Krüppel-liknande faktor 6-medierad förlust av BCAA-katabolism bidrar till njurskador hos möss och människor

edmund.chen@wecistanche.com

Förändrad cellmetabolism injureproximala tubuli (PT) celler spelar en avgörande roll vid akutnjurskada (AKI). Transkriptionsfaktorn Krüppel-liknande faktor 6 (KLF6) induceras snabbt och robust tidigt i PT efter AKI. Vi fann att PT-specifik Klf6 knockdown (Klf6PTKD) är skyddande mot AKI ochnjurefibros hos möss. Kombinerad RNA- och kromatinimmunutfällningssekvenseringsanalys visade att uttryck av gener som kodar för kataboliska enzymer för grenad aminosyra (BCAA) bevarades i Klf6PTKD-möss, med KLF6 som ockuperade promotorregionen för dessa gener. Omvänt undertryckte inducerbart KLF6-överuttryck uttryck av BCAA-gener och förvärradenjurskadaoch fibros hos möss. In vitro hade skadade celler som överuttrycker KLF6 liknande minskningar i BCAA kataboliskt genuttryck och var mindre kapabla att använda BCAA. Vidare resulterade knockdown av BCKDHB, som kodar för en subenhet av det hastighetsbegränsande enzymet i BCAA-katabolism, i minskad ATP-produktion, medan behandling med BCAA-katabolismförstärkaren BT2 ökade metabolismen. Analys avnjurfunktion, KLF6 och BCAA genuttryck i mänskliga kroniskanjursjukdompatienter visade signifikanta omvända korrelationer mellan KLF6 och bådanjurfunktion och BCAA-uttryck. Därför kan inriktning på KLF6-medierad undertryckning av BCAA-katabolism fungera som ett viktigt terapeutiskt mål vid AKI ochnjurefibros.

CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSFULLT

Kronisknjursjukdom(CKD) orsakar betydande sjuklighet och dödlighet och har en prevalens i den amerikanska vuxna befolkningen på ~15 procent. CKD kan bero på upprepade anfall av akutnjurskada(AKI) som kan hänföras till miljömässiga eller giftiga förolämpningar eller vara sekundära till andra sjukdomar eller deras behandlingar. I majoriteten av fallen är den proximala tubuli (PT) ett primärt skadeställe i AKI, eftersom den höga metaboliska aktiviteten hos PT-celler gör dem mottagliga för ischemisk skada, och deras roll i utsöndringen av läkemedel och toxiner kräver flöde av potentiellt skadliga medel genom PT-cellerna (1). En sådan klass av medel är DNA-skadande kemoterapeutika, som ackumuleras i PT-celler, vilket orsakar förlust av AKI och nefron. Efter skada de-differentierar PT-celler och utsöndrar lösliga faktorer som Wnt och Hedgehog familjemedlemmar och cytokiner (1–4). Överlevande de-differentierade PT-celler kan återinträda i cellcykeln och föröka sig för att reparera den skadade PT, följt av omdifferentiering till fullt fungerande PT-celler (2). Men celler som istället genomgår cellcykelstopp vid G2/M-kontrollpunkten kanske inte återhämtar sig, vilket leder till atrofi och uppreglering av profibrotisk signalering (5), vilket utlöser fibros genom att stimulera differentiering av inhemska fibroblaster till myofibroblaster som utsöndrar extracellulära matrisproteiner, och rekrytering av immunceller såsom makrofager och T-celler (1).

Nyckelord:njure; akut njurskada; proximal tubuli; transkriptionsfaktor; grenkedjiga aminosyror

Förutom att inducera patogena signalvägar, visar skadade PT-celler också drastiskt förändrad cellulär metabolism. Oskadade PT-celler är starkt beroende av mitokondriell fettsyraoxidation, trikarboxylsyracykel (TCA) och oxidativ fosforylering för ATP-produktion. Men i samband med skada undertrycks fettsyraoxidation, med endast en blygsam kompensatorisk uppreglering av glykolys, så att totala ATP-nivåer reduceras i skadad PT (6). Dessutom orsakade hämning av fettsyraoxidation in vitro de-differentiering och apoptos av tubulära epitelceller och förvärrades in vivonjurskadaefter folsyrabehandling (6). Intressant nog kan uppreglering av antingen mitokondriell fettsyraoxidation eller peroxisomal fettsyraoxidation (FAO) skydda motnjurskada(6, 7), vilket tyder på att bevarande av cellulär metabolism kan vara ett terapeutiskt mål i AKI. Transkriptomiska studier i njurbiopsier med human CKD samt efter ischemi-reperfusionsskada (IRI) hos möss visar på dysreglerad fettsyrametabolism såväl som aminosyrametabolism (6, 8). Även om rollen av PT-fettsyraoxidation har beskrivits tidigare i AKI, återstår rollen av PT-aminosyrametabolism i AKI att utforskas. Dessutom har mekanismerna för PT-skada som beskrivits hittills till stor del utforskats med hjälp av musmodeller med knock-out och överuttryck av individuella signalmolekyler, men mekanismer genom vilka globala vägar, både fibrotiska/inflammatoriska och metaboliska, och växlingen mellan normal återhämtning och atrofi är reglerade i AKI inte är väl karakteriserade.

Transkriptionsfaktorer fungerar som huvudregulatorer av grundläggande biologiska processer, på grund av deras förmåga att reglera uttrycket av flera nedströmsmål och bilda återkopplingsslingor. I AKI är väl studerade transkriptionsfaktorer som FOS och JUN familjemedlemmar mycket uppreglerade. Nyligen genomförda studier av molekylära svar på IRI i mänskliga prover och PT translationell profilering efter unilateral ureterisk obstruktion (UUO) hos möss identifierade också zinkfingertranskriptionsfaktorn Krüppel-liknande faktor 6 (KLF6) som en liknande gen för tidig skadesvar (9, 10) ). KLFs består av en familj av zinkfingertranskriptionsfaktorer med mycket konserverade C-terminala DNA-bindande domäner och variabla N-terminaler som uttrycks brett, inklusive injure(11). KLF6 har roller i flera processer såsom cellproliferation och -differentiering, apoptos, DNA-skadesvar och mitokondriell funktion (12) och har identifierats spela roller i lever, hjärt- ochnjurefibros, med kontextberoende effekter (13, 14). Inomnjure, KLF6 uttrycks i glomerulära podocyter och är en viktig regulator av mitokondriell funktion vid fokal segmentell glomeruloskleros (FSGS) (15). Förutom dess uttryck i glomerulära podocyter, uttrycks KLF6 också variabelt i PT, men dess roll i PT-celler, antingen i normal funktion eller efter skada, är inte förstått. Överuttryck av KLF6 i HK-2-celler resulterade i en de-differentierad fenotyp med minskat E-cadherin och ökat uttryck av vimentin och ledde även till ökat uttryck av makrofaginflammatoriskt protein-3 (16). Dessutom ökade KLF6-uttryck som svar på högt glukos, och denna effekt blockerades av nedbrytning av TGFB1 eller behandling med TGF- 1-neutraliserande antikropp. Direkt behandling med TGF- 1 inducerade också KLF6-uttryck, vilket indikerar en möjlig positiv återkopplingsslinga i HK-2-celler (16). KLF6 har också visat sig induceras i cancerceller in vitro av subapoptotiska doser av det DNA-skadande kemoterapeutiska läkemedlet cisplatin (17). För att bestämma rollen för PT KLF6 som svar på DNA-skada använde vi det naturligt förekommande toxinet aristolochic acid I (AAI). AAI-associerad nefropati är kliniskt relevant (18), och AAI-toxicitet är mycket specifik för PT, vilket gör det möjligt att studera rollen av PT KLF6 specifikt som svar på PT-skada. Dessutom orsakar AAI tillförlitligt både AKI och en övergång till fibros hos möss, i motsats till de flesta cisplatinregimer (19). AAI kommer in i PT-celler via basolaterala organiska anjontransportörer (OAT) 1 till 3 och har både genotoxiska effekter, via bildning av aristolaktam (AL)-DNA-addukter, och cytotoxiska effekter, vilket orsakar mitokondriell skada, vilket genererar reaktiva syrearter, och specifikt hämmar normala PT-funktioner som receptormedierad endocytos (18–20). Här visar vi genom modulering av KLF6-uttryck specifikt i PT genom studier av funktionsförstärkning och funktionsförlust på möss att KLF6-medierad undertryckning av grenad aminosyrakatabolism (BCAA) bidrar till AKI och efterföljandenjurefibros.

Resultat

AAI-behandling ökar renalt PT Klf6-uttryck. Eftersom flera medlemmar av KLF-familjen uttrycks i epitelcellerna injure(21), genomförde vi initialt qRT-PCR för dessa epiteliala Klfs innjurecortex skördades 24 timmar efter en enda dos av PT-specifikt toxin, AAI, kontra vehikel (dimetylsulfoxid [DMSO]) i C57BL/6-möss. Klf4, Klf5 och Klf6 var signifikant uppreglerade, medan Klf15 var signifikant nedreglerade (Fig. 1A), och dessa förändringar i genuttryck inträffade före en signifikant ökning av serumkreatinin (Fig. 1B). För att avgöra om Klf6 uppreglering är övergående eller förlängd, administrerade vi AAI i flera injektioner 3 dapart för antingen två injektioner eller 3 veckor (aktiv fas) eller i 3 veckor följt av 3 veckor utan AAI (ombyggnadsfas) (Fig. 1C) . PT förblev intakt 24 timmar efter en injektion, men efter två injektioner genomgick PT-celler celldöd och möss behandlade med flera AAI-doser visade förlust av PT, inflammatoriska infiltrat, protein

gjutningar och fibros i slutet av ombyggnadsfasen (Fig. 1D). Klf6-uttryck förblev signifikant förhöjt i de aktiva och ombyggnadsfaserna av skada (Fig. 1E), vilket tyder på en roll för KLF6 under hela den akuta och fibrotiska fasen av skadan. KLF6 uttrycks i glomerulära, tubulära och inflammatoriska celler, och för att bestämma bidraget från PT-specifikt Klf6-uttryck till den observerade ökningen av njurkortikalt Klf6-uttryck, genomförde vi RNA-sekvensering (RNA-seq) i mikrodissekerade S2/S3 PT-segment 24 h efter en AAI-injektion, före förlust av PT-celler. Klf6 var starkt uppreglerad på en nivå som var jämförbar med de välkända transkriptionsfaktorerna Fos och Jun för tidiga svar, vilket indikerar att den tidiga induktionen av uttryck av Klf6-budbärar-RNA (mRNA) injuredrivs av dess uttryck i PT-celler (Fig. 1F). Dessa fynd överensstämmer med nyligen publicerade encelliga/nukleära RNA-sekvensdata som visar uppreglering av Klf6 i PT-celler hos skadade mus och människornjurar(22, 23). Slutligen bekräftade datautvinning av uttrycksmatriser från tidigare rapporterade IRI-tidskursstudier (8) den tidiga induktionen av KLF6-uttryck, inom 2 timmar efter AKI, på samma sätt som Fos och Jun (Fig. 1G). Dessa data tyder på att Klf6 är en tidig inducerbar skadesvarsgen efter behandling med det PT-specifika toxinet AAI och efter IRI och förblir förhöjt trots att AAI upphör.

PT-specifik förlust av KLF6 dämpar njurskada i den aktiva och ombyggnadsfasen efter AAI-behandling.För att bestämma bidraget från PT-specifik KLF6 till AAI-inducerad skada genererade vi möss med PT-specifik knockdown av Klf6 (Klf6PTKD) genom att korsa Klf6fl/fl-möss (24) med Pepck-Cre-möss (25). Klf6PTKD-möss var livskraftiga och fertila, med betydande nedbrytning av PT-specifikt KLF6-proteinuttryck men ingen förändring i Klf6-mRNA-uttryck i levern, jämfört med Klf6fl/fl-möss (SI bilaga, Fig. S1 A-C). Det fanns inga tydliga skillnader injurehistologi eller funktion mellan Klf6fl/fl och Klf6PTKD möss vid 24 veckors ålder (SI Appendix, Fig. S1 D och E), och expressionsnivåer av OATs 1 till 3 (Slc22a6, Slc22a7 och Slc22a8), väg för AAI PT inträde, var inte signifikant olika (SI Appendix, Fig. S1F).

Kontroll- (Klf6fl/fl) och Klf6PTKD-möss behandlades med vehikel (DMSO) eller 3 mg/kg AAI intraperitonealt var tredje dag i 3 veckor och avlivades 3 dagar efter den sista AAI-injektionen för att bedöma den aktiva fasen av skadan eller 3 veckor efter sista AAI-injektion för att bedöma ombyggnadsfasen av skadan (Fig. 1C). Klf6fl/fl- och Klf6PTKD-möss hade liknande mängder AL-DNA-addukter både efter en injektion och i slutet av de aktiva och ombyggnadsfaserna (SI Appendix, Fig. S1 G och H), vilket tyder på liknande PT-upptag av AAI och reparation av AL -DNA-addukter i Klf6fl/fl och Klf6PTKD möss. Under injektioner gick möss som fick AAI ner i vikt jämfört med de som fick DMSO, med en liknande minskning på ~18 procent från baslinjen hos både Klf6fl/fl och Klf6PTKD-möss vid den slutliga injektionen av AAI, följt av att återfå liknande mängder kroppsvikt ( SI Bilaga, Fig. S2A).Njurevikter i förhållande till startkroppsvikten (dag 0) var likartade mellan DMSO- och AAI-behandlade Klf6fl/fl och Klf6PTKD-möss i slutet av den aktiva fasen (SI-bilaga, Fig. S2B). I ombyggnadsfasen,njurarfrån AAI-behandlade Klf6fl/fl-möss vägde betydligt mindre än de från DMSO-behandlade möss, men i AAI-behandlade Klf6PTKD-möss,njurevikter bevarades (SI Bilaga, Fig. S2B).Njurfunktionbedömdes genom att mäta koncentrationer av serumkreatinin (Fig. 2A) och ureakväve (Fig. 2B). Både serumkreatinin och ureakvävekoncentrationer var signifikant förhöjda hos möss som fick AAI jämfört med DMSO; höjningarna var dock signifikant mindre i Klf6PTKD-möss jämfört med Klf6fl/fl-möss (Fig. 2 A och B). Histologisk analys med användning av hematoxylin och eosin och perjodsyra Schiff-färgning visade att både Klf6fl/fl- och Klf6PTKD-möss behandlade med AAI hade utgjutande tubuli med kvarvarande basalmembran, inflammatoriska infiltrat som övervägande var lokaliserade i

yttre cortex och multipla proteinavgjutningar i både cortex och märg (Fig. 2 C och D). Dessa egenskaper var dock mindre allvarliga hos Klf6PTKD-möss jämfört med Klf6fl/fl-möss, med bevarande av tubuli och mindre inflammatoriska infiltrat. Analys av PT-området utfördes med fluorescerande Lotus-lektinfärgning för att identifiera intakta PT-borstkanter i helt differentierade PT-celler och immunfluorescens för cytokeratin-20 (KRT-20) för att identifiera skadade PT:er (8). Jämfört med möss som behandlats med DMSO, hade både Klf6fl/fl och Klf6PTKD-möss behandlade med AAI signifikant förlust av mogen PT, vilket visas genom förlust av Lotus-lektinfärgning och induktion av KRT-20-uttryck, vilket indikerar PT-skada i både aktiva och ombyggnadsfaser (Fig. 2E och SI Bilaga, Fig. S2C). Klf6PTKD-möss behandlade med AAI hade signifikant bevarande av mogen PT jämfört med Klf6fl/fl-möss, åtföljda av liknande nivåer av KRT- 20-induktion i både den aktiva fasen och ombyggnadsfasen. Trikromfärgning av ombyggnadsfasnjurarvisade omfattande avsättning av fibrotiskt material i Klf6fl/fl möss, med signifikant mindre fibros i Klf6PTKD möss (Fig. 2F, blå färgning; SI bilaga, Tabell S1). Avsättning av den fibrotiska matriskomponenten kollagen I, detekterad med hjälp av immunfluorescens (Fig. 2G och SI Appendix, Fig. S2D), visade att kollagen I ökade signifikant i Klf6fl/fl-möss med AAI men inte i Klf6PTKD-möss med AAI jämfört med DMSO i den aktiva fasen. I ombyggnadsfasen ökade kollagen I signifikant i Klf6fl/fl- och Klf6PTKD-möss med AAI, med en signifikant lägre procentuell yta i Klf6PTKD-möss med AAI jämfört med Klf6fl/fl-möss med AAI. Interstitiell inflammatoriska celler bestående av CD68 plus makrofager och GR-1 plus myeloidmonocyter fanns i Klf6fl/fl

och Klf6PTKD-möss behandlade med AAI men var signifikant mindre förekommande i Klf6PTKD-möss i både den aktiva och ombyggnadsfasen (Fig. 2H). Således skyddar förlust av PT-specifik KLF6 mot AAI-inducerad PT-skada, fibros och inflammation, trots närvaron av liknande mängder AL-DNA-addukter jämfört med AAI-behandlade kontrollmöss. PT-specifik förlust av KLF6 minskar inflammatorisk signalering och bevarar cellulär metabolism efter AAI-behandling. Vi försökte förstå mekanismerna genom vilka förlust av PT KLF6 skyddar mot skada, och vi åtog oss därför RNA-seq avnjurecortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- eller<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

För att bestämma vägar potentiellt direkt och indirekt reglerade av KLF6, analyserade vi ytterligare de differentiellt uttryckta generna genom att klassificera dem baserat på närvaron och placeringen av KLF6-bindningsställen, med hjälp av KLF6-kromatinimmunoprecipitationssekvenseringsdata (ChIP-Seq) från projektet Encyclopedia of DNA Elements . Klass 2-gener definierades som att ha minst 1 KLF6-bindningsställe inom ±1 kb från transkriptionsstartstället (TSS), klass 1-gener som att ha minst 1 KLF6-bindningsställe mellan ±1 och 10 kb av TSS och klass 0 gener som inte har något KLF6-bindningsställe inom ±10 kb från TSS. Det fanns 538 gener som både var uppreglerade i Klf6fl/fl-möss och signifikant nedreglerade i Klf6PTKD jämfört med Klf6fl/fl-möss i den aktiva fasen. Bananrikningsanalys av dessa 538 gener visade att medfödda immun (t.ex. TYROBP, fagosom och makrofag)-relaterade och celladhesion (t.ex. integrin, fokal adhesion)-relaterade vägar var signifikant berikad (Fig. 3A). Klassificering av generna enligt KLF6-bindningsställen visade att majoriteten av DEGs (428/538) inte hade KLF6-bindningsställen (klass 0), och anrikningsanalys av klass 2-gener (72) och klass 0-gener separat visade att betydelsen av dessa vägar var starkt driven av klass 0-gener, vilket indikerar att det lägre uttrycket av dessa gener i Klf6PTKD-möss sannolikt var en indirekt effekt av mindre PT-skada som ett resultat av PT-specifik Klf6-knockdown (Fig. 3A).

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURFUKTIONEN

Det fanns 388 gener som både var nedreglerade i Klf6fl/fl-möss och signifikant bevarade (uppreglerade) i Klf6PTKD jämfört med Klf6fl/fl-möss. Bananrikningsanalys visade att dessa gener representerade metaboliska vägar, med aminosyrametabolism och fettsyrametabolism som framträdande (Fig. 3B och SI Bilaga, Fig. S4). Anrikningsanalys av klass 2-gener (1{{10}}3) och klass 0-gener (246) visade att trots att endast ~25 procent av generna hade KLF6-bindningsställen inom ±1 kb från TSS ( klass 2), var denna undergrupp av gener drivkraften för de mycket signifikanta P-värdena för dessa vägar. Påfallande nog var metabola vägar för specifika aminosyra (Val, Leu och Ile [BCAA] och Gly, Ser och Thr) lika signifikanta när endast klass 2-gener analyserades, vilket tyder på potentiell direkt reglering av dessa vägar av KLF6 (Fig. 3B) . Däremot drevs den höga betydelsen av fettsyrametaboliska vägar och PPAR-signalväg till stor del av klass 0-gener, vilket tyder på indirekt bevarande av dessa vägar som ett resultat av PT-specifik Klf6-knockdown. Genuppsättningsanrikningsanalys för specifika Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) metaboliska vägar (fettsyranedbrytning, aminosyrametabolism, TCA-cykel och glykolys) med användning av alla differentiellt reglerade gener bekräftade att dessa är signifikant uppreglerade (bevarade) i Klf6PTKD kontra Klf6fl/fl möss (Fig. 3C).

Induktion av KLF6 förvärrarNjurskadaoch undertrycker BCAA-kataboliska gener efter AAI-behandling. För att avgöra om överuttryck av KLF6 skulle ha motsatta effekter använde vi "tet-on"-systemet för att generera en musmodell med doxycyklin (DOX)-inducerbart uttryck av humant KLF6 (hKLF6OE; dubbel transgen CAG-rtTA,TRE-hKLF6 möss) (SI Appendix, Fig. S5A). hKLF6OE-möss hade robust induktion av hKLF6-uttryck efter kosttillskott med DOX i 7 dagar utan signifikanta skillnader i mus-Klf6-uttryck (SI-bilaga, Fig. S5B) ochnjurarvisade inte uppenbar histologisk skada eller förlust avnjurfunktionefter kontinuerlig behandling med DOX i 15 veckor (SI Bilaga, Fig. S5 C och D) jämfört med kontrollmöss (TRE-hKLF6 med DOX-behandling). Men för att framkalla om induktion av hKLF6 i PT förvärrade AKI ochnjurefibros, hKLF6OE och kontrollmöss behandlades med en lägre dos på 1 mg/kg AAI eller DMSO var 3:e dag under 2 veckor följt av dödshjälp efter ytterligare 3 dagar (aktiv fas) eller 2 ytterligare veckor (ombyggnadsfas) (SI Appendix, Fig. S6A). Kontroll- och hKLF6OE-möss som fick AAI tappade liknande mängder kroppsvikt (SI Appendix, Fig. S6B) ochnjurevikterna var likartade mellan alla grupper (SI Bilaga, Fig. S6C). hKLF6OE-möss hade signifikant förhöjt serumkreatinin och urea-kväve jämfört med kontrollmöss efter AAI-behandling i den aktiva fasen (Fig. 4 A och B). Detta åtföljdes av förlust av mogen PT med en högre andel KRT-20-positiv PT, vilket förvärrades i hKLF6OE-möss vid båda tidpunkterna (Fig. 4 C–E och SI-bilaga, Fig. S6D) och ökade fibros i båda faserna (Fig. 4F och SI Appendix, Fig. S6E). qRT-PCR-analys av gener som kodar för enzymer i BCAA-metaboliska vägen visade undertryckande av BCAA-gener efter AAI-behandling i kontroll- och hKLF6OE-möss, med ytterligare undertryckning i hKLF6OE-möss jämfört med kontrollmöss (Fig. 4G). Dessutom var uttryck av flera av BCAA-generna också antingen signifikant reducerade (Hibch) eller visade en trend mot lägre uttryck i hKLF6OE jämfört med kontrollmöss även utan AAI-behandling (DMSO-behandlade) (Fig. 4G). Dessa data tyder på att induktion av hKLF6 hos vuxna möss görnjuremer mottagliga för AKI och eventuell fibros med betydande dysreglering av gener som kodar för BCAA-katabolism.

Induktion av KLF6 undertrycker BCAA-katabolism, vilket är ett viktigt substrat för ATP-produktion in vitro.Mitokondriell BCAA-katabolism kan bidra till oxidativ fosforylering genom produktion av acetyl-CoA och succinyl-CoA (SI Bilaga, Fig. S4B). För att undersöka om KLF6 reglerar BCAA och cellulär metabolism in vitro, utvärderade vi först uttrycket av BCAA-metaboliska gener i HK-2-celler med överuttryck av KLF6 (KLF6-OE), med eller utan AAI-behandling. Liksom i hKLF6OE-mössen ledde överuttryck av KLF6 enbart i HK-2-celler till en trend mot suppression av flera gener som kodar för BCAA-enzymer, särskilt BCKDHB. Behandling av kontroll KLF6-Con-celler med 25 μM AAI under 6 timmar undertryckte signifikant uttrycket av flera enzymer, och dessa undertrycktes ytterligare i KLF6-OE-celler behandlade med AAI (Fig. 5A). Till

Fig. 3. Förlust av KLF6 undertrycker profibrotiska vägar och bevarar metabola vägar efter AAI-behandling. (A) Klassificering och anrikningsanalys av gener uppreglerade i Klf6fl/fl-möss efter AAI men signifikant mindre uppreglerade i Klf6PTKD-möss efter AAI enligt bindningsplatsklass: klass 2 med större än eller lika med 1 KLF6-bindningsställe inom ±1 kb TSS; klass 1 med större än eller lika med 1 KLF6-bindningsställe vid ±1 till 10 kb från TSS; och klass 0 utan KLF6-bindningsställe inom ± 10 kb från TSS. (B) Klassificering och anrikningsanalys av gener nedreglerade i Klf6fl/fl-möss efter AAI men signifikant mindre nedreglerade (dvs. konserverade) i Klf6PTKD-möss efter AAI enligt bindningsplatsklass: klass 2 med Större än eller lika med 1 KLF6-bindningsställe inom ±1 kb från TSS; klass 1 med större än eller lika med 1 KLF6-bindningsställe vid ±1 till 10 kb från TSS; och klass 0 utan KLF6-bindningsställe inom ±10 kb från TSS. (C) Genuppsättningsanrikningsanalysplottar med användning av alla differentiellt uttryckta gener, för KEGG-fettsyranedbrytning (FA DEGRAD), aminosyrametabolism (AA METAB) och TCA-cykel (KEGG_TCA).

avgöra om detta undertryckande i BCAA-genuttryck i närvaro av AAI ledde till förändringar i BCAA-katabolism, mätte vi intracellulära BCAA-koncentrationer. Efter behandling med AAI visade KLF6- Con-celler en minskning av BCAA, i överensstämmelse med ökad katabolism av BCAA, potentiellt som en kompensation för förlust av FA-oxidation (Fig. 5B). Denna effekt gick dock förlorad i KLF6-OE-celler, som inte hade en minskning av intracellulär BCAA efter AAI-behandling, vilket överensstämmer med minskad förmåga att katabolisera BCAA (Fig. 5B), och detta korrelerade med minskad mitokondriell ATP-produktion jämfört med AAI-behandlade KLF6-Con-celler (Fig. 5C).

Standardmediet som används för att mäta ATP-produktion innehåller höga koncentrationer av glukos (10 mM glukos, 1 mM glutamin och 2 mM pyruvat), och för att avgöra om KLF6-överuttryck ensamt skulle kunna förändra användningen av olika energikällor, genomförde vi istället analyser av syreförbrukningshastighet (OCR) i energibegränsade medier (serumfria medier med 1 mM glukos, inget glutamin och inget pyruvat). KLF6-OE-celler hade reducerad mitokondriell OCR (definierad som initial OCR minus icke-mitokondriell OCR bestämd efter administrering av rotenon/antimycin A) men hade liknande kompensation efter blockering av glykolys med 2-deoxiglukos (2- DG) och liknande FAO (minskning av OCR efter blockering av FAO med etomoxir) (Fig. 5 D och E). Eftersom mitokondriella svar på förlust av glykolys och OCR som är ett resultat av FA-oxidation inte förändrades i KLF6-OE-celler, tydde detta på att den totala mitokondriefunktionen inte påverkades, utan snarare en oförmåga att använda BCAA som källa kan redogöra för baslinjeminskningen i mitokondriell OCR under dessa energibegränsade tillstånd. För att avgöra om förlust av BCAA-katabolism skulle leda till minskad mitokondriell ATP-produktion, genererade vi HK-2-celler med knockdown av BCKDHB (SI Bilaga, Fig. S7). BCKDHA och BCKDHB kodar för två av underenheterna av det stora proteinkomplexet grenad ketoacid-dehydrogenas (BCKDH), som katalyserar det första irreversibla och hastighetsbegränsande steget i BCAA-katabolism och hämmas av fosforylering av BCKDH-kinas (BCKDK) (28). För att flytta BCKDHB-SCR-kontroll- och knockdown-BCKDHB-sh-cellerna mot mitokondriell ATP-produktion, förinkuberades de i 2-DG för att blockera glykolys i 1 timme innan analysen av ATP-produktionshastigheten genomfördes. Nedbrytning av BCKDHB resulterade i en signifikant minskning av ATP-produktionen, vilket visar att BCAA används för att generera ATP hos människornjureceller (Fig. 5F). Omvänt, till

Fig. 4. hKLF6OE-möss har förvärratsnjurskadamed suppression av BCAA-gener. (A och B) Koncentrationer av serumkreatinin (A) och ureakväve (B) i kontroll- och hKLF6OE-möss behandlade med DMSO eller AAI i den aktiva fasen. n=4 till 9 per grupp; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" mot="" samma="" genotyp="" med="" dmso;="" **p="">< 0.01="" kontra="" kontroll="" med="" aai;="" enkelriktad="" anova="" med="" sidak-korrigering="" för="" flera="" tester.="" (c="" och="" d)="" representativa="" histologiska="" bilder="" färgade="" med="" hematoxylin="" och="" eosin="" (c)="" och="" perjodsyra="" schiff="" (d)="" fläckar.="" gula="" pilar:="" utgjutande="" tubuli;="" svarta="" pilar:="" kvarvarande="" basalmembran;="" gula="" pilspetsar:="" proteinavgjutningar;="" och="" svarta="" pilspetsar:="" inflammatoriska="" infiltrat.="" (skalstaplar,="" 100="" μm.)="" (e)="" immunfluorescerande="" färgning="" för="" cytokeratin-20="" (krt-20)="" som="" en="" markör="" för="" skadad="" pt="" (röd)="" med="" färgning="" med="" lotus-lektin="" (ll)="" )="" som="" en="" markör="" för="" oskadad="" pt="" (grön).="" (skala="" staplar,="" 250="" μm.)="" (f)="" immunfluorescerande="" färgning="" för="" -sma="" (grön)="" med="" färgning="" för="" edu="" (magenta).="" (skalstaplar,="" 100="" μm.)="" (g)="" mrna-uttryck="" av="" bcaa-gener="" i="" kontroll="" och="" hklf6oe-möss="" behandlade="" med="" dmso="" eller="" aai="" i="" aktiv="" fas.="" n="5" till="" 9="" per="" grupp;="" $p="">< 0,01,="" $$p="">< 0,001="" mot="" kontroll="" med="" dmso;="" alla="" hklf6oe="" med="" aai="" är="" p="">< 0,001="" mot="" hklf6oe="" med="" dmso;="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" mot="" kontroll="" med="" samma="" behandling;="" flera="" t-tester="" med="" korrigering="" av="" falsk="" upptäcktsfrekvens="" med="" användning="" av="" tvåstegs-step-up-modellen="" av="" benjamini,="" kreiger="" och="" yekutieli.="" data="" är="" medelvärde="" ±="" sem="" med="" n="" som="" indikerar="" antalet="" biologiska="">

förbättra BCAA-katabolismen, behandlade vi HK-2-celler med BT2, som hämmar BCKDK, vilket blockerar den hämmande fosforyleringen av BCKDH. Under energibegränsade förhållanden ökade behandling med BT2 OCR i DMSO-behandlade celler, vilket bibehölls efter hämning av glykolys och inte på grund av förändring av FAO eller icke-mitokondriell OCR (Fig. 5 G och H). Dessa fynd tyder på att KLF6-medierad undertryckning av BCAA-katabolism minskar mitokondriell ATP-produktion, vilket sannolikt skulle förvärra PT-skada vid cellstress, där liknande energibegränsade förhållanden existerar på grund av att FAO äventyras.

BCAA-genuttryck reduceras hos olika mus och människorNjurskador. För att avgöra om förlust av BCAA-genuttryck inträffar före PT-förlust och ökade kreatininnivåer i AAI-inducerad skada, genomförde vi qRT-PCR i C57BL/6-möss behandlade med en enda dos av AAI och avlivade efter 24 timmar. Bckdhb, Hibch och Mccc2 var redan signifikant nedreglerade vid denna tidpunkt, med andra gener (t.ex. Acadm) som visar en stark trend mot nedreglering (Fig. 6A). Att studera BCAA-genuttryck i andra musnjurskadamodeller, genomförde vi qRT-PCR i möss behandlade med cisplatin (Fig. 6B) eller föremål för UUO (Fig. 6C). I båda modellerna var Klf6-uttryck mycket uppreglerat jämfört med vehikel/kontroller. Hos cisplatinbehandlade möss var flera av de testade BCAA-generna signifikant nedreglerade, med trender mot nedreglering av de andra generna (Fig. 6B). Hos möss som utsattes för UUO, var alla gener som testades signifikant nedreglerade både 3 och 7 dagar efter UUO (Fig. 6C), vilket tyder på att nedreglering av BCAA-gener sker tidigt efter skada.

Fig. 5. KLF6-överuttryck undertrycker BCAA-genuttryck, ATP-produktion och BCAA-användning in vitro. (A) Expression av KLF6- och BCAA-metaboliska gener i HK-2-celler som stabilt uttrycker kontroll- (Con) eller KLF6-överuttrycksplasmider (OE), behandlade med DMSO eller AAI. n=4 per grupp; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" mot="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0,001="" jämfört="" med="" samma="" cellinje="" med="" dmso;="" tvåvägs="" anova="" med="" tukeys="" korrigering="" för="" flera="" tester.="" (b)="" kvantifiering="" av="" totalt="" bcaa="" i="" con-="" och="" oe-celler="" behandlade="" med="" dmso="" eller="" aai.="" n="6" per="" grupp;="" $p="">< 0,05="" mot="" con="" dmso;="" enkelriktad="" anova="" med="" sidaks="" korrigering="" för="" flera="" tester.="" (c)="" procentuell="" förändring="" i="" graden="" av="" mitokondriell="" atp-produktion="" i="" con-="" och="" oe-celler="" behandlade="" med="" aai="" kontra="" dmso.="" n="27" till="" 30="" per="" grupp;="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" mot="" dmso,="" $p="">< 0,05="" mot="" con="" aai;="" enkelriktad="" anova="" med="" sidaks="" korrigering="" för="" flera="" tester.="" (d)="" ocr-mätningar="" för="" con-="" och="" oe-celler="" i="" begränsade="" media.="" där="" så="" anges,="" tillsattes="" 2-dg,="" etomoxir="" (eto)="" och="" en="" kombination="" av="" rotenon/antimycin="" a="" (rot).="" n="16" per="" grupp.="" (e)="" kvantifieringar="" av="" basal="" mitokondriell="" ocr="" (startande="" ocr="" minus="" post-rot="" ocr),="" icke-mitokondriell="" ocr="" (post-rot="" ocr)="" och="" förändringar="" i="" ocr="" efter="" tillägg="" av="" 2-dg="" (mitokondriell="" kompensation="" efter="" 2-dg)="" och="" etomoxir="" (fao).="" n="16" per="" grupp;="" **p="">< 0,01="" mot="" con;="" tvåvägs="" anova="" med="" tukeys="" korrigering="" för="" flera="" tester.="" (f)="" mitokondriell="" atp-produktionshastighet="" i="" bckdhb-scr-="" och="" bckdhb-sh-celler.="" n="14" per="" grupp;="" **p="">< 0,05,="" oparat="" t-test.="" (g)="" ocr-mätningar="" i="" hk-2-celler="" i="" begränsade="" media="" i="" frånvaro="" eller="" närvaro="" av="" bt2.="" där="" så="" anges="" lades="" 2-dg,="" eto="" och="" rot="" till.="" (h)="" kvantifieringar="" av="" basal="" mitokondriell="" ocr,="" icke-mitokondriell="" ocr="" och="" förändringar="" i="" ocr="" efter="" tillsats="" av="" 2-dg="" och="" etomoxir="" i="" hk-2-celler="" i="" frånvaro="" eller="" närvaro="" av="" bt2.="" n="8" per="" grupp;="" *p="">< 0,05="" mot="" inget="" bt2;="" tvåvägs="" anova="" med="" tukeys="" korrigering="" för="" flera="" tester.="" data="" är="" medelvärde="" ±="" sem="" med="" n="" som="" indikerar="" antalet="" biologiska="">

På liknande sätt utvinner data från en tidigare rapporterad uttrycksmatris från tubulointerstitialavdelningen hos 36 humana kroniska kroniska sjukdomar (hypertensiva och diabetiker)njursjukdomar) jämfört med kontrollpatienter (6) visade att flera BCAA-gener nedreglerades på ett liknande sätt som de AAI-behandlade mössen (Fig. 6D). För att ytterligare belysa sambandet mellannjurfunktion, KLF6-uttryck och uttryck av BCAA-gener i human CKD, använde vi en publicerad expressionsuppsättning från tubu lointerstitial-avdelningen hos en serie av 164 patienter med olikanjursjukdomar (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 mL/min/1,73 m2) (P < 0,001="" för="" alla="" gener),="" vilket="" visar="" att="" dessa="" förändringar="" i="" genuttryck="" kan="" inträffa="" tidigt="" i="" förhållande="" till="" funktionella="" förändringar.="" sammantaget="" tyder="" dessa="" data="" på="" att="" klf6-förmedlat="" undertryckande="" av="" gener="" som="" är="" kritiska="" för="" bcaa-katabolism="" kan="" spela="" en="" avgörande="" roll="" för="" att="">njurskadai murina modeller avnjurefibros såväl som vid human CKD.

Diskussion

I denna studie visar vi in ​​vivo-rollen för PT-specifika KLF6 i miljön avnjurskada.KLF6 är starkt och konsekvent uppreglerad tidigt i PT som svar pånjurskada, men detta är ett maladaptivt svar, vilket visas av den skyddande effekten av förlust av PT Klf6 efter behandling med det kliniskt relevanta och mycket PT-specifika toxinet AAI. Dessutom visar vi den potentiella betydelsen av oreglerad BCAA-metabolism i skadad PT som en möjlig bidragande orsak till AKI och efterföljande fibros. Förlusten av Klf6 ledde till bevarande av BCAA-kataboliskt enzymuttryck, med flera av generna som kodar för dessa enzymer med KLF6-bindningsställen i närheten av deras TSS, vilket tyder på att KLF6 kan vara en transkriptionell suppressor av BCAA-katabolism. Även om en annan medlem av KLF-familjen, KLF15, tidigare har visats reglera skelettmuskelns grenade aminotransferas 2 (Bcat2) uttryck (30), rapporterades inte regleringen av andra BCAA-enzymer. Vi postulerar att KLF6 verkar för att undertrycka uttrycket av flera gener som kodar för BCAA-enzymer.

I oskadad PT är Klf6-uttrycket lågt och uttrycks variabelt i vissa PT-celler och inte andra. Den snabba och robusta uppregleringen som sker efter flera typer av skador tyder på en fysiologiskt viktig roll för KLF6. I fibroblaster har KLF6 nyligen visat sig vara uppreglerad som svar på både onkogen och oxidativ stress, vilket leder till cellulär senescens, medan tystnad av KLF6 ledde till ackumulering av markörer för DNA-skada och genomisk instabilitet (31). Sålunda kan den fysiologiska rollen för KLF6 vid skada vara induktion av cellulär senescens, vilket möjliggör reparation av DNA-skada som kan vara ett resultat av toxiska eller oxidativa/ischemiska förolämpningar. I skadade PT-celler verkar emellertid en andra konsekvens av Klf6-uppreglering vara undertryckande av BCAA-katabolism, vilket i synnerhet i PT-celler sannolikt är skadligt. Intressant nog, trots den partiella nedbrytningen av PT-specifik Klf6 vid baslinjen i Klf6PTKD-möss, kunde detta fortfarande ge en tydlig skyddande effekt efter skada. Detta har viktiga terapeutiska implikationer, eftersom det antyder att endast en liten manipulation av KLF6-nivåer eller aktivitet (t.ex. genom användning av en liten molekylhämmare) kan visa terapeutisk effekt. Transkriptionsfaktorer är faktiskt mer sannolika än andra genfamiljer

i det mänskliga genomet för att ha doskänslighet (32). På liknande sätt är en begränsning av vår inducerbara KLF6-överuttrycksmurina modell att den inte är begränsade PT-celler, och som sådan kommer framtida studier att behöva fokusera på att använda en cellspecifik-inducerbar modell för att belysa den cellkontextberoende rollen för KLF6.

Vi har tidigare visat att förlust av Klf6 i glomerulära podocyter var skadlig i FSGS-miljön på grund av dess roll i transkriptionell aktivering av syntesen av cytokrom c-oxidas 2 (Sco2). Förlust av Klf6 i FSGS ledde till värre fibros, med ökad aktivering av den inneboende apoptotiska vägen (15). Förhör av tillgängliga encelliga RNA-seq-datauppsättningar visar det hos friska musnjurar,Klf6 uttrycks i en mycket större andel podocyter än PT-celler, och på en mycket högre nivå (ref. 33; https:// susztaklab.com/). KLF6 spelar därför sannolikt en viktigare fysiologisk roll i normala podocyter än PT-celler, medan andra kända mitokondriella masterregulatorer (t.ex. Ppara) uttrycks mycket högre i PT-celler än podocyter. Således har förlust av Klf6 i podocyter därför troligen en mer skadlig effekt än i PT-celler. De kontrasterande rollerna av KLF6 i olika celltyper inomnjureparalleller tidigare fynd av cellspecifika effekter i hjärta och lever. Således försvagade nedbrytning av Klf6 i hjärtmyocyter hos möss hjärtfibros efter en överbelastning av angiotensin II, vilket tyder på en roll för KLF6 vid förökning av fibros, men nedbrytning av Klf6 i hjärtmyofibroblaster hade ingen effekt på fibros (14). Omvänt, i levern, hade knockdown av Klf6 i mushepatocyter ingen effekt på leverfibros efter kronisk CCl4-administrering, men överuttryck av KLF6 i leverstjärnceller resulterade i minskad fibros, vilket tyder på att KLF6 är skyddande (13).

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÄRSMÄRTA

Förlust av FAO undernjurskadaär nu känt för att vara en viktig händelse i patologin avnjurskadaoch kan faktiskt direkt bidra till fibros. I avsaknad av FAO, som är den huvudsakliga energikällan för oskadad PT, kan andra potentiella energikällor få större betydelse. BCAA bidrar till TCA-cykeln genom produktion av acetyl-CoA och succinyl-CoA. En nyligen genomförd studie visade att inte bara 13C-märkt BCAA bidrar till TCA-cykelintermediärer injuremennjurehade den fjärde högsta inkorporeringen av 13C i TCA-cykelintermediärer i de testade organen, efter bukspottkörteln, muskler och vit fettvävnad (34), vilket tyder på att BCAA potentiellt är en viktig bidragsgivare till TCA-cykeln. Men betydelsen av BCAA-katabolism för att bidra till TCA-cykeln, antingen hos normala eller skadadenjurar, har inte undersökts tidigare. Till exempel är det inte känt om enbart förlust av PT BCAA-katabolism skulle orsaka förändringar i PT-homeostas och/eller reparation, och dessa studier kommer att kräva generering av nya musmodeller såsom PT-specifika Bckdhb knockdownmöss. I inställningen avnjureskada, när FAO är kraftigt undertryckt, ytterligare undertryckande av

gener som kodar för metaboliska BCAA-enzymer kan beröva tubulära celler en viktig alternativ potentiell energikälla. Det är viktigt att notera att BCAA-genuttrycket redan var nedreglerat 24 timmar efter en enda injektion, före eventuella förändringar i serumkreatinin eller PT-förlust, vilket indikerar att dessa nedregleringar var en specifik konsekvens av PT-skada och inte kopplade till minskat PT-energibehov som följd. från minskad GFR och därmed minskat krav på upptag av lösta ämnen. Dessa vägar bevarades i Klf6PTKD-möss som var skyddade från skada och undertrycktes ytterligare i hKLF6OE-möss som hade värre skada. Dessutom hade KLF6-OE-celler minskad mitokondriell ATP-produktion efter AAI-behandling jämfört med KLF6-Con-celler, och medan intracellulär BCAA reducerades i KLF6-Con-celler, i överensstämmelse med deras katabolism , denna minskning upptäcktes inte i KLF6-OE-celler. Dessutom resulterade nedbrytning av BCKDHB i HK-2-celler i minskad mitokondriell ATP-produktion. Således kan bevarade uttryck av BCAA-gener i Klf6PTKD-möss ge skydd mot skador genom att tillhandahålla vitala TCA-cykelintermediärer i inställningen av kraftigt reducerad FA-oxidation. Framtida studier med möss med genetiska manipulationer av BCAA-katabolism och/eller behandling med BT2 skulle göra det möjligt för oss att undersöka dynamiken mellan BCAA-katabolism och FAO injurskada.

Vi har visat att förlust av uttryck av BCAA-gener leder till minskad mitokondriell andning och ATP-produktion, och detta representerar en mekanism genom vilken förlust av BCAA-katabolism kan bidra tillnjurskada. En alternativ mekanism kan vara genom ackumulering av BCAA, vilket kan ha en toxisk effekt. Detta har faktiskt visats vid hjärt-IRI. Ackumulering av BCAA på grund av förlust av katabolism visades hämma mitokondriell pyruvatanvändning genom att posttranslationellt inaktivera pyruvatdehydrogenas, vilket på så sätt avlägsnar ytterligare en cellulär energikälla och förvärrar skadan (35). Detta vändes antingen genom att öka BCAA-katabolismen genom att behandla mössen med BT2 eller genom att öka glukosmetabolismen genom överuttryck av GLUT1. En nyligen genomförd studie visade också exacerbation av hjärt-IRI genom förlust av BCAA-katabolism hos diabetiska möss. Detta åtföljdes av ökad oxidativ stress och vändes återigen genom reaktivering av BCAA-katabolism (36). BCAA och i synnerhet leucin är kända för att aktivera däggdjursmål för rapamycin (mTOR) komplex 1 (mTORC1) signalering. I en musmodell av polycystisknjursjukdom,i vilka celler som omger cystor har aktivering av mTOR

signalering, tillskott med BCAA aktiverade ytterligare mTORC1-signalering, vilket ledde till ökad proliferation (37). Transkriptionell profilering av hepatocellulära karcinom avslöjade minskat BCAA-genuttryck, vilket ledde till ackumulering av BCAA i tumörvävnad. Detta var associerat med ökad mTORC1-signalering och proliferation, som reducerades genom att begränsa BCAA eller behandla med BT2, och förvärrades hos möss som fick en diet med hög BCAA (38). mTORC1-signalering krävs för PT-funktion, och studier som använder mTOR-hämmare injurskadahar visat motstridiga resultat, sannolikt beroende på olika doseringsregimer, tidpunkt för behandlingar och skademodeller (39–42). mTORC1-signalering leder till en mängd cellulära svar, inklusive celltillväxt och -proliferation, lipidsyntes, mitokondriell syntes och undertryckande av autofagi (43). Det är troligt att antingen under- eller överaktivering av mTORC1-signalering kan vara skadligt och att en balans krävs för korrekt cellulär funktion. Till exempel kan överaktivering av mTORC1-signalering vid PT-skada leda till skadligt undertryckande av autofagi, vilket krävs för att avlägsna skadade mitokondrier och har visat sig vara viktigt för återhämtning efter PTskada (39, 42, 44, 45). Således kan ansamling av leucin ha en skadlig roll injurskadagenom överaktivering av mTORC1-signalering och undertryckande av autofagi. Sammanfattningsvis har vi visat att den robusta uppregleringen av Klf6 som sker injurskadaär skadligt, där förlusten av PT-specifik Klf6 bevarade BCAA-genuttryck och försvagade AKI och eventuell fibros. Omvänt undertryckte induktion av KLF6 i möss BCAA-genuttryck och gjordenjuremottaglig förnjurskada.Dessutom har gener som kodar för flera BCAA-enzymer KLF6-bindningsställen, vilket tyder på att KLF6 kan vara en transkriptionell regulator av BCAA-katabolism. Nedreglering av BCAA-katabolism in vitro genom överuttryck av KLF6 och behandling med AAI, eller genom knockdown av BCKDHB, ledde tilltill minskad mitokondriell ATP-produktion. Tillsammans, thesdata tyder på att terapeutiskt inriktat på bevarandet avBCAA-katabolism kan ge en alternativ mitokondrieenergikälla i miljönnjurskadadär FAOär reducerad.