Modulering av signalvägen för arylkolvätereceptorns effekter på replikering av Junín-virus Del 2

3. Resultat och diskussion

3.1. AHR Pathway är överrepresenterad under JUNV-infektion

Levern är ett av huvudmålen under JUNV-infektion [22]. För att klargöra de molekylära mekanismerna som är involverade i en hepatocytinfektion genomförde vi en Affymetrix-mikroarray-screening för att bestämma de differentiellt uttryckta generna i leverhärledda humana HepG2-celler infekterade med JUNV IV4454 under 24 eller 48 timmar.

Vi använde programvaran Transcriptome Analysis Console från ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA för att utvärdera de differentiellt uttryckta generna i de JUNV-infekterade cellerna jämfört med kontrollen (Figur 1a, b). Totalt 266 och 313 differentiellt uttryckta gener detekterades vid 24 respektive 48 timmar pi (Figur 1a,b).

Affymetrix mikroarrayanalys (n=3 oberoende experiment per tillstånd). Värdgener som uppvisar minst en 1.6-faldig förändring i uttryck och en 95 procents sannolikhet att uttryckas differentiellt (p=0.05) övervägdes för vidare analys. Gener visade i rött var uppreglerade, gener visade i grönt var nedreglerade och gener i grått visade ingen förändring i uttryck jämfört med oinfekterade HepG2-celler. (b) Differentiellt uttryckta gener mellan mock-infekterade och JUNV-infekterade HepG2-celler vid 48 h pi. (c) Genontologi Analys av differentiellt uttryckta gener i JUNV-infekterade HepG2-celler vid 48 h pi. (d) Banöverrepresentationsanalys av JUNV-infekterade HepG2-celler jämfört med skeninfekterade celler som visar de viktigaste signalvägarna som påverkas under infektion. Den röda stapeln markerar AHR-vägen. Den streckade blå linjen indikerar p=0.05. p-värden bestämdes av programvaran WebGestalt (http://www.webgestalt.org, tillgänglig den 3 juli 2020).

Det finns ett nära samband mellan värdgener och immunitet. Värdgener bestämmer till stor del utvecklingen och funktionen hos en persons immunsystem och kan påverka en persons motståndskraft mot olika patogener.

Flera studier har visat att vissa genmutationer kan leda till obalanser i immunförsvaret. Till exempel kan vissa människor lida av sjukdomar där immunsystemet överreagerar, vilket får immunsystemet att attackera sina kroppsvävnader, såsom reumatoid, systemisk lupus erythematosus och andra sjukdomar. Dessutom är resistens mot patogener som bakterier, virus och parasiter också associerat med genetiska skillnader. Vissa människor föds med ett effektivare immunförsvar som rensar bort patogener snabbare och mer fullständigt.

Forskning om sambandet mellan värdgener och immunitet har gett oss en djupare förståelse för kroppens försvarsmekanismer och har även hjälpt oss att bättre förstå kroppens svar på olika sjukdomar. Detta har stor betydelse för förebyggande och behandling av sjukdomar.

Därför bör vi vara uppmärksamma på betydelsen av genetiska tester, och lära oss och förstå skillnaderna i mänskliga gener för att bättre skydda vårt immunförsvar, stärka vår kroppsbyggnad och bygga en stark kropp. Ur denna synvinkel måste vi förbättra vår immunitet. Cistanche kan förbättra immuniteten avsevärt, eftersom Cistanche är rik på en mängd olika antioxidantämnen, såsom vitamin C, vitamin C, karotenoider, etc. Dessa ingredienser kan rensa bort fria radikaler och minska oxidativ stress. Stimulera och förbättra immunsystemets motståndskraft.

Klicka cistanche tubulosa fördelar

För att ytterligare studera effekten av JUNV på det cellulära landskapet använde vi programvaran WebGestalt (http://www.webgestalt.org, tillgänglig den 3 juli 2020), som använder Wikipathways-databasen som ett arkiv för att utföra en Gene Ontology Analysis ( Figur 1c) och för att bestämma vilka signalvägar som förändrades differentiellt jämfört med kontroll (Figur Id).

När det gäller genontologianalysen från de differentiellt uttryckta generna drogs slutsatsen att JUNV-infektion påverkar uttrycket av gener relaterade till RNA-metabolism, värdkinaser och lipidmetabolism (Figur 1c). Det är värt att notera att dessa biologiska processer och molekylära funktioner har rapporterats vara inriktade på JUNV under dess replikeringscykel [23].

Dessutom visade Pathway Overrepresentation Analysis att JUNV-infektion berikar AHR-signalvägen vid 48 h pi (Figur 1d) bland många andra vägar (p < 0.05). Särskilt upptäckte vi ett ökat uttryck av AHR-målgenen CYP1B1, vilket bevisar en ökad aktivitet av AHR-vägen.

Under de senaste åren har flera studier visat vikten av AHR som ett terapeutiskt mål under olika patologiska scenarier; sålunda har en mängd olika små föreningar utvecklats för att modulera dess aktivitet. Vi bestämde oss för att ytterligare studera effekten av AHR-modulering under in vitro JUNV-infektion.

3.2. Farmakologisk modulering av AHR påverkar viral replikation

För att klargöra vilken roll AHR spelar vid JUNV-infektioner, bestämde vi oss för att testa effekterna av kända AHR-ligander CH223191 (antagonist) och kynurenin (agonist) på in vitro-infektioner med två olika JUNV-försvagade stammar: IV4454 och Candid#1. Behandlingar och infektioner utfördes med Huh-7- och Vero-celler. Eftersom denna sista cellinje inte kan uttrycka och utsöndra interferon typ I (IFN-I), tillåter dess användning att bestämma betydelsen av IFN-I-uttryck i det potentiella AHR-medierade värd-virus-samspelet.

För det första utvärderades cytotoxiciteten för olika koncentrationer av både CH223291 och kynurenin via MTT-analys (Figur 2a, b) och optiska mikroskopiobservationer (Figur 2c, d).

Beträffande CH223191 detekterades en minskning av cellviabiliteten och morfologiska förändringar associerade med cytotoxiska effekter endast vid koncentrationer av 80 µM (Figur 2a,c). Å andra sidan inducerade kynurenin inte cytotoxiska effekter vid någon testad koncentration (Figur 2b,d).

För att undersöka effekten av AHR farmakologisk modulering under JUNV-infektion behandlades cellkulturer med vehikel (DMSO), CH223191 eller kynurenin och infekterades sedan med JUNV i 48 timmar för att bestämma viralt utbyte. Kortfattat, Vero- och Huh-7-celler vehikelbehandlades eller behandlades med olika koncentrationer av den lilla molekylen CH223191 (2,5, 5 µM, 10 µM och 20 µM) eller kynurenin (5 µM, 10 µM, 20 µM och 40 µM) före och efter JUNV-infektion med IV4454 och Candid#1 vid en MOI på 0,5. Efter 48 timmar skördades supernatanterna och användes för att infektera Vero-celler för PFU-analysen (Figur 3).

AHR-blockaden minskade signifikant produktionen av virala partiklar på ett dos-respons sätt, även med den lägsta koncentrationen av CH223191 som testades. Viktigt är att detta resultat observerades inte bara med användning av båda JUNV-försvagade stammar utan också i båda infekterade cellinjer (Vero och Huh7). CH223191-behandlingen av JUNV-infekterade Vero- och Huh-7-celler minskade antalet virala plack med 93 procent respektive 97 procent (Figur 3a,b). Dessa resultat tyder starkt på att AHR-signalvägen är en viktig cellulär faktor under JUNV-infektion (Figur 3a, b). Å andra sidan ändrade kynurenin-administreringen före och efter JUNV-ympning inte signifikant den erhållna virala titern i jämförelse med viral kontroll (Figur 3c, d).

Sammantaget visade resultaten för första gången att AHR är en viktig cellulär faktor under JUNV in vitro-infektion, vilket innebär en pro-viral roll genom att underlätta den virala replikationscykeln.

3.3. AHR-modulering har en inverkan på JUNV-proteinuttryck

För att ytterligare studera effekterna av AHR-modulering på JUNV-infektion genomförde vi en indirekt immunfluorescensanalys. JUNV NP-proteinet är det mest förekommande strukturella och funktionella proteinet inom Arenaviridae-familjen. Således valdes NP som ett intressant färgningsmål med tanke på att endast ett fåtal studier rapporterade NP-uttrycksmönstret för olika JUNV-försvagade stammar. Vårt första steg var att bestämma NP-fördelningen av båda JUNV-stammarna i våra cellulära modeller för att jämföra tillåtelsen för de olika cellinjerna och den virala spridningen av båda försvagade stammarna i dessa cellkulturer (Figur 4).

NP-lokaliseringen var uteslutande cytoplasmisk och uppvisade ett homogent ackumuleringsmönster med stora punkter, liknande för båda stammarna i Vero- och Huh-7-cellinjer (Figur 4).

Därefter utvärderade vi genom immunfluorescens effekten av den farmakologiska moduleringen av AHR på NP-uttryck i JUNV-infekterade cellkulturer.

I korthet såddes celler över täckglas, förbehandlades med antingen vehikel (DMSOCH223191 (10 uM) eller kynurenin (40 uM), och sedan skeninfekterade eller JUNV-infekterade i 48 timmar. Därefter fixerades cellerna och bearbetades genom en immunfluorescens analys (Figur 5).

CH223191-administrationen minskade anmärkningsvärt antalet NP-positiva celler i båda cellkulturerna och för båda JUNV-stammarna (Figur 5). Dessa observationer korrelerar med tidigare resultat som visas i figur 3a,b. AHR-blockaden minskade inte bara andelen JUNV-infekterade celler utan också storleken på virala foci. Vero-cellkulturer förbehandlade med CH223191 och infekterade med antingen IV4454 eller Candid#1 visade en 57,14 procent (SD ± 7,98) respektive 41,17 procent (SD ± 9,05) minskning av focistorlek. Dessutom visade Huh-7 cellkulturer förbehandlade med antagonisten och infekterade med antingen IV4454 eller Candid#1 en 28,57 procent (SD ± 8,70) respektive 12,50 procent (SD ± 9,30) minskning av focistorlek. Å andra sidan observerades det att behandlingen med kynurenin inte förändrade andelen NP-positiva celler (Figur 5) eller focistorlek (ej visad), jämfört med obehandlade infekterade celler.

Dessutom visade en mer detaljerad mikroskopisk inspektion att virala foci var större i infekterade Vero-cellkulturer jämfört med Huh-7-infekterade cellkulturer. Vi observerade att medeltalet av JUNV-infekterade Vero-celler per foci bestod av 35 celler, medan genomsnittet av JUNV-infekterade Huh-7-celler per foci bestod av 6 celler. Denna förväntade observation är i linje med den begränsade virala miljön som IFN-kompetenta celler påförde JUNV multiplikation [24].

3.4. AHR-dämpning minskar JUNV-virusnivåer

Slutligen, för att utvärdera om en AHR-blockad påverkar JUNV RNA-nivåerna, behandlades Vero- och Huh-7-celler med antingen vehikel, CH223191 (10 µM) eller kynurenin (40 µM), och sedan sken- eller JUNV-infekterades för 48 h. Efteråt skördades cellmonoskikten och bearbetades för RT-qPCR för att övervaka ahr-, cyp1a1- och np-RNA-nivåer (Figur 6).

Det observerades att CH223191-behandlade och JUNV-infekterade celler uppvisade en trend mot lägre ahr-mRNA-nivåer jämfört med vehikelbehandlade JUNV-infekterade prover (Figur 6a,b). Omvänt visade administreringen av kynurenin en trend mot en förbättring av ahr-mRNA-nivåerna i JUNV-infekterade celler jämfört med vehikelbehandlade JUNV-infekterade prover (Figur 6a, b). I linje med dessa resultat visade behandling med CH223191 en trend mot en minskning av cyp1a1-mRNA-nivåer i Huh-7-celler, medan behandling med kynurenin visade motsatta effekter (Figur 6c). När det gäller JUNV RNA-nivån observerades det att behandlingen med AHR-antagonisten CH223191 minskade virala RNA-nivåer i infekterade celler jämfört med vehikelbehandlade JUNV-infekterade prover, medan kynureninbehandlade och JUNV-infekterade celler tenderade att öka den virala RNA-nivåer (Figur 6d, e).

I detta arbete visade vi för första gången att in vitro JUNV-infektion inducerar aktiveringen av AHR-signalvägen i leverhärledda cellkulturer. Mikroarrayanalysdata visade att AHR-signalvägen är överuttryckt i JUNV-infekterade cellkulturer vid 48 h pi.

Flera studier rapporterade att AHR-aktivering kan ha en mängd olika effekter på cellfysiologi, vilket påverkar proliferation och medfödda immunsvar [6,25]. Faktum är att under det senaste decenniet har AHR-aktivering beskrivits som att ha IFN-modulerande aktivitetsutövande effekter på cytokinutsöndring [26,27]. Viktigt är att AHR-uppregleringssignalering kan minska IFN-I antivirala immunsvar [28]. Angående detta utvärderade vi effekten av AHR-signaleringsvägmoduleringen på icke-kompetenta och kompetenta IFN-cellkulturer, såsom Vero och Huh-7 cellulära modeller, med användning av AHR-antagonist- och agonist-små kommersiella molekyler under in vitro JUNV-infektion med två olika försvagade stammar.

Genom olika tillvägagångssätt bekräftades det att AHR-negativ modulering via farmakologisk hämning med CH223191 hade antiviral aktivitet mot JUNV. Efter AHR-blockaden konstaterades JUNV in vitro-infektion hämmad. En viktig minskning av viralt proteinuttryck observerades i JUNV-infekterade cellkulturer behandlade med AHR-antagonisten. Dessutom minskade AHR-blockaden den extracellulära infektiösa virala partikelproduktionen av både försvagade IV4454- och Candid#1-stammar av JUNV som studerats i detta arbete. Dessutom observerades en trend mot en minskning av virala RNA-nivåer i CH223191-behandlade celler. Intressant nog observerades dessa fynd i både Huh-7- och Vero-cellinjer och visade en likvärdig storleksordning, vilket tyder på att AHR-provirala rollen under JUNV-infektion kan vara oberoende av IFN-I-signalvägen. Dessa resultat är i linje med våra tidigare observationer i andra virala modeller [13]. Fler studier kommer att behövas för att klargöra vilket steg i JUNV-replikeringscykeln som påverkas av AHR-blockaden.

Studier som visar AHR-aktivering av antropogena ligander har fått särskilt intresse på grund av den växande medvetenheten som involverar felaktig miljöexploatering och dess samspel med virusinfektionens svårighetsgrad [2]. Observera att habitatområdet som täcks av JUNV vektorgnagare omfattar ett stort territorium; Men för närvarande påverkar hushållsfolie bara en begränsad och begränsad region där huvudsakligen landsbygdsverksamhet bedrivs [29]. Dessutom är jordbruksarbetare den största befolkningen som riskerar att drabbas av allvarliga manifestationer under AHF-sjukdomen. Vårt nuvarande arbete tyder på att exponering av gnagare/människor för AHR-agonister kan ha en inverkan på resultatet av JUNV-infektion.

Även om intensiva ansträngningar under de senaste decennierna har ägnats åt antiviral forskning mot arenavirus [30], finns för närvarande ingen specifik antiviral kemoterapi tillgänglig för behandling av AHF och mänskliga sjukdomar orsakade av andra patogena medlemmar av Arenaviridae. I synnerhet är Lassa-viruset (LASV) medlet för Lassa-feber (LF), som utgör ett allvarligt mänskligt hot i regioner i Västafrika med en mycket hög dödlighet [31]. För närvarande är den enda alternativa behandlingen mot LF den off-label användningen av guanosinanalogen ribavirin, som har visat sig vara delvis effektiv hos LF-patienter endast om dess administrering påbörjas inom 6 dagar efter symtomdebut [32,33]. Dessutom kan ribavirin inducera negativa biverkningar, vilket begränsar rekommendationen av dess administrering endast till patienter med hög risk. Sedan finns det en verklig efterfrågan på nya effektiva antivirala medel för behandling av arenavirus hemorragiska feber. AHR representerar ett nytt värdmål att överväga. Det finns faktiskt flera pågående kliniska prövningar som involverar AHR-hämmare (BAY2416964, IK-175 och HP163) vid behandling av olika cancerformer. Ändå är dessa prövningar i ett tidigt skede och ingen fokuserar på den antivirala potentialen hos AHR farmakologisk målinriktning. Märkbart har läkemedel riktade mot cellfaktorer som krävs i virusmultiplikationscykeln återfått intresset för antiviral utveckling givet chansen att erhålla en bredspektrumhämmare som påverkar ett värdmål som är gemensamt för flera mänskliga patogener [34,35], en egenskap associerad med AHR.

Sammanfattningsvis belyser de kombinerade resultaten av denna studie relevansen av AHR-signaleringsvägmodulering som ett potentiellt terapeutiskt mål mot JUNV. Framtida studier kommer att behövas för att implementera AHR-inriktningsterapier för att övervinna viktiga utmaningar, såsom leverans av AHR-ligander till önskade vävnader och celler för att minimera möjliga AHR-modulationseffekter utanför målet.

Författarbidrag:

Konceptualisering, CCG; metodik, MAP, AEADL och ABM; mjukvara, FG; validering, MAP och FG; formell analys, MAP och MFT; utredning, MAP och MFT; resurser, EBD och CCG; datakurering, FG; skrivning—förberedelse av originalutkast, MAP och MFT; skriva – granskning och redigering, EBD och CCG; övervakning, CCG; projektadministration, CCG; finansieringsförvärv, EBD och CCG Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:

Detta arbete finansierades av Universidad de Buenos Aires (UBA) (bidragsnummer 20020170100363BA) och Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (bidragsnummer PIP11220170100171CO). EBD och CCG är medlemmar i forskarkarriären från CONICET; MFT, AEADL och ABM är stipendiater från CONICET. MAP är en stipendiat från UBA.

Uttalande av institutionell granskningsnämnd:

Inte tillämpbar.

Informerat samtycke:

Inte tillämpbar.

Datatillgänglighetsförklaring:

Data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

Erkännanden:

Vi tackar alla medlemmar i de inblandade laboratorierna för användbara råd och diskussioner.

Intressekonflikt:

Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analyser eller tolkning av data; i skrivningen av manuskriptet; eller i beslutet att publicera resultaten.

Referenser

1. Huvud, JL; Lawrence, BP Arylkolvätereceptorn är en modulator av antiviral immunitet. Biochem. Pharmacol. 2009, 77, 642–653. [PubMed]

2. Torti, MF; Giovannoni, F.; Quintana, FJ; García, CC Arylkolvätereceptorn som en modulator av antiviral immunitet. Främre. Immunol. 2021, 12, 624293. [PubMed]

3. Shinde, R.; McGaha, TL Aryl-kolvätereceptorn: kopplar immunitet till mikromiljön. Trender Immunol. 2018, 39, 1005–1020. [PubMed]

4. Stockinger, B.; Hirota, K.; Duarte, J.; Veldhoen, M. Externa influenser på immunsystemet via aktivering av arylkolvätereceptorn. Semin. Immunol. 2011, 23, 99–105.

5. Rothhammer, V.; Borucki, DM; Tjon, EC; Takenaka, MC; Chao, CC; Ardura-Fabregat, A.; de Lima, KA; Gutiérrez-Vázquez, C.; Hewson, P.; Staszewski, O.; et al. Mikroglial kontroll av astrocyter som svar på mikrobiella metaboliter. Naturen 2018, 557, 724–728. [CrossRef]

6. Quintana, FJ; Basso, AS; Iglesias, AH; Korn, T.; Farez, MF; Bettelli, E.; Caccamo, M.; Oukka, M.; Weiner, HL Kontroll av Treg- och TH17-celldifferentiering av arylkolvätereceptorn. Naturen 2008, 453, 65–71. [CrossRef]

7. Marshall, NB; Kerkvliet, NI Dioxin och immunreglering: framväxande roll för arylkolvätereceptorn i genereringen av regulatoriska T-celler. Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1183, 25–37.

8. Vogel, CFA; Khan, EM; Leung, PSC; Gershwin, ME; Chang, WLW; Wu, D.; Haarmann-Stemmann, T.; Hoffmann, A.; Denison, MS Cross-Talk mellan arylkolvätereceptorn och det inflammatoriska svaret: A Role for Nuclear Factor-KB. J. Biol. Chem. 2014, 289, 1866–1875. [CrossRef]

9. Bankoti, J.; Rase, B.; Simones, T.; Shepherd, DM Funktionella och fenotypiska effekter av AhR-aktivering i inflammatoriska dendritiska celler. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010, 246, 18–28. [CrossRef]

10. Vogel, CFA; Goth, SR; Dong, B.; Pessah, IN; Matsumura, F. Aryl-kolvätereceptorsignalering medierar uttryck av indolamin 2,3-dioxygenas. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 375, 331–335. [CrossRef]

11. Jin, GB; Moore, AJ; Head, JL; Neumiller, JJ; Lawrence, BP Aryl-kolvätereceptoraktivering minskar dendritiska cellfunktionen under influensavirusinfektion. Toxicol. Sci. 2010, 116, 514–522. [CrossRef]

12. Giovannoni, F.; Bosch, I.; Polonio, CM; Torti, MF; Wheeler, MA; Li, Z.; Romorini, L.; Rodriguez Varela, MS; Rothhammer, V.; Barroso, A.; et al. AHR är en Zika-virusvärdfaktor och ett kandidatmål för antiviral terapi. Nat. Neurosci. 2020, 23, 939–951. [CrossRef]

13. Giovannoni, F.; Li, Z.; Remes-Lenicov, F.; Dávola, ME; Elizalde, M.; Paletta, A.; Ashkar, AA; Mossman, KL; Dugour, AV; Figueroa, JM; et al. AHR-signalering induceras av infektion med coronavirus. Nat. Commun. 2021, 12, 5148. [CrossRef]

14. Buchmeier, MJ; de La Torre, JC; Peters, CJ Arenaviridae: Virusen och deras replikation. In Fields Virology, 4:e upplagan; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, USA, 2013; s. 1283–1303.

15. Enria, DA; Briggiler, AM; Sánchez, Z. Behandling av argentinsk hemorragisk feber. Antivir. Res. 2008, 78, 132–139. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com