Mjölk Osteopontin för tarm, immunitet och hjärnutveckling hos prematura grisar
Jun 14, 2022
För mer information kontakta gärnadavid.wan@wecistanche.com
Abstrakt
Bristande nivåer av osteopontin i mjölk (OPN) i modersmjölksersättning kan delvis förklara utvecklingsskillnader mellan spädbarn som matats med modersmjölksersättning eller modersmjölk. Vi röstar upp storlek som en mjölkdiet kompletterad med bovin mjölkOPNförbättrar tarm, immunitet och hjärnans utveckling och testade detta i en prematura grismodell. Prematura grisar som fötts med kejsarsnitt (90 procent dräktighet) utfodrades med rå mjölk från nötkreatur (CON, n=19) eller samma diet kompletterad med en fysiologiskt relevant dos av OPN (46 mg/(kg:d), n{ {3}}). Slutpunkter relaterade till kliniska resultat, systemisk immunitet och neurokognitiv utveckling utvärderades under studien, och tarmvävnad samlades in en dag 19. Tillväxtmönster, tidig motorisk utveckling och de flesta systemiska immunparametrar var likartade mellan OPN ochLURAgrisar. OPN-grisarna hade högre villus-till-krypt-kvoter än CON-grisar och högre monocyt- och lymfocytantal på dag 8. Magsmältnings- och absorptionsfunktioner och kognitiva prestanda (T-labyrinttest) var likartade mellan OPN- och CON-grisar. Sammanfattningsvis kosttillskott medOPNöver basala mjölknivåer från nötkreatur inducerade mindre förbättringar i tarmstruktur och systemisk immunitet utan några effekter på kognitiva prestanda. De minimala nivåerna av OPN i modersmjölksersättning för att säkerställa optimal anpassning under den omedelbara neonatalperioden återstår att fastställa.
Nyckelord: osteopontin; bioaktivt mjölkprotein; prematura nyfödda; tarmhälsa; systemisk immunitet; hjärnans utveckling; kognition
Klicka här för att lära dig mer om Cistanche
1. Introduktion
Att optimera nivåerna av bioaktiva proteiner i modersmjölksersättning kan bidra till att minska de väletablerade skillnaderna i utveckling och sjukdomsresistens mellan spädbarn som matas med modersmjölksersättning och modersmjölk[1-3]. Osteopontin (OPN) är ett surt protein med hög glykosylering och fosforylering som anses viktigt för att stimulera utvecklingen under den omedelbara neonatalperioden och det är rikligt närvarande i tidig bröstmjölk[4-6]. OPN-mjölkkoncentrationerna varierar anmärkningsvärt mellan arter, och i bröstmjölk är även den interindividuella variationen mellan mödrar hög. En nedgång under laktationsperioden verkar vara en konsekvent observation [5,7]. I en multicenterstudie var mediannivån för OPN 160 mg/L ca 13 veckor efter förlossningen [7]. Den översta 25 procentnivån av OPN i bröstmjölk var 230-495 mg/L, vilket är mycket högre än de genomsnittliga nivåerna som rapporterats för mjölk från nötkreatur (~18 mg/L) eller modersmjölksersättning (~9 mg/L)[ 4]. För närvarande är OPN från nötkreatursmjölk kommersiellt tillgänglig och kan därför läggas till modersmjölksersättning för att nå nivåer som liknar nivåerna i bröstmjölk.
På grund av det högkonserverade arginin-glycin-aspartat (RDG) integrinbindande stället i OPN, kan de biologiska effekterna förväntas vara liknande över arter [8]. Fragmentet som innehåller RDG-sekvensen är mycket resistent mot nedbrytning på grund av glykosyleringar nära det integrinbindande motivet [9], vilket stöder den bioaktiva potentialen hos naturligt mjölk OPN i tarmen. In vitro kan mjölk OPN stimulera tarmcellsproliferation och utöva antibakteriella aktiviteter som en del av ett komplex med laktoferrin (LF), ett annat viktigt bioaktivt mjölkprotein [10,11]. De gynnsamma effekterna av mjölk OPN i tarmen har också visats in vivo. Tarmutvecklingen hos nyfödda rhesusapor har förbättrats av OPN från nötkreatursmjölk och jejunala transkriptomet hos OPN-supplementerade djur med formeln liknade den hos ammade motsvarigheter [12]. DietmjölkOPN-effekter, både lokalt i tarmen och systemiskt efter mindre intestinal absorption hos spädbarn, har delvis tillskrivits dess förmåga att stimulera endogena OPN-nivåer [5,13,14]. OPN finns i de flesta kroppsvävnader och vätskor där det utövar en mängd olika funktioner såsom biomineralisering och immunmodulering förutom att delta i cellproliferation, migration, adhesion och opsonisering [8,10,15,16]. OPN är känt för att reglera Th1/Th2-balansen, som hos nyfödda är snedställd mot en Th2-polarisering [17]. OPN har cytokinliknande egenskaper och kan stimulera immunitet av Th1-typ genom induktion av IL-12-uttryck och hämning av produktionen av IL-10, Th2cytokinet, i makrofager [18]. Dessutom kan OPN stödja hjärnmognad, vilket potentiellt kan bidra till de förbättrade kognitiva funktionerna hos spädbarn som ammas jämfört med modermjölksersättning [19-21]. Till stöd för detta visade OPN-matade musungar bättre inlärningsförmåga och högre uttrycksnivåer av proteiner relaterade till myelinisering, inklusive myelinbasprotein och myelinassocierat glykoprotein, och OPN förbättrade också myelineringen in vitro [14,22,23]. Hos terminsgrisar påverkades flera hjärnregioner av ökad relativ volym efter kosttillskott med bovin mjölk OPN men inga effekter på kognitionsparametrar observerades [24].
För tidigt födda barn (födelse<37 weeks="" of="" gestation)="" are="" particularly="" diet-sensitive="" due="" to="" their="" relatively="" immature="" gut,="" immune="" system,="" and="" brain.="" such="" infants="" are="" susceptible="" to="" developing="" both="" short-and="" long-term="" complications="" such="" as="" necrotizing="" enterocolitis="" (nec),="" feeding="" intolerance,="" infections,="" and="" impaired="" neurodevelopment="" [25-28].="" bovine="" milk="" opn="" supplementation="" has="" previously="" been="" shown="" to="" reduce="" nec="" severity="" in="" formula-fed="" preterm="" piglets="" [29],="" and="" other="" milk="" factors="" have="" proven="" to="" support="" brain="" structure="" and="" cognitive="" development,="" particularly="" in="" preterm="" newborns="" [30,31].="" on="" this="" background,="" we="" hypothesized="" that="" preterm="" newborns,="" fed="" a="" standard="" milk="" diet="" with="" relatively="" natural="" bioactivity,="" would="" benefit="" from="" further="" opn="" supplementation.="" following="" an="" initial="" in="" vitro="" demonstration="" of="" opn="" antimicrobial="" activity,="" we="" used="" diet-sensitive="" preterm="" pigs="" [32-34]to="" investigate="" if="" an="" opn-enriched="" bovine="" milk="" diet="" would="" improve="" gut,="" immunity,="" and="" brain="" development="" in="" the="" first="" three="" weeks="" after="" preterm="">
2. Material och metoder 2.1. In vitro antibakteriell analys
Först användes en antibakteriell analys [35] för att bedöma bioaktiviteten avOPNgenom att kvantifiera dess förmåga att hämma tillväxten av, eller döda, Staphylococcus, dvs en vanlig neonatal Gram-positiv patogen [36]. Samma intakta opastöriserade mjölk från nötkreatur som användes som bas för den enterala dieten i grisstudien tinades och centrifugerades i följd vid 500×g och 3000×8,4 grader i 15 minuter, varvid det vattenhaltiga lagret aspirerades varje gång för att avlägsna fetthalten medan minimera förlusten av mjölkproteiner [37]. Efter sterilitetstestning av den skummade bovina mjölken,OPNpulver (Lacprodan⑧ OPN-10, Arla Foods Ingredients, Viby, Danmark) löstes i koncentrationer på 1,6 (samma som mängden som tillsattes dag 1 i grisstudien till OPN-mjölken), 2,8, 5, 10 och 20 g /L, skapade 6 testdieter, inklusive icke tillsatt skummjölk från nötkreatur, som lagrades i alikvoter om 1 ml vid -80 grad fram till analys. Frysta odlingsstockar [35] av S.epidermidis (WT1457 [38], vänligen tillhandahållna av Dr. Xiaoyang Wang, Göteborgs universitet, Sverige) tinades, centrifugerades vid 3200×g och återsuspenderades i steril koksaltlösning före inkubation med de 6 testdieterna (förutom en kommersiellt tillgänglig för tidigt född mjölkersättning, inkluderad som en negativ kontroll [1]) vid en beräknad dos på 10 grader och 106 CFU/mL under 2, 4,6 och 24 timmar vid 37 grader. De slutliga inokuleringsdoserna och bakterietillväxten i testdieterna och modersmjölksersättningen efter olika inkubationstider bestämdes [35]. Oberoende triplikat av den antibakteriella analysen utfördes.
2.2. Djur och experimentell design
Alla djurförsök godkändes och genomfördes under en licens (licensnummer 2014-15-0201-00418) utfärdad av den danska djurförsöksinspektionen. Fyrtioåtta smågrisar (danska Landracex Yorkshire Duroc) från två kommersiellt uppfödda suggor förlossades för tidigt med kejsarsnitt vid cirka 90 procent dräktighet (heltid: 117±2 d). Efter framgångsrik återupplivning och medan den fortfarande var bedövad från moderbedövning, utfördes den kirurgiska placeringen av en inneboende navelartärkateter för att underlätta parenteral nutrition (PN) och en orogastrisk matningssond för att underlätta enteral nutrition (EN) som tidigare beskrivits 32]. Sex smågrisar avlivades omedelbart efter födseln på grund av misslyckad återupplivning och uteslöts följaktligen från studien. Totalt stratifierades fyrtiotvå smågrisar efter kön och födelsevikt och tilldelades en av två grupper: en grupp som fick rå mjölk från nötkreatur kompletterad med OPN(OPN, n=21) och en kontrollgrupp som fick obehandlad rå bovin mjölk(LURA, n=21)(Figur 1). Moderns plasma infunderades i 3 bolusar (totalt 25 ml/kg) via navelkatetern inom de första 24 timmarna för att säkerställa passiv immunisering. Grisar föds upp individuellt under studieperioden på 19 dagar. Från dag 1-5 föds de upp i ventilerade uppvärmda inkubatorer (plus syresättning under de första 24 timmarna), och dag 5 och 11 flyttades de till större burar. Alla kliniska utredare var blinda för dietbehandlingarna under hela experimentperioden.
2.3. Näring och utfodring
Den enterala dieten som gavs till alla grisar var baserad på opastöriserad intakt bovin mjölk som samlats in i två omgångar från en lokal Jersey ko-mjölkgård och lagras i -20 grad. Nötkreatursmjölken berikades med mineraler och vitaminer (15 g/L Pediatric Seravit, Nutricia, Utrecht, Nederländerna) och elektrolyter (6 g/L Revolyte Nutrition, Gunnar Kjems ApS, Köpenhamn, Danmark). Denna mjölkbas fungerade som den kompletta enterala dieten för smågrisar i CON-gruppen. För grisar i OPN-gruppen kompletterades den bovina mjölkbasen ytterligare med bovinmjölk OPN(Lacprodan⑧ OPN-10) vid ett mediantillskottOPNkoncentration på 319 mg/L(IQR 272-445) för att erhålla en daglig fast extra OPN-dos på 46 mg/(kg·dag). Koncentrationen ligger inom humanmjölkintervallet för OPN [4]. Koncentrationen av OPN i den uppsamlade bovina mjölken var 91 mg/L mätt med vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS, Alphalyse A/S, Odense, Danmark). Den kompletterande dosen av OPN valdes att ligga inom den högre delen av humanmjölkintervallet för att säkerställa en rimlig skillnad från nötkreatursmjölkskontrolldieten. Dagliga förberedelser av enterala dieter gjordes och lagrades vid 4 grader tills användning (<24 h).="" pigs="" received="" gradually="" increasing="" volumes="" of="" en="" from="" 32="" ml/(kg.="" day)="" on="" day="" 1="" to="" 180ml/(kg:="" day)on="" day="" 15="" and="" until="" euthanasia.="" the="" enteral="" diets="" were="" given="" as="" boluses.="" during="" the="" daytime,="" the="" boluses="" were="" given="" every="" second="" hour,="" and="" during="" the="" night="" every="" third="" hour="" until="" day="" 9.="" thereafter,="" the="" feeding="" frequency="" was="" reduced="" to="" every="" third="" hour,="" day="" and="" night.="" the="" en="" was="" given="" through="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" until="" day="" 5="" when="" pigs="" were="" taught="" to="" drink="" from="" troughs.="" the="" pn="" was="" given="" as="" a="" continuous="" infusion="" in="" decreasing="" amounts="" from="" days="" 1-8="" (144-148="" ml/(kg.="" day))to="" counterbalance="" the="" small="" enteral="" volumes="" the="" piglets="" can="" cope="" with.="" the="" pn="" solution="" was="" a="" commercially="" available="" human="" parenteral="" nutrition="" product="" (kabiven,="" fresenius="" kabi,="" uppsala,="" sweden)="" adjusted="" to="" the="" requirements="" of="" piglets="" as="" previously="" described="" [32].="" after="" removal="" of="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" on="" day="" 11="" and="" onwards,="" all="" pigs="" had="" free="" access="" to="">
2.4. Klinisk utvärdering och vävnadsinsamling
Under hela studieperioden övervakades grisar noggrant (minst var tredje timme) och kliniska poäng tilldelades två gånger dagligen som tidigare beskrivits [33]. Vid klinisk indikation inleddes relevanta behandlingar, t.ex. administrering av intramuskulära analgetika (meloxikam: Metacam, 5 mg/ml Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Tyskland eller butorfanol: Torbugesic Vet, 10 mg/ml, Zoetis, Parsippany, NJ, USA). I fall av bristande respons på behandlingen avlivades grisar. Kroppsvikter mättes varje dag, och den genomsnittliga kroppsviktsökningen uttryckt som g/(kg.d), beräknades enligt formeln:(vikt vid dödshjälp-vikt vid födseln)/(medelkroppsvikt× livstid). Två gånger dagligen poängsattes avföring enligt följande: 1 (fast avföring), 2 (mjuk/deig avföring), 3 (krämig avföring) och 4 (diarré). En oral elektrolytlösning (Revolyte Nutrition) gavs mellan matningarna i fall av diarré för att undvika uttorkning. Profylaktiska orala antibiotika (metronidazol: Flagyl, 40 mg/ml, Sanofi-Aventis, Paris, Frankrike; amoxicillin, 500 mg, med klavulansyra, 125 mg: Bioclavid, Sandoz GmbH, Köpenhamn, Danmark; gentamicin: Gentocin Vet, 4,35 mg/ml , Scanvet, Fredensborg, Danmark) gavs två gånger om dagen från dagarna 8-10 efter avlägsnandet av navelartärkatetern. Samma kombination av orala antibiotika administrerades terapeutiskt efter indikation. På dag 19, 60 minuter före dödshjälp, fick grisarna en sista standardiserad bolus av sina respektive dieter. Grisar bedövades med en intramuskulär injektion av zolazepam/tiletamin (Zoletil 50,25 mg/ml zolazepam och 25 mg/ml tiletamin, Virbac, Carros, Frankrike), ketamin (Ketaminol, 50 mg/ml, MSD Animal Health, Kenilworth, NJ , USA) och butorfanol (Torbugesic Vet), och de avlivades därefter med natriumpentobarbital (Euthanimal, 400 mg/ml, Scanvet) genom intrakardiell injektion. Omedelbart efter dödshjälp dissekerades och vägdes inre organ, både hela organ och specifika organregioner (t.ex. full/tom mage, tunntarm, kolon, helhjärna, hjärnregioner, lever, mjälte, njurar, lungor och hjärta). Den cerebrala vattenfraktionen uppskattades genom att väga den vänstra hjärnhalvan före och efter uttorkning i 14 dagar vid 50 grader. Var och en av de fem gastrointestinala regionerna (mage, proximal tunntarm (Prox), mellersta tunntarm (Mid), distal tunntarm (Dist) och kolon) utvärderades makroskopiskt och tilldelades en NEC-poäng [39]. Vävnadsprover från varje mag-tarmregion togs och snabbfrystes i flytande kväve eller fixerades i 4 procent formaldehyd och lagrades vid -80 grad tills vidare analyser. Studiens design och resultat visas i figur 1.
2.5. Intestinal slemhinnastruktur och Brush Border Enzyme Activities
Slemhinnans struktur i tunntarmen bedömdes genom att mäta villushöjd och kryptdjup av histologiska skivor av Prox-, Mid- och Dist-vävnader fixerade i paraformaldehyd och färgade med hematoxylin och eosin som tidigare beskrivits [40]. Immunhistokemisk färgning för Ki-67 av replikat av Prox-, Mid- och Dist-sektioner användes för att utvärdera enterocytproliferationen i tunntarmens slemhinna som tidigare beskrivits [41]. Fyra bilder av varje replikat erhölls på ett systematiskt slumpmässigt sätt med användning av ett ljusmikroskop (Ortho-plane, Leitz, Tyskland), fäst till en kamera och en 10× objektivlins. Bildanalys utfördes med Fiji: Image](NIH Image, Bethesda, Maryland) och den totala arean av Ki-67-positiva färgade kärnor beräknades som en bråkdel av den totala kärnarean. Aktiviteten hos 6 borstgränsenzymer (maltas, sukras, laktas, aminopeptidas N (ABN), aminopeptidas A (APA) och dipeptidylpeptidas IV (DPPIV)) bestämdes i homogenat i mitten av vävnaden med användning av spektrofotometri [42].
2.6.Blodbiokemi, hematologi och systemisk immunitet
Blodprover för biokemi och hematologiska parametrar analyserades på dag 1 från navelsträngen under kejsarsnitt, på dag 8 från patenterade navelartärkatetrar, eller alternativt halsvenen, och på dag 19 från hjärtpunktion under dödshjälp. Plasma för biokemi erhållet med en hepariniserad blodvakutainer (BDDiagnostics, Oxford, Storbritannien) följt av centrifugering (2500×g,4 grader i 10 minuter) analyserades med användning av ADVIA 1800 Chemistry System (Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Tyskland). Fullblod för hematologi och antal immunceller erhållet med en EDTA-belagd blodvakutainer (BD Diagnostics), analyserades med ADVIA 2120i Hematology System (Siemens Healthcare GmbH).
Systemiska immunitetsrelaterade analyser för att studera undergrupper av T-celler i blod, neutrofil fagocytosfunktion och immunkompetens genom ex vivo-blodstimulering av Toll-like receptor (TLR) utfördes på helblodsprover som samlats in i en hepariniserad blodvakutainer (BD Diagnostics) på två dagar; Dag 8 från navelartärkatetrar alternativt halsvenen och Dag 19 från halsvenen. Blod T-cell undergrupp karakterisering mättes som tidigare beskrivits [43]. Kortfattat lyserades erytrocyter med användning av 1 X BD FACS lyseringslösning (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) och leukocyter inkuberades med fixerings-/permeabiliseringsbuffert (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) i 30 minuter vid 4 grader i mörker. Efter tvättning med permeabiliseringsbuffert (Invitrogen), blockerades cellerna med svinserum (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) under 15 min 4 grader i mörker och färgades därefter med fyra fluorescensmärkta monoklonala antikroppar; PE-Cy7-konjugerad mus-anti-gris CD3-antikropp (klon BB23-8E6-8C8, BD Biosciences), FITC-konjugerad mus-anti-gris CD4-antikropp (klon MIL17, Bio- Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien), PE-konjugerad mus-anti-gris CD8-antikropp (klon MIL12, Bio-Rad Laboratories) och APC-konjugerad råtta-anti-mus FOXP3-antikropp (klon JFK-16s, ThermoFisher Scientific). Prover analyserades med en BD Accuri C6 flödescytometer (BDBiosciences) och populationer av T-celler (CD3 plus lymfocyter), cytotoxiska T-celler (CD3 plus CD4-CD8 plus lymfocyter), T-hjälparceller ( CD3 plus CD4 plus CD8-lymfocyter) och regulatoriska T-celler (CD3 plus CD4 plus FoxP3 plus lymfocyter) identifierades. Den fagocytiska funktionen hos blodneutrofiler analyserades med flödescytometri med pHrodo Red Escherichia coli (560/585) nm) Bioparticles Fagocytosis Kit för flödescytometri (ThermoFisher Scientific)34]. Fagocythastigheten indikerades av procentandelen neutrofiler som utövade fagocytos i neutrofilpopulationen (pHrodo plus) och neutrofilernas fagocytiska kapacitet indikerades av medianfluorescensintensiteten (MFI). För att bedöma det systemiska inflammatoriska svaret på en ex vivo Gram- negativ bakteriell utmaning, 294 μL fullt blod inkuberades med en TLR4-agonist (lipopolysackarid (LPS), E.coli O127:B8, Sigma Aldrich, St.Louis, MI, USA) i 5 timmar vid 37 grader ,5 procent CO,. Stimulerat och ostimulerat blod centrifugerades sedan vid 2000×g, 4 grader i 10 minuter, och plasmasupernatanter analyserades med avseende på tumörnekrosfaktor (TNF)- och interleukin (IL)-10 med ELISA (Porcine Specific Duoset Kits, R&D Systems, Abingdon, Storbritannien), enligt tillverkarens riktlinjer. Plasmaproverna späddes 2-2,5 gånger före analys. Endast prover med cytokinabsorbansnivåer inom standardintervallet inkluderades för beräkning av genomsnittliga cytokinnivåer och -förhållanden. Prover med cytokinabsorbansnivåer under lägsta standard men högre än blank fick dock ett godtyckligt värde på hälften av den lägsta detekterade nivån i plattan och inkluderades i den statistiska analysen.
2.7. Tidig motorisk utveckling, beteende och kognition
Tiden till första uppställning och första gång efter födseln mättes som uppskattningar av grundläggande motorisk färdighet. Rörelsekänsliga infraröda kameror installerade ovanför varje hembur registrerade kontinuerligt grisens motoriska aktivitet från dag 1 klockan 21:00 pm när grisarna var helt återställda från moderns bedövningsmedel till dag 11[33]. Den genomsnittliga andelen aktiv tid under en timme beräknades från inspelningar av 12-timmarsintervall under dagtid (9:00 am till 9:00 pm) och nattetid (från 9:{{12 }} pm to 9:00 am). Det utforskande beteendet hos varje gris utvärderades på dag 9 i en arena för öppen fält (1,2 m×1,2 m) med en videokamera som spelade in från en fågelsyn under en {{ 20}}min inspelningsperiod med grisar i randomiserad ordning. Grisar tilldelades en totalpoäng i realtid av två blinda observatörer baserat på fyra objektiva parametrar: golvkontakt, väggkontakt, flyktförsök och ett antal gångarter. De förvärvade videorna analyserades därefter med EthoVision XT10 (Noldus Information Technology, Wageningen, Nederländerna). Resultaten var total sträcka förflyttad och hastighet beräknad för varje gris. Efter adekvat visuell utveckling och en period av tillvänjning, utvärderades den rumsliga kognitionen för varje gris i en randomiserad ordning under dagar 12-18, med hjälp av det standardiserade spatiala T-labyrintkognitionstestet [44]. Hippocampus-beroende inlärning och minne testades under 1-2 förvärv om dagen, var och en bestående av 10 försök. Extra-labyrint visuella ledtrådar användes för att grisarna skulle navigera för att hitta en fast mjölkbelöning. Omväxlande startpositioner för grisar användes för att undvika egocentrerade svarsmekanismer och mjölk placerades i båda belöningsarmarna. För att maskera luktsignaler var mjölken dock endast tillgänglig i en av armarna. Antalet korrekta val per förvärv registrerades under en standardfas (Förvärv 1-6, Dagar 12-17) och en reverseringsfas (Förvärv 7-9, Dagar 17-18). I reverseringsfasen ändrades mjölkbelöningen till den motsatta armen. Minst 80 procent korrekta val (8 korrekta val av 10 försök) definierades som inlärningskriteriet [30].
2.8. Statistisk analys
Den statistiska programvaran R (version 3.6.0) användes för alla statistiska analyser. För den antibakteriella analysen analyserades skillnader i S.-tillväxt mellan de 6 testdieterna och modersmjölksersättningen över 2-24 timmars inkubation med hjälp av en linjär modell med blandade effekter (Ime-funktion) med inokuleringsdos, tid och testdiet /formel som fasta effekter (inklusive interaktionen mellan de två sista) och experimentperioden som en slumpmässig effekt, följt av parvisa jämförelser vid varje tidpunkt (ls betyder paket). Kontinuerliga upprepade mätningar från grisstudien (dvs kroppsvikt, aktivitet i hemmaburen, korrekta val i det spatiala T-labyrintens kognitionstestet och tunntarmsparametrar uppmätta över flera regioner) analyserades med en linjär modell med blandade effekter (mig funktion) inklusive lämplig korrelationsstruktur och gris som en slumpmässig effekt. Paketet underlättade efterföljande jämförelser inom varje tunntarmsområde. En Cox proportional hazard-modell (funktion) användes för kontinuerlig data från tid till händelse (dvs förvärv av grundläggande motoriska färdigheter och första gången med diarré). Alla andra kontinuerliga data analyserades med hjälp av en multipel linjär regressionsmodell (lm-funktion). Holm-korrigeringen tillämpades på all blodbiokemi för att korrigera för multipla jämförelsetestningar och kontrollera den familjemässiga felfrekvensen. Diskreta tid-till-händelsedata (dvs. andelen grisar som nådde T-labyrintinlärningskriteriet) analyserades med hjälp av en generaliserad multipel linjär regressionsmodell (funktion) med ett binomiskt svar och en komplementär log-logglänk. Kön, kull och födelsevikt identifierades som biologiskt relevanta potentiella confounders före studien och inkluderades därför som fasta effekter i alla ovan nämnda modeller. Dessutom, för all blodbiokemi och hematologiska parametrar, inkluderades baslinjenivåerna som mättes på dag 1 före grupprandomisering som fixerade effekter i motsvarande multipla linjära regressionsmodeller. Modellvalidering av linjära regressionsmodeller utfördes genom grafiska visningar av normaliteten och homoskedasticiteten hos residualerna och anpassade värden, och datatransformationer (log eller sqrt) för att uppfylla dessa antaganden utfördes vid behov. För variabler som inte kunde överensstämma med en normalfördelning användes det icke-parametriska Mann-Whitney-testet. Regressionsmodeller med kategoriska svarsvariabler validerades genom att undersöka de ackumulerade resterna med hjälp av goodness-of-fit-testet (av paketet). Om inget annat anges presenteras rådata som medelvärden ± SD och p-värden<0.05 are="" considered="" statistically="">
3. Resultat
3.1. In vitro antibakteriell analys
Effekterna av skummad nötmjölk kompletterad med OPN i olika koncentrationer, på tillväxten och livsdugligheten av S., utvärderades och jämfördes med modersmjölksersättning. Efter 4, 6 och 24 timmars inkubation med modersmjölksersättning ökade S.-koncentrationen med cirka 10,50 respektive 1 × 10 plus-faldigt för både inokuleringsdoser (10) och 10 grader FU ). Det fanns inga skillnader mellan de 6 testdieterna och formeln före 4 timmars inkubation med inokuleringsdosen på 105 CFU (Figur 2). En uppenbar bakteriedödande effekt av den bovina mjölkbaserade testdieten var dock uppenbar jämfört med modersmjölksersättning, eftersom S.-koncentrationen förblev statisk i dessa under 1-4 timmars inkubation. Vid 4 timmars inkubation, efter samma inokuleringsdos, var bakterieantalet lägre i alla 6 testdieterna jämfört med formeln (ungefär 10 gånger, p < 0,01).="" opn-tillskottet="" utövade="" dosberoende="" långtidsbakteriostatiska="" effekter="" mot="" s.="" eftersom="" bakterieantalet="" efter="" 6="" timmars="" inkubation="" var="" signifikant="" lägre="" i="" testdieterna="" som="" innehöll="" de="" 4="" högsta="" opn-doserna=""><0.05,10>inokuleringsdos). Endast icke tillsatt skummjölk från nötkreatur förlorade tillfälligt sin förmåga att förhindra tillväxt av bakterier när den inkuberades i 6 timmar (105 CFU-ympningsdos). Vid 24 timmars inkubation var bakterieantalet lägre i alla 6 testdieterna jämfört med formeln (p<001, 105="" cfu="" inoculation="" dose).="" all="" 6="" test="" diets="" exerted="" bacterial="" inhibitory="" effects="" (initially="" bactericidal)="" against="" s.,="" inoculated="" at="" 10°cfu,="" at="" all="" tested="" time=""><2 h="" of="" incubation=""><0.07,>2 timmars inkubation sid<>
3.2. Kliniska och tillväxtresultat
Sju grisar (5/21 OPN jämfört med 2/21 CON, p=0.4) av de 42 grisarna avlivades/dödes som en konsekvens av omognadsrelaterade/iatrogena komplikationer i början av experimentet (
3.3. Tarmstruktur och funktion
Villushöjd och kryptdjup, bedömda i de proximala, mellersta och distala delarna av tunntarmen var likartade mellan de två grupperna (tabell 2). Jämfört med CON, mättes ett totalt sett högre villus-till-krypt-förhållande över de tre tunntarmsområdena i OPN(p<0.05, figure="" 4a).="" similar="" amounts="" of="" proliferative="" enterocytes="" were="" observed="" between="" the="" two="" groups,="" indicated="" by="" the="" same="" relative="" area="" of="" ki-67="" positive="" stained="" nuclei="" in="" the="" three="" small="" intestinal="" regions="" (figure="" 4b,="" c).="" further,="" the="" gastric="" emptying="" ability="" indicated="" by="" the="" gastric="" content="" weights="" at="" euthanasia="" as="" well="" as="" the="" activity="" of="" lactase,="" maltase,="" sucrase,="" apa,="" abn,="" and="" dppiv="" measured="" in="" the="" middle="" part="" of="" the="" small="" intestine="" were="" comparable="" between="" the="" groups="" (table="">
3.4. Blodbiokemi, hematologi och systemisk immunitet
Navelsträngsblodprover avslöjade ett högre totalt antal leukocyter och basofiler på dag 1 (s<0.05)of pigs="" later="" assigned="" the="" opngroup="" relative="" to="" pigs="" assigned="" the="" con="" group.="" no="" other="" immune="" cell="" counts,="" blood="" biochemistry,="" or="" hematology="" variables="" differed="" between="" the="" two="" groups="" prior="" to="" receiving="" their="" specific="" dietary="" interventions(data="" not="" shown).="" blood="" biochemistry="" variables="" measured="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" differ="" between="" groups(table="" s1,="" supplementary="" materials),="" and="" accompanied="" hematology="" parameters="" and="" immune="" cell="" counts="" are="" presented="" in="" table="" 3.="" compared="" with="" con="" pigs,="" opn="" pigs="" had="" a="" higher="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" on="" day=""><0.05, figure="" 5a,="" b).="" the="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" increased="" from="" day="" 8="" to="" day="" 19,="" with="" no="" final="" differences="" between="" the="" groups(figure="" 5a,="" b).="" the="" remaining="" immune="" cell="" counts="" and="" nonimmune-related="" hematological="" parameters="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" pigs="" (table="" 3).="" innate="" and="" adaptive="" immune="" parameters="" were="" evaluated="" on="" days8="" and="" 19.="" on="" day="" 8,="" the="" blood="" neutrophil="" phagocytic="" rate="" and="" capacity="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" (table="" 3).="" conversely,="" on="" day="" 19="" they="" had="" a="" higher="" frequency="" of="" neutrophils="" exerting="" phagocytosis="" compared="" with=""><0.05). the="" phagocytic="" capacity="" was="" though="" not="" different="" between="" groups="" (figure="" 5c,="" d).="" the="" t-cell="" subset="" characterization="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" reveal="" any="" differences="" between="" t="" helper="" cells,="" cytotoxic="" t="" cells,="" and="" regulatory="" t="" cells="" in="" the="" two="" groups="" (table="" 3).="" a="" representative="" facs="" gating="" is="" shown="" in="" figure="" s1,="" supplementary="" materials.="" the="" tlr4-mediated="" il10="" and="" tnf-α="" cytokine="" production="" of="" full="" blood="" from="" days="" 8="" and="" 19="" was="" evaluated.="" tnf-α="" and="" il10="" were="" detected="" at="" similar="" levels="" between="" opn="" and="" con="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 8="" and="" there="" were="" no="" group="" differences="" in="" the="" response="" to="" lps="" stimulation="" indicated="" by="" a="" similar="" tnf-α/il10="" ratio(table="" s2,="" supplementary="" materials).="" tnf-α="" was="" not="" detectable="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 19="" from="" either="" group.="" however,="" both="" groups="" responded="" equally="" to="" lps="" stimulation,="" indicated="" by="" similar="" tnf-α="" and="" il-10="" plasma="" levels="" (table="" s2,="" supplementary="">
3.5. Hjärnans strukturella och funktionella resultat
Strukturella hjärnrelaterade resultat inklusive de absoluta och relativa värdena för den totala hjärnvikten, regionala hjärnvikter och det cerebrala vatteninnehållet var liknande mellan OPN- och CON-grupperna (tabell 4). Inga skillnader i tidig motorisk utveckling observerades, eftersom tiden till första uppställning, första promenaden och första frivilliga intaget av en hel mjölkbolus samt andelen aktiv tid i hemmaburar mättes med rörelsekänsliga kameror från Days { {3}}, var liknande mellan OPN och CON (Figur 6A-D). Det undersökningsbeteende för grisar som utvärderades i den öppna fältarenan på dag 9 var jämförbart mellan de två grupperna, eftersom den totala poängen, den totala sträckan och hastigheten var likartade (tabell 4). Vidare observerades en liknande kognitiv prestation under standard- och reverseringsfasen i det rumsliga T-labyrint-kognitionstestet som utfördes under 9 förvärv från dagarna 12-till 18 (Figur 7A, B). Den genomsnittliga andelen korrekta val över tiden ökade för båda grupperna i båda faserna (Figur 7A). I standardfasen nådde både OPN och CON det fördefinierade inlärningskriteriet på förvärv 5 (80 procent korrekta val, Figur 7A). Alla grisar nådde inlärningskriteriet, och det fanns ingen skillnad i den tid det tog att nå inlärningskriteriet (Figur 7B).
4. Diskussion
De multifunktionella effekterna av OPN, särskilt när det gäller dess proliferativa, immunreglerande och antibakteriella aktivitet, men potentiellt också för att stödja hjärnans utveckling, kan hjälpa till att förbättra hälsan och organutvecklingen hos känsliga nyfödda och spädbarn. De höga OPN-nivåerna i tidig modersmjölk och motsvarande spädbarns OPN-plasmakoncentrationer förespråkar en tillräcklig tillförsel av OPN under den omedelbara neonatala perioden när spädbarn matas med bröstmjölk [5]. Tvärtom, den lägre koncentrationen av OPN i nötkreatursmjölk och modersmjölksersättning 4 ger en möjlighet att öka OPN-halten i mjölkersättningar, och tillskott med OPN kan bidra till att minska de utvecklingsskillnader som finns mellan modersmjölksersättning och modersmjölk -matade spädbarn [2,3]. I den här studien visade vi att tillskott av OPN till en nötmjölksdiet med basalt OPN-innehåll tolererades väl, men endast mindre förbättringar i tarmstruktur och systemisk immunitet observerades, och inga ytterligare effekter på hjärnans struktur och funktion observerades. Den bovina mjölkbasen valdes för att säkerställa en relevant bioaktiv basdiet i jämförelse med en mjölkformel, som utöver det lägre OPN-innehållet också har minskad bioaktivitet. Mjölk OPN är erkänt som ett viktigt biologiskt aktivt vassleprotein, främst på grund av dess förmåga att modulera immunitet och stimulera cellproliferation [18,45]. OPN:s förmåga att bilda komplex med det positivt laddade laktoferrinet som finns i mjölk kan lägga till ytterligare funktionella egenskaper genom att bidra till försvaret mot patogener i spädbarnets tarm [10]. OPN-laktoferrinkomplexet finns i human och bovin mjölk, men kan också bildas från de enskilda proteinerna [10]. För att dokumentera den bioaktiva potentialen hos OPN i en mjölkbaserad diet från nötkreatur testade vi initialt den antibakteriella förmågan in vitro hos nötmjölk OPN tillsatt i olika koncentrationer till steril skummad Jerseymjölk. Våra resultat visar att den OPN kompletterade mjölkdieten utövar både kort- och långtidsantibakteriell förmåga på ett dosberoende sätt genom att hämma tillväxten av S.epidermidis, en vanlig neonatal patogen som orsakar sepsis efter tarmtranslokation [46,47 ]. Detta ger en möjlighet att stimulera tarmutvecklingen genom OPN-tillskott av den neonatala mjölkdieten. Optimala dietära OPN-nivåer i mjölkbaserad kost är oklara, och variationen av OPN-innehåll i bröstmjölk är stor, både mellan mödrar och länder, och under amningsperioden [7. Tidigare djurstudier har övervägande undersökt effekterna av att lägga till OPN till en kontrolldiet utan OPN, i nivåer som är jämförbara med medelhalten av humanmjölk [14,22,24]. I denna prekliniska grisstudie fokuserade vi på den kliniskt relevanta aspekten av att lägga till mer OPN till en diet med en basal OPN-nivå för att nå höga nivåer av bröstmjölk. OPN-tillskottet i denna studie ökade den dagliga dosen av OPN till en dos som representerade intaget hos spädbarn från mödrar med relativt hög OPN-mjölkkoncentration, och långt utöver vad som normalt tas emot från modersmjölksersättning[4]. OPN-halten i den insamlade Jerseymjölken visade sig ha ett högre OPN-innehåll än vad som tidigare uppmätts i bovinmjölk. Det är av relevans att notera att LC-MS/MS-metoden som används skiljer sig från ELISA-metoden som använts i tidigare studier [48]. Avsaknaden av kognitiva effekter i den aktuella studien kan ligga i det faktum att kontrollgrisarna redan får OPN i koncentrationer på 91 mg/L, som är naturligt närvarande i Jerseymjölken, och det extra OPN-tillskottet ger inga ytterligare fördelar. Vi fann att tillskott av bovin mjölk med OPN tolererades väl och gav mindre effekter på tarm- och immunmognad, medan hjärnans strukturella och funktionella parametrar var oförändrade. Både OPN- och CON-grisarna visade tillväxthastigheter som var jämförbara med eller högre än vad som normalt observeras hos för tidigt födda smågrisar i liknande studier med nötmjölksdieter [49-51]. Tillväxthastigheten och den relativt goda kliniska statusen med låg NEC-poäng som uppnåddes hos dessa prematura grisar gav optimala förutsättningar för att dokumentera kosteffekter på förändringar i organfunktioner och hjärnans kognitiv utveckling hos känsliga nyfödda.
Det finns en stor likhet mellan OPN-sekvenser för människor, ko och grisar [52], och OPN:s allestädes närvarande natur är väl etablerad hos grisar. OPN uttrycks av en mängd olika friska grisvävnader med det största överflöd som finns i ilealvävnad [53], men svinmjölkskoncentrationer är okända. Vi har tidigare visat mindre fördelaktiga tarmeffekter av en OPN-berikad formel hos prematura smågrisar i relation till återhämtning från prenatal inflammation [43]. Sammantaget betonar detta användningen av smågrisen som en preklinisk modell för att undersöka effekterna av kosttillskott av OPN. I förhållande till CON hade OPN-grisar ett högre villus-till-krypt-förhållande över tunntarmen. En liknande morfologisk skillnad rapporterades baserat på duodenala prover från 10-daggamla mössungar som ammades av vildtypsmödrar eller OPN knock-out mödrar kompletterade med nötkreatursmjölk OPN i förhållande till mössungar som inte fick någon OPN[22]. Tidigare studier av prematura grisar har korrelerat ökade villushöjder med en förbättrad näringsabsorptionsförmåga av t.ex. galaktos [51,54], vilket kan vara avgörande för att säkerställa optimal tillväxt. Med hjälp av gris IPEC-J2-cellinjen har vi tidigare visat in vitro förmågan hos OPN att öka cellproliferationen på ett dosberoende sätt [43]. Den förbättrade grova tarmslemhinnan som observerades bland OPN-grisar i den aktuella studien kunde inte förklaras av en ökning av proliferativa enterocyter baserat på Ki-67-färgning i tunntarmen och resulterade inte i förändrade matsmältningsenzymaktiviteter. Tidigare fynd i OPN kompletterade formelmatade nyfödda rhesusapor, har visat tarmförändringar med jejunal genuttrycksprofiler att vara mer lik de ammade motsvarigheterna [12]. Samma utvecklingsbana avseende immuncellantal observerades hos OPN- och CON-grisar. Alla immunceller, utom basofila och eosinofiler, med liknande låga nivåer i fullgångna smågrisar [34], ökade i antal från dag 8 till dag 19, vilket indikerar en förbättrad förmåga hos båda grupperna att montera ett tillräckligt immunsvar mot en potentiell patogen. De cirkulerande monocyt- och lymfocytnivåerna hos OPN-grisar på dag 8 var högre i förhållande till CON-grisar men inte på dag 19. Eftersom det kliniska tillståndet var likartat mellan grisar i båda grupperna och NEC-poäng låga, är monocyt- och lymfocytnivåerna troligen främst relaterade till behandling effekter och föreslår en accelererad immunutveckling hos OPN-grisar. En högre andel cirkulerande monocyter observerades också i en randomiserad kontrollerad studie av sex månader gamla spädbarn som fick modermjölksersättning med tillsatt bovin mjölk OPN i koncentrationer på 65 mg/L och 135 mg/L, jämfört med ammade kontroller [55]. OPN kan interagera med immunceller via sin receptor och fungera som ett kemotaktiskt medel för IL-1-aktiverade monocyter, vilket kan vara fysiologiskt relevant under inflammation [16]. OPN kan ytterligare spela en roll i medfödd immunitet genom att mediera fagocytos genom integrinreceptorn, ox 2, uttryckt på ytan av monocyter [16]. Ytterligare studier som undersöker OPN:s roll på monocytfunktionen och hur detta översätts till en fördel för spädbarn som fått formeln återstår att undersöka.
En T-cellsundergruppskarakterisering utfördes på dagarna 8 och 19 för att ytterligare beskriva lymfocytpopulationen men avslöjade inga skillnader i undergruppsfraktioner mellan de två grupperna under denna omedelbara neonatala period. Spädbarn som har fått modersmjölksersättning kompletterat med OPN(65 eller 130 mg/L), har visat en ökad andel T-celler under de första sex månaderna av livet jämfört med den basalersättning som matats [55]. Detta svar kanske inte utvecklas redan under de första levnadsveckorna, eller så kan den relativt höga nivån av OPN i vår basmjölk från nötkreatur (91 mg/L) begränsa ytterligare förändringar. Antalet T-celler, hjälpar-T-celler och cytotoxiska T-celler skilde sig inte mellan OPN och CON, och kan därför inte förklara skillnaderna i cirkulerande lymfocyter mellan de två grupperna på dag 8. I denna studie färgade vi för CD3, CD4, CD8 och Foxp3, och det återstår att undersöka om det högre antalet lymfocyter kan komma från ett högre B-cellantal eller ett ökat antal naturliga mördarceller. Systemisk immunitetsmognad efter födseln inkluderar en förändring i Th1/Th2-balansen, där försvaret mot bakteriella infektioner kräver en Th1-skevning [17]. OPN är en potent kemoattraktant med cytokinliknande egenskaper och är känd för att reglera Th1/Th2-balansen [18]. I den här studien modulerades inte Th1/Th2-balansen kort efter födseln av kosten som indikerades av ett liknande TNF-/IL10-förhållande på dag 8. Eftersom TNF-o-nivåer inte upptäcktes i ostimulerade plasmaprover från dag 19, var TNF-/IL10 förhållandet vid denna tidpunkt kunde inte beräknas. Nyligen har studier med djurmodeller [14,22,24] undersökt rollen av mjölk OPN i neuroutveckling under spädbarnsåldern. Med en OPN knockout-musmodell har mjölk med OPN-nivåer som liknar bröstmjölk visat sig förbättra utvecklingen av motorik och hippocampusberoende minnesförmåga hos 30-daggamla musungar jämfört med kontroller som saknar OPN i kosten. Dessa funktionella hjärnresultat av dietmjölkrelaterad OPN var kopplade till ökade endogena OPN-nivåer i hjärnan och en högre proliferation och differentiering av nerv/gliaantigen två celler till oligodendrocyter, vilket ledde till ett ökat uttryck av myelinrelaterade proteiner. I en liknande experimentell uppställning uppvisade vildtypsmusungar som ammades av OPN knockout-damer och fick extra bovin mjölk OPN (12 ug/g) en större minnesförmåga än icke-supplementerade kontroller [22]. Sammantaget indikerar dessa resultat att mjölk OPN spelar en viktig roll i neurokognitiv utveckling och att bovin mjölk OPN kan utöva sådana fördelaktiga effekter mellan arter. Vi fann liknande utveckling i förvärvet av grundläggande motoriska färdigheter, hemmaburaktivitet och utforskande beteende i öppen fältarenan mellan grupper. Gruppprestationer i det rumsliga T-labyrinttestet indikerade vidare liknande hippocampusberoende inlärning och minne och därmed kognitiva förmågor. Våra fynd är i enlighet med en nyligen genomförd studie som jämförde två dagar gamla terminsgrisar som fick en sojaproteinbaserad formeldiet som inte innehåller någon OPN eller kompletterad med 250 mg/L nötkreatursmjölk OPN [24]. Endast begränsade beteendeskillnader var uppenbara mellan de två grupperna som utvärderades under en ny objektigenkänningsuppgift utförd på postnatal dag 30. Detta innebär att åtminstone hos friska, slutfödda grisar, förbättrar inte OPN mjölktillskott ytterligare hjärnrelaterad utveckling mätt med ny objektigenkänning. I likhet med det spatiala T-labyrinttestet [44] anses den nya objektigenkänningsuppgiften vara hippocampusberoende, och därför kan dessa beteendetest vara känsligare närmare tidpunkten för maximal hippocampus tillväxthastighet, vilket i termiska han- och honsvin förekommer vid ungefär postnatal vecka 8 respektive 3 [56]. Det är inte känt om långsiktiga kognitiva förbättringar efter tillskott av mjölk OPN tidigt i livet, vilket visades i musmodellstudierna[14,22], kunde ha dokumenterats hos grisarna vid senare tidpunkter.
När det gäller strukturell hjärnutveckling, har det tidigare dokumenterats genom magnetisk resonanstomografi att kosttillskott av OPN ökade antalet regionala hjärnvolymer efter normalisering till de totala hjärnvolymerna [24]. I denna studie fann vi inga diet-inducerade skillnader i hjärnans regionala vikter, varken absoluta vikter eller i förhållande till de totala hjärnvikterna. Vi utförde därför inte mer djupgående analyser som att mäta genuttrycksnivåerna för myelinrelaterade proteiner, t.ex. myelinbasprotein och myelinassocierat glykoprotein [14,23]. Det har tidigare dokumenterats att exogen OPN har neuroprotektiva egenskaper genom att dämpa intracerebral blödning-inducerad neuroinflammation som leder till förbättrade neurologiska poäng [57I. Ytterligare forskning är motiverad för att undersöka om mjölk OPN kan ge fördelaktiga strukturella och funktionella effekter till hjärnan under systemiska inflammatoriska tillstånd, ofta upplevt av prematura spädbarn [26]. Detta låg utanför ramen för den aktuella studien.
5. Slutsatser
I en prematura grismodell av känsliga nyfödda spädbarn visade vi att en bioaktiv bovinmjölksdiet kompletterad med extra bovinmjölk OPN tolereras väl och inducerade mindre förbättringar i tarmstruktur och systemisk immunitet, utan ytterligare effekter på hjärnans strukturella eller funktionella utveckling. Tillskott med OPN utöver vad som erhålls från basal bovin mjölk, och därigenom nå nivåer i den övre fysiologiska delen av vad spädbarn naturligt får från bröstmjölk, kan därför ha begränsade effekter på tarm, immunitet och hjärnans utveckling hos känsliga nyfödda under den omedelbara neonatalperioden . Mer information om fördelarna med mjölk OPN-tillskott av nötmjölksbaserade modersmjölksersättningar för att stimulera utvecklingen av komprometterade nyfödda spädbarn återstår att fastställa.
