Medierade anti-aging-effekter av Cistanche-extrakt

EG-kultur

Humana navelvenendotelceller erhölls från American Type Culture Collection (Manassas VA, USA). Celler odlades vid 37°C med 5 procent CO2-endoteltillväxtmedium -2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, USA) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS). ECs odlades i 48 timmar vid 37°C med 5 procent CO, i EGM-2 (kontroll) eller HG 30 mM medium, med eller utan tillsats av olika koncentrationer av Cistanche (1040 ug/ml).

Cellviabilitetsanalys

Celler odlades vid 37°C under 72 timmar i ett EGM-2-medium kompletterat med 2 procent FBS och olika koncentrationer av Cistanche, och behandlades med MTT-lösning i 4 timmar. Resulterande formazanavlagringar löstes med dimetylsulfoxid, där absorbansen mättes vid 570 nm med användning av en VersaMax ELISA-mikroplattläsare (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA).

Scratch-wound migrationsanalys

Celler skadades och sedan ersattes odlingsmediet med färskt medium innehållande olika koncentrationer av Cistanche. Celler bibehölls i 24 till 48 timmar. Vid full migrering avbildades celler med hjälp av ett mikroskop (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Japan). De migrerade cellerna räknades med ett optiskt mikroskop vid 200x förstoring och kvantifierades manuellt

SA-P-gal färgning

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 celler räknades med hjälp av tre oberoende fält.

Western blot-analys

Celler skördades och lyserades i proteinextraktionslösning (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Korea) innehållande proteas- och fosfatasinhibitorer (10 min vid 4°C). Totala proteinkoncentrationer i supernatanterna mättes med användning av Bradford-analyser. Efter uppvärmning vid 95 grader i 5 minuter separerades proteinprover (30 ug) genom 8-12 procent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Proteiner överfördes sedan till polyvinylidenfluoridmembran (MilliporeBedford, MA, USA) vid 100 V under 60 min. Membran inkuberades i 5 procent bovint serumalbumin (BSA) i Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) kompletterad med 0,05 procent TBS med Tween-20 (TBST) (30 min vid rumstemperatur), inkuberades sedan i 5 procent BSA i TBST kompletterat med primära antikroppar (1:200 till 1,000) (över natten vid 4°C). Därefter inokulerades membran med antingen HRP-konjugerade get-anti-kanin- eller anti-mus-antikroppar (1:5,000) i timmar, och proteinband detekterades med hjälp av ett förbättrat kemiluminescensdetektionskit (Intron Biotechnology, Inc. ) och en LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan). Semi-kvantitativ analys av densitometriresultaten utfördes med hjälp av Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD USA).

Mätning av NO-produktion NO-koncentrationer bestämdes genom att detektera koncentrationen av nitrit med användning av NO-analyssatser, enligt tillverkarens instruktioner. Optiska densiteter bestämdes vid 560 nm med användning av en mikroplattläsare, och koncentrationerna beräknades med hjälp av en kalibreringskurva

Statistisk analys

Resultaten uttrycks som medelvärde plus standardavvikelse (SD) Statistisk signifikans bestämdes genom envägsvariansanalys (ANOVA). Post hoc-jämförelser mellan grupper utfördes med Bonferronis multipla jämförelsetest. Alla beräkningar utfördes med SPSS i Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) och P-värden<0.05 were considered statistically significant.

RESULTAT OCH DISKUSSION

Cistanche cytotoxicitet

För att bestämma cytotoxiciteten hos Cistanche på ECs, inkuberades celler med olika koncentrationer av Cistanche (0 till 100 ug/ml) i 72 timmar. Cistanche visade signifikant cytotoxicitet (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml vid alla behandlingstillfällen (fig. 1). Därför Cistanche koncentrationer av<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Den mitogenaktiverade proteinkinasvägen (MAPK) reglerar nyckelprocesser involverade i vaskulär EC-utveckling, såsom cellproliferation, invasion, metastasering och överlevnad, och angiogenes (Pišlar et al., 2015). MAPK involverar ERK, c-Jun N-terminalt kinas och p38 (Kim och Choi, 2010). ERK och p38 är viktiga signalproteiner involverade i sårläkning, medan ERK spelar en viktig roll för att kontrollera cellmigration, proliferation, differentiering och överlevnad (Roskoski, 2012). I en nyligen genomförd studie föreslogs p38 MAPK-signalvägen vara involverad i sårläkning (Loughlin och Artlett, 2011; Kim et al., 2019; Wang et al., 2019). I den aktuella studien undersökte vi proteinuttrycket av ERK och p38 för att identifiera signalvägarna som är involverade i Cistanche-reglerad EG-migrering. Cistanchebehandling (40 g/mL) ökade EC-migrationen 1,5-faldigt i förhållande till kontrollen (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-vikt högre än kontrollen (s<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Figur 1.Effekterna avCistanche(Cistanche) på cellviabilitet. Celler behandlades med Cistanche (0 till 100g/ml) i 72 timmar. Cellviabilitetberäknades som procentandelen livsdugliga celler odlade ifrånvaro av Cistanche. Resultaten visar medelvärde±SD. *P<0.05.