MikroRNA i njurutveckling och sjukdomar Ⅱ

Njurutveckling

Dedäggdjursnjure(eller metanephros) är ett vital organ som spelar en avgörande roll iutsöndring av metaboliskt avfall,reglering av extracellulär vätskevolym, ochunderhåll av elektrolytochsyra-bas homeostas. Dessutom producerar njuren viktiga hormoner, som t.exerytropoietin, kalcitriol,renin, ochprostaglandiner(48). Njurens funktionella kapacitet korrelerar med antalet fungerande nefroner som bildas under njurutvecklingen före födseln, även kallad nefronbegåvning. Varje mänsklig njure innehåller i genomsnitt 1,000,000 nefroner, även om detta antal varierar avsevärt, med uppskattningar från 200,000 till 2,000,{{8 }} nefroner (49, 50). Medåldrande,förlust av funktionell nefronreservinträffar över tid (51, 52); därför är låg nefrontillgång vid födseln associerad med en ökad risk att utveckla hypertoni och kronisk njursjukdom (CKD) senare i livet (53–55). Dessutom är CAKUT, som leder till minskad nefrontillgång och nefronfunktion, den främsta orsaken till njursvikt hos barn, vilket resulterar i signifikant sjuklighet och dödlighet i samband med transplantation och dialys (56, 57). Således ger en bättre förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger bakom etableringen av nefronantal och normal nefronbildning insikter i nya vägar för att förutsäga, förebygga och behandla njursjukdom hos barn.

HUR LÅNGE TAR DET FÖR CISTANCHE ATT ARBETA FÖR NJURSJUKDOMSPATIENTER?

Metanefrisk njurutvecklingstartar runt embryonal dag 10.5 (E10.5) hos möss och runt femte graviditetsveckan hos människor (58). Som svar på induktiva signaler från det metanefriska mesenkymet, sträcker sig den ureteriska knoppen från den kaudala änden av Wolffian-kanalen och invaderar in i det intilliggande mesenkymet (Figur 2). Samtidigt inducerar morfogener som emanerar från ureterknoppen kondensation av det metanefriska mesenkymet för att bilda kapselmesenkymet (även kallat nefronföräldrar) runt spetsarna på ureterknoppen. När nefrogenesen fortskrider genomgår uretärknoppen successiva omgångar av förgrening, förlängning och differentiering för att generera samlingskanalerna i njuren. En subpopulation av nefronföräldrar genomgår mesenkymal-epitelial övergång för att bilda njurvesiklar, som efter polarisering och förlängning blir komma- och S-formade kroppsstrukturer. Slutligen smälter den distala delen av den S-formade kroppen ihop med samlingskanalen för att bilda en funktionell nefron (59–61). Den S-formade kroppen genomgår ytterligare differentiering för att bilda nefronets mogna celltyper, förutom samlingskanalen. Foxd1+ stromala progenitorceller ligger intill nefronprogenitorceller i den yttre kortikala eller nefrogena zonen av den utvecklande njuren (Figur 2) (62). Signaler från det kortikala stroma tros hämma nefronstamcellsexpansion och stimulera dess differentiering, eftersom ablation av njurstroma resulterar i försämrad differentiering av nefronstamfader (63). Foxd1+ progenitorceller ger upphov till alla stromaceller i den metanefriska njuren, inklusive njurkortikala och medullära interstitialceller, pericyter, perivaskulära fibroblaster, mesangiala celler och vaskulära glatta muskelceller (64, 65). Störningar i alla steg i denna process kan leda till CAKUT, den främsta orsaken till CKD hos barn (66, 67).

Det mogna nefronet består av en glomerulus som fungerar som filtreringsenhet och ett rörformigt bakre sorptionsfack som är uppdelat i en proximal snodd tubuli, en ögla av Henle, en distal spiral tubuli och en uppsamlingskanal (Figur 2). Filtreringsbarriären för glomerulus (som omfattar det fenestrerade endotelet, det glomerulära basalmembranet, fotprocesser och slitsmembran hos podocyter) tillåter filtrering av plasma och små lösta ämnen, samtidigt som proteiner som albumin och immunglobuliner bibehålls selektivt i blodet (68, 69). Samtidigt är det rörformiga reabsorptionsfacket ansvarigt för upprätthållandet av vattenhomeostas, reabsorption av lösta ämnen (inklusive natrium, kalium, kalcium, fosfor, magnesium, glukos och många andra) och utsöndring av syra och annat avfall.

MiRNA i den utvecklande njuren

I studier på villkorliga transgena möss har miRNA dykt upp som kritiska regulatorer av njurmorfogenes i flera cellinjer. De initiala studierna som utvärderade en funktionell roll för miRNA i njurutveckling använde villkorlig deletion av Dicer (70) i ​​olika njurlinjer. Men Dicer är också känt för att ha miRNA-oberoende roller (71), vilket har komplicerat tolkningen av dessa modeller. Betingad deletion av Dicer i tidiga metanephriska mesenkym- eller nefronföräldrar resulterar i förstärkt apoptos av nefronföräldrar, förhöjda nivåer av det proapoptotiska proteinet Bim och för tidigt upphörande av nefrogenes (72–75) (tabell 1). Intressant nog minskar förlusten av Bim-uttryck i Dicer-deficient nefron pro genitorer apoptos och delvis återställer nefronbildning. Två miRNA uttryckta i nefronföräldrar, miR-17 och miR-106, identifierades som suppressorer av BIM-uttryck (76). Tillsammans indikerar dessa fynd att miRNA kontrollerar balansen mellan överlevnad och apoptos hos nefronföräldrar för att säkerställa bildandet av ett korrekt antal nefroner under hela nefrogenesen.

Figur 2. Schematisk illustration av stadierna av metanefri njurutveckling. Signaler från ureterknoppen utlöser kondensation av det metanefriska mesenkymet för att bilda ett lock av nefronföräldrar (cap mesenchyme) runt ureterknopparna. Cap-mesenkymet genomgår en mesenkymal-epitelial övergång för att bilda njurvesiklar, som utvecklas sekventiellt till komma- och S-formade kroppar. Dessa strukturer ansluter till den ureteriska knoppskaftet, vilket ger upphov till uppsamlingskanalen. Celler i den proximala domänen av den S-formade kroppen differentierar sig till specialiserade epitelceller i den mogna njurkroppen (dvs. podocyter och Bowmans kapselceller), medan celler i de mittersta och distala delarna differentierar till de tubulära segmenten av nefron (proximala tubuli). slingor av Henle och distala tubuli). Skapad med BioRender.com.

Villkorlig deletion av Dicer i ureterknopplinjen resulterar i ett spektrum av abnormiteter som starkt liknar CAKUT, inklusive njurdysplasi och utveckling av uppsamlingscystor (73, 77, 78). För tidig avslutning av grenmorfogenes (som svar på minskat uttryck av Wnt11 och c-Ret från ureterknoppen) är sannolikt den huvudsakliga bidragande faktorn för njurdysplasi (73). Början av cystbildning sker vid omkring E15.5 och är associerad med defekter i primär cilialängd, ökad apoptotisk celldöd och överdriven cellproliferation (73). Eftersom Dicer har viktiga miRNA-oberoende roller i cellen, har villkorlig radering av Dgcr8 använts för att bekräfta att de fenotyper som observeras i villkorliga Dicer-knockout-modeller verkligen är resultatet av förlust av miRNA. Djur med Dgcr8-deletion i det distala nefronet och derivat av uppsamlingskanalen utvecklar hydronefros och uppsamlingscystor (79), en CAKUT-liknande fenotyp som liknar förlusten av Dicer-aktivitet i ureterknopplinjen.

Studier från två oberoende grupper visade att ablation av Dicer från Foxd1+ njurstromalinjen och dess derivat resulterar i ett spektrum av renala anomalier, med konsekventa fynd angående hypoplastiska njurar, minskat glomerulärt antal, onormal glomerulär mognad och defekt kärl mönstring (80, 81). Även om båda grupperna beskrev i stort sett överensstämmande fenotyper med liknande musmodeller, noterades två distinkta skillnader. Nakagawa et al. observerade brist på inre märg och papill, samt en minskning av den nefrogena zonen (80). Däremot har Phua et al. visade en expansion av nefronfamiljens population och konserverad njurpapill (81). Nakagawa et al. föreslagit att dessa defekter är relaterade till störningen av Wnt-vägsignalering, vilket resulterar i förändringar i stromacellsmigration och proliferation, på grund av nedreglering av stromacellernas miRNA, miR-214, miR-199a{{7 }}p och miR-199a-3p (80). Studien av Phua et al. föreslog att förändringar i apoptotiska program (inklusive förstärkt uttryck av Bim- och p53-effektorgener) bidrar till fenotypiska defekter (81). Det är tänkbart att genetiska bakgrundsskillnader och/eller effektiviteten av Cre-medierad rekombination kan vara ansvariga för de skillnader som dessa studier beskriver. Ändå överensstämmer de beskrivna fenotyperna med de kända mångfacetterade rollerna för njurstroma i njurutveckling, och mekanismerna bakom dessa fenotyper är sannolikt komplexa med tanke på karaktären av en Dicer-deletion. Ytterligare studier som undersöker specifika miRNA i olika stromala subpopulationer behövs för att bättre definiera de reglerande mekanismerna som är i spel.

Nyare arbete har behandlat frågan om funktionen av specifika miRNA i både de utvecklande njurarna och nefronfadern. Med hjälp av en mänsklig embryonal stamcellsmodell, Bantounas et al. visade att hämning av miR-199a~214-klustret resulterar i dysmorfa glomeruli, avvikande proximala tubuli, minskat WT1-uttryck och ökade interstitella kapillärer i njurliknande organoider (82). Intressant nog resulterar global deletion av hypoxi-responsiv miR-210 i ett manligt nefronunderskott (83). Till exempel försämrar villkorad deletion av miR-17~92-klustret i nefronföräldrar och deras derivat i möss progenitorcellsproliferation och minskar antalet utvecklande nefroner. Som ett resultat utvecklar mutanta möss proteinuri, njurfibros och nedsatt njurfunktion (84). Dysregulerade nivåer av miR-17~92 målgenen, CFTR, är inblandade i den defekta proliferationen av progenitorceller och minskad nefrontillgång i denna musmodell (85).

Små RNA-sekvensering (smRNA-Seq) har använts alltmer för att profilera miRNA-uttrycksmönster och för upptäckten av nya miRNA-arter. smRNA-Seq av E15.5 nefrogena mesenkymala celler identifierade 162 kommenterade miRNA som uttrycks differentiellt i denna cellpopulation jämfört med hela njurar och 49 nya miRNA-arter (86). Intressant nog reducerades nivåerna av miR-200-familjens miRNA avsevärt i nefronföräldrar. Med tanke på att medlemmar av miR-200-familjen är nyckelregulatorer av mesenkymal-epitelial övergång i samlingskanalen (87), spekulerar vi att deras uttryck kan vara hårt reglerat för att säkerställa normal epitelial differentiering av nefronföräldrar under njurutveckling.

MiRNA-funktion i det mogna nefronet

Utöver deras behov under njurutveckling reglerar miRNA många biologiska processer i de stora celllinjerna som bildar det mogna nefronet (69, 88–91). I enlighet med detta har segmentspecifikt uttryck av miRNA längs nefronet beskrivits, inklusive miR-143 och miR-195a i glomerulus, miR-107 och miR{{7} }a i den proximala tubuli, miR-193 och miR-378a i den tjocka stigande delen, miR-874 och miR-155 i den distala hoprullade tubuli, och miR{{ 12}}c i uppsamlingskanalen (87). Dessutom stöder funktionella studier i fack av det mogna nefron distinkta roller för miRNA.

Möss som saknar antingen Dicer eller Drosha i podocyter uppvisar markant proteinuri, glomeruloskleros och snabb progression till njursvikt, sekundärt till störning av den glomerulära filtrationsbarriären (90–93). In silicoanalyser visade att olika uppreglerade transkript i mutanta glomeruli innehåller målsekvenser för miR-30 familjemedlemmar. Som alla fyra miR-30 familjemedlemmar (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d och miR-30c{ {9}}) är normalt mycket uttryckta i podocyter, dessa miRNA kan vara ansvariga för podocytavvikelser och störningar av den glomerulära filtrationsbarriären hos mutanta möss (91).

Något överraskande påverkar inte deletion av Dicer från postnatala däggdjurs proximala tubuli inte njurutveckling, histologi eller funktion men skyddar mot njurischemi/reperfusionsskada. Muterade möss uppvisar bättre njurfunktion, minskad njurskada, lägre tubulär apoptos och förbättrad överlevnad jämfört med sina WT-kullkamrater (94). Detta återspeglar sannolikt "summan" av effekten av deletion av flera miRNA i den proximala tubuli, eftersom annat arbete sedan dess har visat att uttrycket av specifika miRNA är skyddande vid njurischemi/reperfusionsskada (t.ex. miR-16 och miR-21; ref. 95, 96); medan andra är skadliga (t.ex. miR-182; ref. 97).

Även om miRNA verkar vara oumbärliga för proximal tubulifunktion, är de väsentliga för distala nefroner och uppsamlingskanalhomeostas (79, 88, 98). Att samla in kanalspecifik inaktivering av Dicer och andra kritiska miRNA biogenes-associerade gener (inklusive Dgcr8, Ago1, 2, 3 och 4) orsakar njursvikt hos vuxna möss på grund av progressiv tubulointerstitiell fibros och interstitiell inflammation (88). Detta föregås av en partiell epitel-mesenkymal övergång (EMT) av uppsamlande kanalceller och nedreglering av miR-200 familjemedlemmar, som hämmar EMT (88). Likaledes resulterar ablation av antingen Dicer eller Dgcr8 från distala nefron- respektive ureteriska knoppar i njurabnormaliteter och njursvikt (78, 98), som i slutändan är förknippade med nedreglering av miR-200 familjemedlemmar (98). Ökat uttryck av miR-200-målgenen Pkd1 i dessa muterade möss stör tubulogenesen och producerar cystliknande strukturer (98). Dessa skillnader i kravet på funktionella miRNA i proximala tubuli och distal nefron/uppsamlingskanal kan förklaras av den segmentella fördelningen av miRNA längs nefronets längd och uppsamlingskanalen i WT-njurarna (88).

Deletion av Dicer i reninutsöndrande celler i den juxtaglomerulära apparaten resulterar i ett underskott av juxtaglomerulära celler, minskade cirkulerande reninnivåer med åtföljande sänkning av arteriellt blodtryck, minskad njurfunktion, randigt mönster av interstitiell fibros och vaskulära abnormiteter (89). Minskningen av juxtaglomerulära celler tyder på ett krav på mogna miRNA för att upprätthålla deras fenotyp. Senare identifierades miR-330 och miR-125b-5p som potentiella kandidater som antingen hämmar eller främjar den glatta muskelfenotypen av juxtaglomerulära celler (99).

Andra aktiva forskningsområden om miRNA vid akut njurskada (8–10), polycystisk njursjukdom (11) och njurtransplantation (10), har utförligt behandlats i andra nyare recensioner.

MiRNA vid pediatriska njursjukdomar I det här avsnittet ger vi en översikt över miRNA:s roll i utvecklingsrelaterade njursjukdomar, inklusive CAKUT och Wilms tumörer. CAKUT är bland de vanligaste formerna av missbildningar vid födseln och drabbar cirka 3–7 av 1000 levande födda (100). Störning av utvecklingen av njurarna och de nedre urinvägarna leder till ett brett spektrum av kliniska manifestationer som observerats i CAKUT, inklusive njuravvikelser (dvs njur-agenes, njurhypoplasi och dysplasi, och multicystiska dysplastiska njurar), ureteropelviska anomalier (dvs obstruktion av ureteropelvic korsning), duplex uppsamlingssystem och anomalier i urinblåsan och urinröret (101–103). Denna fenotypiska heterogenitet beror sannolikt på komplexa interaktioner mellan genetiska, epigenetiska och/eller prenatala miljöfaktorer som påverkar utvecklingen av njurar och nedre urinvägar, vilket resulterar i CAKUT (101). Det mesta av vår nuvarande kunskap om CAKUT-patogenes har härrört från musmodeller och syndromiska former av CAKUT. Dessa studier har lett till identifieringen av flera CAKUT-gener, av vilka många är inblandade i tidig njurutveckling, inklusive PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 och andra (101, 104, 105). Enstaka mutationer eller kopienummervarianter i proteinkodande gener förklarar dock inte majoriteten av CAKUT-fallen (~80%) (101, 106).

Som nämnts ovan resulterar utarmning av mogna miRNA från olika cellinjer i den utvecklande njuren i musmodeller i njurabnormaliteter som efterliknar human CAKUT (73, 74, 78, 79). Dessutom orsakar könslinjedeletioner av MIR17HG, som kodar för miR-17~92-klustret, typ 2 Feingold-syndrom hos människor (107). Även om en njurfenotyp hos patienter med Feingold-syndrom typ 2 med MIR17HG-mutationer förblir odefinierad, har en 18 % incidens av CAKUT rapporterats i fall av Feingold-syndrom associerade med MYCN-mutationer (108, 109). Tillsammans tyder dessa observationer på att mutationer i miRNA uttryckt under njurutveckling kan orsaka CAKUT hos människor, särskilt eftersom många miRNA är mycket konserverade mellan möss och människor.

För att testa denna hypotes undersökte en studie 1248 patienter med icke-syndromisk CAKUT från 980 familjer och letade efter mutationer i 96 stam-loop-regioner av 73 njurutvecklingsmiRNA-gener (106). Inom denna kohort identifierades 31 individer med 17 olika enkelnukleotidvarianter som påverkar 16 olika miRNA-gener. Bland dessa visade sig två nya varianter i miRNA vara potentiellt patogena. MIR19B1 (en medlem av miR-17~92-klustret) associerades med förekomsten av höger njur-agenes, och MIR99A var associerad med svår vesikoureteral reflux och njurptos. Detta förvånansvärt låga antal kandidat-patogena varianter beror delvis på begränsningarna i denna studie, eftersom analysen endast stod för mutationer i miRNA-gener som ingick i kandidatgenmetoden och inte upptäckte variationer i antal kopior och stora DNA-omarrangemang (106) .

I ett alternativt tillvägagångssätt analyserades uretersegment från patienter med en mängd olika CAKUT för differentiellt transkriptuttryck via mikroarray, för närvaron av bioinformatiskt förutsagda miRNA-mål och mogna miRNA via qPCR (110). Genom att använda denna mångsidiga metod identifierades sju miRNA med potentiella roller i CAKUT, och bland dessa ökade has-miR-144 signifikant hos patienter med CAKUT. Genontologisk analys indikerade att förutspådda has-miR-144-målgener bidrar till biologiska processer som är involverade i CAKUT-utveckling, inklusive rörutveckling (22 målgener), utveckling av urogenitala system (18 målgener), njurutveckling (14 målgener) och embryonal organutveckling (18 målgener) (110).

Ytterligare studier behövs för att definiera de molekylära mekanismerna bakom de patogena rollerna för miRNA i CAKUT. Resultat från sådana studier kommer att vara avgörande för att förbättra vården av patienter med CAKUT och förhindra deras progression till CKD, tillhandahålla lämplig genetisk rådgivning för patienter och deras familjer och utveckla nya terapeutiska strategier.