Lactobacillus Plantarum GKM3 främjar livslängd, minnesretention och minskar hjärnoxidationsstress hos SAMP8-möss del 1

Abstrakt: (1) Bakgrund: En åldersrelaterad kognitiv försämring påverkar vanligtvis äldres liv med symtom involverade i progressiva försämringar av minne och inlärning. Det har föreslagits att probiotika skulle kunna modulera åldersrelaterade neurologiska störningar via tarm-hjärnaxeln. (2) Metoder: För att undersöka anti-aging-effekten av probiotika Lactobacillus plantarum GKM3, genomfördes både överlevnadstester och kognitiva experiment i SAMP8-mössmodellen. Den sex månader gamla SAMP8 (n{{10}} i varje kön) matades med probiotisk GKM3 i en dos på 5,1 × 109 och 1,0 × 109 cfu/kg kroppsvikt/dag fram till sin naturliga död. Sedan undersöktes livslängden. Tre månader gamla SAMP8 (n=10 i varje kön) administrerades GKM3 i 14 veckor. Därefter registrerades beteendetesterna och oxidationsparametrarna. (3) Resultat: GKM3-grupper visade signifikant ökad latens i det passiva undvikandetestet och tid för framgångsrikt undvikande i det aktiva undvikandetestet. TBARS och 8-OHdG från möss hjärnor visade också en signifikant minskning i grupperna som behandlades med GKM3. Dessutom hittades lägre ackumulering av amyloidproteinet i SAMP8-mösshjärnor med tillskott av GKM3. (4) Slutsatser: Dessa resultat indikerade att L. plantarum GKM3 fördröjde åldrandeprocessen, lindrade åldersrelaterad kognitiv försämring och minskade oxidativ stress.

Klicka på Cistanche Tubulosa Supplement

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nyckelord: senescensaccelererad musbenägen 8 (SAMP8); probiotika; 8-hydroxi-20 -deoxiguanosin (8-OHdG); tiobarbitursyrareaktiva ämnen (TBARS); amyloid- (A); åldrande

1. Introduktion

Det har varit ett problem att befolkningslidande kognitiv funktionsnedsättning har blivit större efter ökningen av antalet äldre individer under det senaste decenniet [1]. Enligt rapporten från Världshälsoorganisationen (WHO) kommer antalet personer med kognitiv försämring, som var mer än 46,8 miljoner år 2015, att nå över 74,7 miljoner år 2030, vilket nästan har ökat med hälften inom femton år [2] . Åldrande, erkänt som ett starkt samband med kognitiv funktionsnedsättning, anses allmänt vara förknippat med oxidativ stress, som är involverad i ackumulering av fria radikaler och främjade många fysiologiska dysfunktioner, särskilt i hjärnan, ett syrekänsligt organ, vilket leder till degenerativ symtom som minnesförlust och försämrad inlärningsförmåga [3–5].

Eftersom åldrande är oundvikligt och dess relativa negativa symtom är komplicerade, utövar människor behandlingar för anti-aging, allt från dietterapier till mer än läkemedelsbehandlingar [6,7]. Till exempel visade ginseng (Panax quinquefolius) rotextrakt förbättrad kognitiv funktion och markerades som en favorit av koreaner [8]. Ginkgo biloba-extrakt, ett annat exempel, älskades av japanerna för dess funktioner i kognitiv förbättring och oxidationsreduktion [9]. Även om många rapporter har föreslagit att växtbaserad kost ger antioxidanteffekter och fördröjer åldrandeprocessen, finns det mer intressanta fokus på tarmmikrobiotan eller till och med på en grupp specifika bakterier i tarmen som kan metabolisera dessa näringsämnen och ge positiv multimodulering effekter på värden, inklusive livslängd [10–14]. Tarmbakterier kan producera kortkedjiga fettsyror (SCFA) som acetat, propionat eller butyrat från ens kost [15]. Barn som konsumerade växtbaserad enteral näring visade högre SCFA än de normala barnen i sina avföringsprover [16]. Dessa SCFA kan spela en viktig roll i det mänskliga gastrointestinala epitelet [17]. Acetat kan passera blod-hjärnbarriären, vilket inducerar hypotalamus-neuronal aktivering [18]. Dessutom har butyrat studerats angående effekten av att undertrycka koloninflammation i människans tarm [19]. Därför spelar det roll vilken typ av mikrobiota eller specifika bakterier som finns i människans tarm, särskilt när det gäller att påverka kroppens hälsa och livslängd [20,21].

Tarmmikrobiotan kan också påverka tarm-hjärnans axel och fördröja åldrandeprocessen, och därigenom förhindra utvecklingen av åldersrelaterade sjukdomar som minnesförlust, demens eller till och med Alzheimers sjukdom [22,23]. Signalsubstansen gamma-aminosmörsyra (GABA), till exempel, skulle kunna produceras av vissa bakteriestammar som har rapporterats med proliferation av epitelial stamceller i tarmen och förbättring av depressivt-liknande beteende hos möss [24,25]. Med nuvarande stödjande data har tillägg av probiotika som förebyggande metod varit en trend för dessa åldersrelaterade neurologiska störningar [26,27].

Lactobacillus är den vanligaste probiotikan som visade stor möjlighet att utveckla funktionell föda eftersom den har funnits i mänsklig mat under lång tid [28]. Men individuella bakteriearter har unika bioaktiviteter, från stam till stam, som kräver experimentell bekräftelse. I våra tidigare studier isolerade vi den probiotiska stammen Lactobacillus plantarum GKM3 från inlagda blad (Brassica juncea), även känd som livslängdsgrönsaken i det taiwanesiska Hakka-samhället, och genomförde funktionsstudier för att stärka mag-tarmkanalen och immuniteten in vivo [29–31] . Därför förväntade vi oss sannolikheten för att L. plantarum GKM3 skulle lindra åldrandeprocessen och åldersrelaterad kognitiv funktionsnedsättning.

2. Material och metoder

2.1. Ämnen

L. plantarum GKM3 isolerades från kinesisk senap (Brassica juncea) och konserverades på Bioresource Collection and Research Center, Taiwan (BCRC), med samlingsnummer 910787. Först odlades GKM3 med en MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) buljong vid 37 ◦C i 18 timmar i provröret. Med {{10}}.01 procent ympning, skalades GKM3-frökulturen upp i en 50 L fermentor under en pH 6.0-kontroll vid 37 ◦C i 18 timmar med ett designat medium (5 procent glukos, 2 procent jästextrakt, 0,05 procent MgSO4, 0,1 procent K2HPO4 och 0,1 procent Tween 80). Sedan skördades de fermenterade bakterierna genom centrifugering vid 3800 rpm under 10 minuter, tvättades med fosfatsaltlösningsbuffert två gånger och pelleten blandades med 10 procent mjölk för lyofilisering. Doserna av L. plantarum GKM3 frystorkat pulver i denna studie justerades till 5,1 × 109 cfu/kg kroppsvikt/dag som hög dos och 1,0 × 109 cfu/kg kroppsvikt/dag som låg dos för musmodellen genom sondmatning .

De senescensaccelererade benägna mössen P8 (SAMP8) introducerades i denna studie som en åldrande djurmodell. Alla SAMP8-möss applicerades och hölls vid 12 timmar mörk/ljus-cykel under 25 ± 2 ◦C, 65 ± 5 procent RH med mat och vatten ad libitum. Följande experimentella procedurer godkändes av Animal Management Committee vid Department of Food and Nutrition, Providence University (Taichung City, Taiwan), med IACUC-numret 20170629-A02.

2.2. Överlevnadstest

I överlevnadstestet grupperades sex månader gamla SAMP8-möss med 20 honor och 20 hanar enligt följande: kontroll, GKM3 högdosgrupp och GKM3 lågdosgrupp. Probiotika L. plantarum GKM3 tillfördes dagligen till behandlingsmössen tills de nådde sin naturliga död. De levande/döda SAMP8-mössen i varje grupp registrerades och den genomsnittliga livslängden beräknades.

2.3. Experimentdesign för åldersrelaterad kognitiv funktionsnedsättning

Tre månader gamla SAMP8-möss inhystes för experimentet med kognitiv funktionsnedsättning. Både han- och honmöss SAMP8 grupperades enligt följande (n=10 i varje kön): kontrollgrupp, GKM3 högdosgrupp och GKM3 lågdosgrupp. Mössen i behandlingsgrupperna administrerades oralt L. plantarum GKM3 under 14 veckor. Förflyttningsaktiviteten utfördes den 11:e veckan av experimentet. Testet för passivt undvikande och testet för aktivt undvikande genomfördes den 13:e respektive 14:e veckan, och sedan avlivades mössen för biokemisk analys och histologisk undersökning.

2.4. Förflyttning aktivitet

Varje mus placerades i mitten av en skyttelbur (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA) och deras rörelser spelades in av en aktivitetsmonitor videovägsanalysator i 10 min. Den genomsnittliga tiden för musrörelser analyserades var 5:e minut (s/5 min). Denna procession genomfördes under svagt ljus och tysta förhållanden.

2.5. Passivt undvikandetest

En skyttelbur (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) delades in i ett mörkt och ljust rum. Det fanns en giljotindörr (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA) mellan de två rummen. I träningsprovet för passivt undvikandetest placerades en mus i ljusrummet för en minuts anpassning och sedan öppnades giljotindörren. Musen skulle få 0,5 µA elektrisk stöt i 0,5 s när den kom in i det mörka rummet. Chocken inträffade kontinuerligt tre gånger var femte sekund. Musen byttes ut under samma operation 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar efter träningspasset för minnestestet, förutom att ingen chock gavs. De genomsnittliga tiderna för möss som vistades i ljusrummet mättes. En övre bryttid på 180 s sattes.

2.6. Aktivt undvikandetest

I träningstestet för det aktiva undvikandetestet skulle musen få en 10 s betingad stimulus (CS) baserat på ljus och ljud, och sedan 5 s av 0,3 mA elektrisk stöt (ovillkorlig stimulus, UCS) om musen stannade i samma rum, medan det inte fanns någon chockmottagning om musen flyttade till det andra rummet. Varje mus hade tränat för 5 CS- och UCS-cykler. Musen testades under samma operation (CS/UCS-system) med 15–20 minuters mellanprov fyra gånger om dagen och testades kontinuerligt i fyra dagar. Den genomsnittliga undvikandetiden mättes som effekten av inlärningsminnet.

2.7. Oxidativ stressanalys

För detektering av 8-hydroxi-20 -deoxiguanosin (8-OHdG) från hjärnans mitokondrie-DNA extraherades 30 mg hjärnvävnad med Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System (Viogene Biotek Corp., Taipei, Taiwan) och det mycket känsliga 8-OHdG Check ELISA Kit (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Japan) applicerades med en absorbans vid 450 nm. För analysen av tiobarbitursyrareaktiva substanser (TBARS) maldes 25 mg hjärnvävnad med 250 µL RIPA-buffert och centrifugerades vid 16,000× g i 10 minuter under 4 ◦C. Totalt uppsamlades 100 µL supernatant och tillsattes 100 µL SDS-lösning och 4 mL färgreagens, och kokades sedan i en timme före kylningsbehandlingen. Behandlade prover centrifugerades vid 16,000x g i 10 minuter och placerades i 30 minuter vid rumstemperatur. TBARS-innehållet (mM/g protein) från varje 150 µL prov mättes vid 535 nm absorbans med standardkurvan.

2.8. Mätningar av hjärnan Amyloid-protein

Amyloid-(A)-proteinet från hjärnvävnadssektionen färgades med metoden för immunhistokemi. Andelen A-ackumulering analyserades med bildsystem (Leica, Q500, Wetzlar, Tyskland) med ett mikroskop under ett 40×-fält. Beräkningen baserades på procentandelen av A-ackumuleringsarean i hela hjärnan: (-amyloidavlagringsarea/hel hjärnarea) × 100 procent.

2.9. Histologi

Hjärnorna skars ut och fixerades med 10 procent formalin. Hippocampusvävnaden bearbetades genom processen av uttorkning, rengöring, infiltration och inbäddning för sektionering. Sedan undersöktes vävnaden i hippocampusområdet med Hematoxylin och Eosin (H&E) färgning.

2.10. Statistisk

Den statistiska pallen SPSS 19.0 användes i denna studie. Alla data uttrycks som medelvärde ± SEM och utvärderas med enkelriktad ANOVA för jämförelse av medelvärden mellan de olika grupperna. En signifikant skillnad övervägdes när p-värdet var mindre än 0.05 av Duncans multipla intervalltester. I överlevnadstestet användes Kaplan-Meier-testet för analys och log-rank-testet genomfördes för att verifiera skillnaderna mellan grupperna.

3. Resultat

3.1. Effekt av L. plantarum GKM3 på SAMP8 Survival Test

I överlevnadsexperimentet observerades livslängden för SAMP8-möss fram till deras naturliga död och det tog 21 månader att slutföra alla individuella register. Medellivslängden för obehandlade SAMP8-möss av hankön var 11,90 ± {{10}},18 månader och för honor var den 11,20 ± 0}.21 månader. I de probiotiska GKM3-matningsgrupperna förlängdes den genomsnittliga livslängden för män till 12.05 ± 0,15 månader och 13,50 ± 0,14 månader i låga respektive höga doser av GKM3-behandlingar. Den dosberoende effekten av probiotika GKM3 på livslängdsförlängning hos kvinnor kunde också observeras med 12,15 ± 0,21 månader i lågdosgruppen och med 14,30 ± 0,17 månader i högdosbehandlingen (data visas inte).

För att sammanfatta förväntad livslängd uppskattades överlevnaden. Med en överlevnadsfrekvens på 50 procent var den låga dosen av GKM3 i den manliga gruppen 12,67 månader och den höga dosen av GKM3 den manliga gruppen var 13,33 månader, medan den manliga kontrollgruppen endast visade 12,50 månader (Figur 1A). I likhet med observationen hos SAMP8-möss av honkön, visades 12,00 månader och 15,50 månader med en överlevnadsgrad på 50 procent i grupper som fick probiotisk GKM3 i en dos på 1,0 × 109 CFU/kg kroppsvikt/dag och 5,1 × 109 CFU/kg kroppsvikt/dag, respektive; dock observerades 10,50 månader med 50 procents överlevnad i den kvinnliga kontrollgruppen (Figur 1B). SAMP8-mössen av honkön visade kortare förväntad livslängd än hanar som grund i detta experiment; intressant, effekten av L. plantarum GKM3 i termer av livslängd hade en större inverkan på honor. Det föreslås att L. plantarum GKM3 kan öka livslängden hos SAMP8-möss av båda könen, särskilt hos honar.

3.2. Kroppsvikt, födointag och vattenintag hos SAMP8-möss

I experimentet med åldersrelaterad kognitiv funktionsnedsättning fanns det inga signifikanta skillnader i energiförbrukning och viktförändring bland alla SAMP8-möss i de olika behandlingsgrupperna före avlivningen (tabell 1). Detta betyder att det probiotiska GKM3 inte påverkade dessa metaboliska parametrar i modellen med åldrande mus.

3.3. Effekt av L. plantarum GKM3 på minnesretention och inlärningsförbättring

Ett rörelseaktivitetstest visade att det inte fanns någon signifikant skillnad mellan alla SAMP8-möss under det första 5-minutsintervallet, oavsett kön (tabell 2). Även om det var en minskning i det andra 5-min-intervallet, jämfört med det första 5-min-intervallet, fanns det ingen signifikant förändring mellan de behandlade och obehandlade grupperna.

Passiva undvikandetester utfördes på manliga och kvinnliga grupper av SAMP8-möss (Figur 2). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan alla grupper under försökstestet (p > 0.05). Latensen för SAMP8-hanmöss som matades med probiotisk GKM3 ökade signifikant jämfört med kontrollgruppen den första dagen (p < 0.05) (Figur 2A). Tiden för SAMP8-honmöss som vistades i det ljusa rummet ökades också den första dagen i GKM3-behandlingen, med ett p-värde på mindre än 0,05 i lågdosgruppen och ett p-värde på mindre än 0,01 i den höga -dosgrupp jämfört med kontrollen. Det fanns dock inga signifikanta skillnader efter den andra dagen av testet för passivt undvikande. En längre latens utförd i GKM3-matningsgruppen, både hos han- och hon-SAMP8-möss, indikerade att probiotisk GKM3 kunde bidra till åldersrelaterad minnesbevarande och inlärningsförbättring.

I ett aktivt undvikande förfarande krävdes mössen att vidta alla åtgärder för att undvika den skadliga stimulansen. På försöksdagen för det aktiva undvikandetestet visade både han- och honmöss SAMP8 matade med GKM3 en tendens till högre framgång i undvikande (Figur 3) men nådde inte den statistiska skillnaden (p > 0.{{ 9}}5) jämfört med kontrollgruppen. Resultatet på dagarna ett och två av testet för aktiv undvikande visade emellertid att den framgångsrika tiden ökade signifikant i de manliga grupperna med GKM3-matad jämfört med de obehandlade SAMP8-mössen av hankön (Figur 3A) (p < 0,05). Ett liknande resultat observerades också i de kvinnliga grupperna (Figur 3B). Intressant nog fanns det inga statistiska skillnader (p=0.157) på den fjärde dagens resultat mellan kontroll- och probiotikagruppen. Det betyder att kontrollmössen behövde träning i fyra dagar för att komma ikapp med närvaron av de probiotikamatade mössen. Det föreslås att tillsats av probiotisk GKM3 till kosten kan hjälpa värdens kognition, vilket påverkar det lämpliga beteendet hos båda könen.

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】