorna med etanol, rensades med xylen och monterades successivt.

Integrerad optisk densitet (IOD) användes för kvantifiering av proteinnivåer av LC3B och p62. Den analytiska metoden för IOD-värdet hänvisade till Fanget al.(2018). Ett Nikon DS-Ril digitalt mikroskopkamerasystem (Japan) användes för att ta bilder. Forskare valde sedan ut fem fält（0.064 mm²）i varje bildområde av varje skiva för analys med hjälp av programvaran Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, USA ).

2.7. Western blotting

Proteinextraktion frånnjureprover utfördes med användning av RIPA-lysbuffert och BCA-proteinanalysreagenset (P0010S, Beyotime Technology, Kina) användes för att mäta koncentrationen. SDS-PAGE utfördes sedan för proteinprover, som överfördes till nitrocellulosamembran efteråt. Blockerade med 5 procent skummjölk i 1 timme vid rumstemperatur inkuberades membranen med primär antikropp vid 4 grader över natten. Efter användning av pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp för att inkubera i 1 timme, användes en Chemidoc XRS för att detektera proteinband på membranen med hjälp av ECL-kitet (P0018A, Beyotime Technology, Kina).

2.8. Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qRT-PCR)

Njurartogs och maldes med flytande kväve i en mortel med hjälp av en mortelstöt och konserverades sedan vid låg temperatur (-80 grad), renalt totalt RNA extraherades med RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japan) enligt rekommendationer från tillverkaren. Detta följdes av syntes av komplementärt DNA (cDNA) med ett RR047A Prim-ScriptTM RT-reagenskit tillverkat av Takara i Japan enligt instruktionerna. Därefter utfördes qRT-PCR genom användning av ett LightCycler ⑩ 480 Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA) och ett SYBR Premix Ex TaqTMII-kit (DRR820A, Takara, Japan). De primrar som används för en PCR är listade i tabell 1. -aktin användes för normalisering av genuttryck, och det relativa uttrycket av mRNA beräknades genom 2-4ac-metoden (Livak och Schmittgen, 2001).

2.9. Statistisk analys

Data uttrycktes i form av medelvärde ± standardavvikelse och analyserades genom LSD eller Dunnetts T3-variansanalys. SPSS-programvara (version 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA) användes för alla statistiska analyser för Windows. P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tabell 1: Sekvensen av primrar som användes i studien,

3. Resultat

3.1.NiClz (Nickelklorid)försämrar njurfunktionen

Som visas i Fig. 1A minskade kroppsvikten i tre grupper behandlade med NiCl2 (Nickelklorid 2). Och en signifikant minskning hittades också i den relativa viktennjure(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Serum CRE och BUN användes som standard biomarkörer för njurfunktion. Resultaten av njurfunktionen visades i Fig. 1C och D, och koncentrationerna av CRE och BUN ökade signifikant (P<0.05)in the=""> (Nickelklorid 2)-behandlingsgrupper vid dag 14 och 28 släktingar till kontrollen.

Fig. 1E visade att de tre Ni (Nickel)behandlingsgrupper har signifikant högre koncentrationer av Ni i njurarna (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Nickelklorid)- inducerar histopatologiska variationer av njure

Fig. 2 visar att NiClz (Nickelklorid)behandling orsakade histopatologiska variationer avnjuremed doser och tid, som involverar svullen glomerulus tillsammans med förträngt kapselutrymme, den vakuolära och granulära degenerationen i det renala tubulära epitelet.

Fig. 2. NiCl2 (Nickelklorid 2)inducerar histopatologiska förändringar i njuren.

De histopatologiska lesionerna inkluderade svullen glomerulus tillsammans med förträngt kapselutrymme (*), vakuolär degeneration (svarta pilar) och granulär degeneration (vita pilar) i de renala tubulära epitelema. HE-färgning, skalstång=50 µm.

3.3.NiCl (Nickelklorid)inducerar autofagi och ökar autofagirelaterade gener och proteiner i njuren

LC3 och p62 är de avgörande biomarkörerna förautofagi(Gomez-San-chez et al..2016). Jämfört med kontrollen, de tre NiCl2 (Nickelklorid 2) behandlingsgrupper bevittnade en signifikant ökning av proteinnivån av LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autofagiär också bestämningen av TEM i denna studie. Som visas i Fig, 3F, visade TEM-observationerna att antalet autolysosomer ökade i njurvävnad efter NiCl2 (Nickelklorid 2)exponering.

Fig. 3. NiCl2 (Nickelklorid 2)ökar autofagi i njurarna hos möss.

(A) Western blot-resultaten av LC3 och p62. (B, C) Kvantifieringen av LC3-II/I och p62. (DE) mRNA-uttrycket av LC3 och p62. (F)

Den ultrastrukturella strukturen av epitelcellen av proximalt hoprullad tubuli (de högra figurerna visar den partiella förstoringen av de vänstra figurerna; de svarta pilarna indikerar autolysosomstrukturer).

Värden presenteras med medelvärdet ± standardavvikelse (n {{0}}). Kolumnerna markerade med olika bokstäver är signifikanta skillnader (P <>

Dessutom användes immunhistokemi för att mäta proteinnivåer av LC3B och p62 injurevävnad i föreliggande studie. Såsom visas i Fig. 4 färgades de positiva cellerna bruna och LC3B och p62 uttrycktes huvudsakligen i cytoplasman hos njurtubuli-epitelceller. I jämförelse med kontrollen uppvisade IOD-värdena för LC3B en signifikant ökning (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nickelklorid) på dag 14 och 28. Dessutom minskade IOD-värdena för p62 signifikant (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Fig. 4. Immunhistokemiresultat av LC3B och p62 i njurarna hos möss.

(A) Immunhistokemibilderna av LC3B. (skalstapel=50 µm) (B) Immunhistokemibilderna av p62 (skalstapel=50 µm)

(C) Den integrerade optiska densiteten (IOD) för LC3B. (D) Den integrerade optiska densiteten (IOD) för p62.

Värden presenteras med medelvärdet ± standardavvikelse (n {{0}}). Kolumnerna markerade med olika bokstäver är signifikanta skillnader (P <>

Gener och proteiner relaterade tillautofagioch involverad iautofagiflöde mättes för att ytterligare verifiera effekterna av NiCl (Nickelklorid) påautofagi. Dessa inkluderade Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 och Atg3(Li och Zhang.2019; Nishimura och Tooze,2020). Såsom visas i Fig. 5A-C, jämfört med kontrollen, behandlingsgrupperna av Ni (Nickel)visar signifikant högre nivåer av proteiner av Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 och Atg3(P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Fig. 5. NiCl2 (Nickelklorid 2)ökar autofagi-relaterade gener och proteiner i njuren hos möss.

(A) Western blot-resultaten av Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 och Atg3. (B&G) Kvantifieringen av Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 och Atg3 proteinuttryck.

(HM) mRNA-uttrycket av Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 och Atg3. Värden presenteras med medelvärdet ± standardavvikelsen (n=8). Kolumnerna markerade med olika bokstäver är signifikanta skillnader (P <>

3.4.NiCl2 (Nickelklorid 2)inducerar PI3K/Akt/mTOR- och AMPK-vägar i njurarna

mTOR är en viktig regulator avautofagi(Wang et al.,2017). Och de väletablerade uppströms regulatorvägarna för mTOR inkluderar PI3K/Akt och AMPK (Gong et al..2020:Xu et al..2020). Således mätte denna studie proteinet i AMPK- och PI3K/Akt-vägarna.

Som Fg.6A och B visar att proteinnivåerna av p-PI3K, p-AKT och p-mTOR visade sig ha en signifikant minskning (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nickelklorid 2)på dagarna 14 och 28 av experimentet i förhållande till kontrollen. Behandlingsgrupperna uppvisade proteinnivåer av p-AMPK och p-ULK1 signifikant högre (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Nickelklorid 2)-Behandlingsgrupper visade sig ha en signifikant minskning av mRNA-uttryck av PI3K, AKT och mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Dessa resultat visar detautofagiinducerad av NiCl2 (Nickelklorid 2)i musnjure involverade AMPK- och PI3K/Akt/mTOR-vägar.

Fig. 6. NiCl2 (Nickelklorid 2)inducerar PI3K/Akt/mTOR- och AMPK-signalvägar i njurarna hos möss.

(A) Western blot-resultaten av p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 och ULK1.

(BF) Kvantifieringen av p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR och p-ULK1/ULK1 proteinuttryck. (G, K)

mRNA-uttrycket av PI3K, AKT, AMPK, mTOR och ULK1. Värden presenteras med medelvärdet ± standardavvikelsen (n=8). Kolumnerna markerade med olika bokstäver är signifikanta skillnader (P <>

KLICKA HÄR FÖR ATT DELAⅡ