Molekylär kloning och biokemisk karakterisering av ett nytt kumaringlykosyltransferas CtUGT1 från Cistanche Tubulosa

för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

ABSTRAKT

UDP-glykosyltransferaser (UGT) är en viktig och funktionellt mångfaldig familj av enzymer involverade i sekundär metabolitbiosyntes. Kumarin är ett av de vanligaste skeletten av naturliga produkter med farmakologiska kandidataktiviteter. Men hittills har många rapporterade GT från växter huvudsakligen erkänt flavonoider som sockeracceptorer. Endast begränsade GT kunde katalysera glykosyleringen av kumariner. I denna studie klonades en ny UGT frånCistanche tubulosa, en värdefull traditionell kinesisk ört som är rik på olika glykosider som fenyletanoidglykosider, lignanglykosider och iridoidglykosider. Sekvensjustering och fylogenetisk analys visade detCtUGT1är fylogenetiskt avlägsen från de flesta av de rapporterade flavonoid-UGT och intill fenylpropanoid-UGT. Omfattande in vitro enzymanalyser fann att även omCtUGT1var inte involverade i biosyntesen av bioaktiva glykosider iCistanche tubulosa, skulle det kunna katalysera glukosyleringen av kumarinumbelliferon 1, esculetin 2 och hymecromone 3 i betydande utbyte. De glykosylerade produkterna identifierades genom jämförelse med referensstandarderna eller NMR-spektroskopi, och resultaten indikerade attCtUGT1kan regionspecifikt katalysera glukosyleringen av hydroxylkumariner vid C7- OH-positionen. Nyckelresterna som avgjordeCtUGT1's aktivitet diskuterades vidare baserat på homologimodellering och molekylära dockningsanalyser. Kombinerat med platsriktade mutagenesresultat fann man att H19 spelade en oersättlig roll som den avgörande katalysbasen.CtUGT1skulle kunna användas vid den enzymatiska framställningen av bioaktiva kumaringlykosider.

Nyckelord:Växtglykosyltransferaser, kumaringlykosider,Cistanche tubulosa, Homologimodellering, Platsstyrd mutagenes

Klicka för att cistanche extrahera fördelar produkter

Introduktion

Glykosylering är en av de vanligaste strukturmodifieringstyperna av sekundära naturprodukter. Glykosylering kan förändra stabiliteten och/eller lösligheten hos aglykonet och bidra mycket till mångfalden av naturliga/onaturliga produkter på grund av de många konjugationstyperna. I växter utfördes dessa reaktioner vanligtvis av uridindifosfat (UDP)-beroende glykosyltransferaser (UGT), ett slags enzymer som katalyserar överföringen av monosackariddelar från aktiverat nukleotidsocker till en glykosylacceptormolekyl som kan vara en kolhydrat, glykosackarid, oligosackarid, , eller en polysackarid [1,2]

Hittills har många gener som kodar för UGT isolerats från flera växter [3]. Glykosyleringen skedde huvudsakligen vid hydroxylgrupper eller karboxylgrupper av ett brett spektrum av sekundära produkter, såsom flavonoider [4], fenylpropanoider [5], terpenoider [6], steroider [7], alkaloider [8] och så vidare. Kumariner är fenylpropanoider som är brett spridda i många växtarter. Naturligt förekommande kumariner finns ofta som glykokonjugat, och dessa derivat uppvisade ett brett spektrum av farmakologiska aktiviteter, inklusive antioxidanter [9], antivirala [10,11], leverskyddande [12], antiinflammatoriska [13], anti-cancer [14] ], antimutagena [15] och kolinesteras (ChE) & monoaminoxidas (MAO)-hämmande aktiviteter [14,15], etc. Hittills har dock endast begränsade UGT varit i jämförelse med de mest frekvent rapporterade och omfattande undersökta flavonoidernas UGT. rapporterats kunna överföra sockerdelen till kumariner [16–18].

Växter rika på olika glykosider skulle kunna fungera som en ideal genpool av UGT med nya katalysaktiviteter. Dessutom har många UGT rapporterats ha avsevärd acceptorpromiskuitet för att katalysera glykosyleringen av flera substrat, av vilka några till och med inte separerades i växterna [19]. I den här artikeln, ett nytt glykosyltransferasCtUGT1identifierades frånCistanche tubulosa, en traditionell medicinsk ört som är riklig med olika glykosider som fenyletanoidglykosider (PhGs), lignanglykosider och iridoidglykosider. Heterolog expression och funktionskarakterisering visade att även om rekombinantCtUGT1var inte involverad i biosyntesen av dessa glykosider iCistanche tubulosa, det kan katalysera glukosyleringen av hydroxylkumariner, och reaktionen skedde regionspecifikt på 7- OH-positionen för kumarinumbelliferon 1, eskalerande 2, och hymekromon 3 för att producera tre farmakologiskt aktiva föreningar skummande (1a), cichoriin (2a) respektive 4-metylumbelliferylglukosid (3a) med avsevärt utbyte. Dessutom kan bensofenonsubstrat 4,4'-dihydroxibensofenon (4), isoflavonsubstrat genistein (5) och antrakinonsubstrat aloe-emodin (6) också accepteras avCtUGT1. De katalytiska egenskaperna och nyckelrester som understryker katalysförmågan hosCtUGT1utvärderades också baserat på homologimodellering, AutoDock-analys och platsriktad mutagenes.

2. Experimentell

2.1. Växtmaterial och kemikalier

Cistanche tubulosasom användes i denna studie samlades in från ökenområden i Hetian, Xinjiang autonoma regioner. Deras botaniska identitet bekräftades av professor Pengfei Tu vid Pekings universitet. De testade kumarinerna och andra substrat i denna studie köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina) och Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Kina) ) om inget annat anges. Referensstandarder för skumning (la) och cikoriin (2a) köptes från Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Kina).

2.2. Molekylär kloning av CtUGT1 från Cistanche tubulosa

Det totala RNA avCistanche tubulosaextraherades från den köttiga stammen med användning av ett OMEGA Plant RNA Kit (GA, USA) och omvänt transkriberades till cDNA med PrimeScript™ RT reagenskit (TaKaRa, Japan) enligt tillverkarens instruktioner. En degenererad primer designades för 3'RACE baserat på aminosyrasekvenserna i den konserverade PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases)-lådan av växtglykosyltransferaser. 3′-ändens och 5′-ändens förstärkningar avCtUGT1utfördes med Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA) enligt tillverkarens protokoll med användning av primers (tabell S1). Fullängds-cDNA förCtUGT1amplifierades med PCR med användning av KOD-Plus Neo DNA-polymeras (TOYOBO, Japan) med genspecifika primerpar (tabell S1) under följande förhållanden: ett initialt denatureringssteg vid 94 ◦C i 2 minuter, följt av 35 cykler av denaturering vid 98 ◦C i 15 s, glödgning vid 55 ◦C i 30 s och förlängning vid 68 ◦C i 55 s, med ett sista förlängningssteg vid 68 ◦C i 7 min. Alla erhållna DNA-fragment klonades in i en pEASY-Blunt-vektor (TransGen Biotech, Kina) och sekvenserades.

2.3. Sekvensanpassning och fylogenetisk analys

Sekvensjustering avCtUGT1med rapporterade glykosyltransferaser (tabell S2) utfördes med DNAMAN 4.0 mjukvarupaket (Lynnon Biosoft, Kanada). Motiven och domänerna analyserades med hjälp av ett bevarat domänverktyg (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). Det fylogenetiska trädet konstruerades genom att bootstrappa MEGA 7.0.14-programvaran med användning av grannsammanfogningsmetoden med 1000 bootstrap-replikat [20]. Den översatta proteinsekvensen avCtUGT1var i linje med de kända växtglykosyltransferaserna deponerade i NCBI GenBank-databasen (tabell S3) med ClustalW.

2.4. Heterologt uttryck och proteinrening av CtUGT1 i Escherichia coli

Den kodande regionen avCtUGT1amplifierades med BamHI och Not I som restriktionsställen med användning av primrar som visas i tabell S1. PCR-reaktioner utfördes med användning av KOD-Plus-Neo DNA-polymeras (TOYOBO, Osaka, Japan). De erhållna sekvenserna verifierades genom kloning in i pEASY-Blunt-vektorn (TransGen Biotech, Kina). Den bekräftade amplifieringsprodukten avCtUGT1spjälkades därefter och subklonades in i expressionsvektorn pET-28a(plus) (Novagen, USA). Den verifierade konstruktionen transformerades sedan till E. coli Transetta (DE3) för att erhålla den rekombinanta stammen. Odling över natten av rekombinant stam inokulerades i Luria-Bertani (LB) medium innehållande 50 ug⋅mL−1 kanamycin och 40 ug⋅mL−1 klormycetin i ett förhållande av 1:1{{ 19}}0. Kulturerna odlades vid 37 ◦C, 200 rpm tills OD600-värdet nådde 0,4–0,6. Isopropyl- -D-tiogalaktopyranosid (IPTG) tillsattes därefter till en slutkoncentration på 0,5 mM och cellerna odlades i 16 timmar vid 18 ◦C, 180 rpm. Sedan skördades cellpellets genom centrifugering (7600 xg, 10 min, 4 ◦C) och återsuspenderades i 3 ml/g kyld lyseringsbuffert (kompletterande data anmärkning 1), och avbröts genom sonikering på is. Cellskräpet avlägsnades genom centrifugering vid 7600 xg, 4 ◦C under cirka 30 minuter. En för-ekvilibrerad Histrap-kolonn (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) användes för affinitetskromatografi enligt tillverkarens instruktioner. Det rekombinanta proteinet eluerades med 10 kolonnvolymer av elueringsbuffert (kompletterande dataanteckning 1) innehållande 250 mM imidazol. Proteinrenheten analyserades med 10 procent SDS-PAGE. Det renade proteinet koncentrerades av ett 30 kDa ultrafiltreringsrör (Sigma-Aldrich, USA) och avsaltades med användning av en PD-10-kolonn (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) med avsaltningsbuffert (kompletterande datanot 1). Proteinkoncentrationen bestämdes genom Bradford-metoden med användning av BSA som standard.

2.5. Enzymatisk aktivitetsanalyser och substratspecificitet för CtUGT1

För att undersöka glykosyleringsaktiviteten avCtUGT1, utfördes enzymanalyser i en reaktionsblandning (150 μL) bestående av 0,4 mM aglykon, 0,8 mM UDP-glukos (UDPG) och 50 ug renatCtUGT1protein i avsaltningsbufferten. Alla reaktioner inkuberades vid 30 ◦C i 12 timmar och avslutades genom att tillsätta 300 μL kall metanol. Blandningarna centrifugerades vid 15,000 xg under 30 minuter för att samla upp supernatanten för HPLC-UV/ESI-MS-analyser. Tre parallella analyser utfördes rutinmässigt för varje reaktion. HPLC (Agilent 1260, USA) var utrustad med en diod array-detektor och en CAPCELL PAK C18-kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan) vid en flödeshastighet av 1 mL⋅min−1, och kolonntemperaturen hölls vid 30 ◦C. Den mobila fasen bestod av A (dvs 0,1 procent vattenhaltig myrsyralösning) och B (dvs acetonitril). Gradientprogrammen listades i Tabell S4. HRESI-MS-data registrerades på ett LCMS-IT-TOF-system, utrustat med ett ESI-gränssnitt (Shimadzu, Kyoto, Japan) med ultrahög renhet He som kollisionsgas och N2 som nebuliserande gas. De optimerade ESI-källparametrarna var som följer: mantelgasflödeshastighet, 1,5 mL⋅min−1; hjälpgasflöde, 1,5 mL⋅min− 1; sprayspänning, 4,5 kV; kapillärtemperatur, 200 ◦C. Spektran registrerades i intervallet 100–1500 m/z för en full scan MS-analys.

2.6. Effekter av reaktionstid, pH-värde och temperatur på enzymaktivitet och kinetiska studier av CtUGT1

Effekter av reaktionstid, pH-värde och temperatur på enzymaktiviteten hosCtUGT1testades med användning av UDPG som sockerdonator och 3 som sockeracceptor under reaktionsbetingelserna som beskrivits ovan. För bestämning av optimalt pH jämfördes enzymaktiviteten i 100 mM buffert (citronsyra-natriumcitrat) med pH-värden från 3.0 till 6.{{ 14}}, 10{{20}} mM buffert (KH2PO4-K2HPO4) med pH-värden från 6.0 till 8.{{29} }, 100 mM buffert (Tris-HCl) med pH-värden från 7,0 till 9,0, 100 mM buffert (Na2CO3-NaHCO3) med pH-värden från 9,0 till 11,0. För att analysera den optimala reaktionstemperaturen inkuberades reaktionerna vid olika temperaturer från 0 till 65 ◦C. Tidsförloppen för reaktionen utvärderades vid 12 olika tidpunkter mellan 0 och 24 timmar. Alla experiment utfördes i tre exemplar. Reaktionsblandningarna analyserades med HPLC-MS såsom beskrivits ovan. För kinetiska studier avCtUGT1, utfördes enzymatiska analyser i en slutlig volym på 100 μL innehållande 100 mM KH2PO4-K2HPO4-buffert (pH 8,0), 25 ug renadCtUGT1, 3 mM UDPG och varierande koncentrationer (50–3000 μM) av 3. Reaktionerna utfördes vid 37 ◦C i 30 minuter och avslutades sedan med 100 μL iskall metanol. Alla dessa reaktioner utfördes i tre exemplar, och enzymaktiviteten utvärderades via kvantifiering av motsvarande glukosylerade derivat. Kinetiska parametrar, inklusive Michaelis-Menten-konstanten (Km) och Vmax, beräknades genom olinjär regressionsanalys med hjälp av programvaran GraphPad Prism 5.

2.7. Substrat- och sockerdonatorselektivitet för CtUGT1

Att utforska substratpreferenserna förCtUGT1totalt 27 substrat som tillhörde olika strukturella typer testades med UDPG som donator. Deras kemiska information listades i Tabell S5, och deras strukturer visades i Fig. S1 och S2. För att undersöka sockerdonatorernas selektivitetCtUGT1, utfördes analyser med användning av umbelliferon (1), esculetin (2), hymekromon (3), 4,4'-dihydroxibensofenon (4), genistein (5) och aloe-emodin (6) som substrat med UDPG, UDP- N-acetylgalaktosamin, UDP-galaktos, GDP-mannos, GDP-fukos, UDP-galakturonsyra, UDP-ramnos som sockerdonatorer. Alla experiment utfördes i tre exemplar. Reaktionsblandningarna analyserades med HPLC-MS såsom beskrivits ovan.

2.8. Framställning av 4-metylumbelliferylglukosid (förening 3a) med CtUGT1

Den preparativa reaktionsblandningen bestod av {{0}}.034 mmol substratförening 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg renadCtUGT1i 50 ml reaktionsbuffert. Reaktionerna omrördes försiktigt vid de optimala betingelserna (100 mM KH2PO4-K2HPO4 med pH 8,0; 37 ◦C). Efter inkubation vid 37 ◦C i 24 timmar separerades reaktionssupernatanten genom kolonnkromatografi med makroporöst harts (MCI GEL CHP) efter centrifugering vid 12,000 xg i 30 minuter. Den mobila fasen var en gradienteluering av 100 procent vatten till 100 procent metanol. Varje fraktion analyserades med HPLC-UV. Fraktioner som endast innehöll målprodukter indunstades till torrhet under reducerat tryck och karakteriserades av 1H kärnmagnetisk resonans (NMR)-spektroskopi och 13C NMR-spektroskopi.

2.9. Molekylär dockning och platsriktad mutagenes av CtUGT1

Proteinmodellen avCtUGT1etablerades med hjälp av SWISS-MODEL [21–25]. Kristallstrukturen för Medicago truncatula glykosyltransferas UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) valdes som mallstruktur [26]. Den etablerade modellen utvärderades av VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina användes för molekylära dockningsstudier [29]. Kristallstrukturen av UGT74F2 [30], ett glykosyltransferas från Arabidopsis thaliana, i komplex med ligand UDP och salicylsyra (PDB ID 5U6M) användes som kontrollstruktur för sockerdonatorficka respektive sockeracceptorfickaanalys . Auto-Dock-Tools 1.5.6 från MGLTools (Molecular Graphics Laboratory Tools) användes för att förbereda sockerdonatorn UDPG och substrat 1, 2 för molekylär dockning. Sidokedjorna av rester runt håligheten på det aktiva stället ställdes flexibla och de roterbara bindningarna av ligander lämnades fria att rotera. Den högst rankade poseringen bedömd av Vina-dockningsmodellen med den högsta (kcat/mol) affiniteten utsattes för visuell analys med PyMOL 2.0-programvara.

För mutagenesundersökningar, den sekvensoptimerade genen avCtUGT1(Kompletterande data not 2) syntetiserades och testades som vildtypen. Platsstyrd mutagenes avCtUGT1genomfördes med användning av Fast Mutagenesis System (TransGen Biotech). Mutanterna amplifierades från mallen för den optimerade genen som har konstruerats till pET -28en vektor med användning av de specifika primrarna som visas i Tabell S1. De konstruerade mutanterna verifierades genom PCR och sekvensering innan de transformerades till E. coli (DE3) för heterologt uttryck. Proteinrening och enzymreaktioner utfördes och analyserades såsom beskrivits ovan.

3. Resultat och diskussion

3.1. Fullängds cDNA-kloning av CtUGT1-genen frånCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) är en traditionell kinesisk medicinsk ört som producerar en mängd olika bioaktiva naturliga glykosider. Det borde finnas ett stort antal nya glykosyltransferasgener som fanns i dess genom. För att söka nya glykosyltransferaser med intressanta katalysaktiviteter designades en degenererad primer för 3'-RACE baserat på det konserverade PSPG-motivet för att klona tillåtande UGT frånCistanche tubulosa. Den erhållna 3'-ändsekvensen analyserades ytterligare med NCBI-blast och den specifika primern för 5'-RACE designades baserat på den erhållna sekvensen. De amplifierade 5′ cDNA-ändarna och 3′ cDNA-ändarna splitsades och fullängden avCtUGT1sekvens, inklusive 1739 nukleotider, erhölls (Fig. S3) och listades i tilläggsdatanot 3. Därefter, en öppen läsram (ORF) avCtUGT1hittades av NCBI ORF Finder-verktyg och den 1482 bp kodande sekvensen klonades framgångsrikt genom RT-PCR-amplifiering med användning av specifika primrar i Tabell S1. cDNA-sekvensen för CtUGT1 har skickats till NCBI (accessionsnummer MW629113).

3.2. Sekvensanalys och heterologt uttryck av CtUGT1

DeCtUGT1genen förväntades koda för ett protein med 493 aminosyrarester med en uppskattad molekylmassa på 55,78 kDa. NCBI blast avslöjade att den härledda proteinsekvensen avCtUGT1delar den högsta identiteten (76,39 procent) med UGT86A1-liknande enzymer. De biokemiska funktionerna hos denna typ av enzym har inte helt karakteriserats. Det förutspås att de kan vara involverade i växtens anpassning till abiotiska påfrestningar. Justeringen av aminosyrasekvenserna för CtUGT1 och andra växtglykosyltransferaser visas i Fig. S4.

De mycket konserverade 44 resterna av PSPG-motivet hittades vid C-terminalen avCtUGT1. Inom PSPG-boxen fanns en peptidsekvens av HCGWNS vid den 373:e aminosyran, som har detekterats i 95 procent av alla glykosyltransferaser [31]. Den sista återstoden av PSPG-motivet var glutamin, vilket indikerade att detta enzym tenderar att använda UDPG som sin sockerdonator [32] (Fig. S4). Det fylogenetiska trädet konstruerades baserat på de förutsagda polypeptidsekvenserna avCtUGT1och olika typer av glykosyltransferaser av växtursprung som var involverade i biosyntesen av olika sekundära metaboliter. Hittills har de flesta av de rapporterade glykosyltransferaserna från växter känt igen flavonoider som sina substrat, såsom flavon 7-O-glykosyltransferaser, flavonoid 3-O-glukosyltransferaser, isoflavon 7-O-glykosyltransferaser och chalkonglykosyltransferaser. Fylogenetiska analysresultat visade detCtUGT1har inte grupperats i kladden av flavonoid-GT. Istället ligger den intill UGT74T1 och UGT74S1 (lignanglykosyltransferaser från Linum usitatissimum) och NtGT2 (ett kumaringlykosyltransferas från Nicotiana tabacum), vilket indikerade attCtUGT1kan ha några nya katalysaktiviteter mot fenylpropanoidsubstrat (fig. 1), särskilt med tanke på att endast begränsade medlemmar har identifierats funktionellt som tillhör dessa klader.

För att ytterligare avslöja dess katalysaktivitet,CtUGT1sekvensen uttrycktes under kontroll av T7-lac-promotorn i E. coli Transetta (DE3)-celler som His6--märkt fusionsprotein. Den His-märkta rekombinantenCtUGT1renades effektivt till homogenitet genom Ni-NTA-affinitetskromatografi. Molekylvikten för den renade rekombinanta CtUGT1 var cirka 55 kDa (Fig. S5), vilket överensstämmer med den förutsagda molekylmassan.

3.3. In vitro acceptorsubstratspecificitet för CtUGT1

För att testa glykosyleringsaktiviteten avCtUGT1Enzymatiska analyser in vitro utfördes. UDPG användes som sockerdonator. Sockeracceptorer valdes baserat på olika problem. För det förstaCtUGT1genen klonades frånCistanche tubulosavars huvudsakliga kemiska komponenter är PhGs. För att verifiera omCtUGT1är involverad i biosyntesen av PhGs, de vanliga aglykonerna av PhGs iCistanche tubulosasåsom tyrosol (NP1, Fig. S2) och salidrosid (NP2, Fig. S2) valdes först ut som substrat. Tyvärr hittade HPLC och HRESI-MS analyser inte några glykosylerade produkter, vilket indikerade attCtUGT1kanske inte är involverad i biosyntesen av PhG.

För det andra, baserat på sekvensinriktningen och fylogenetiska analysresultat (Fig. 1),CtUGT1var fylogenetiskt relaterad till lignanoid- och kumaringlykosyltransferaser, vilket antydde attCtUGT1är förmodligen ett fenylpropanoid glykosyltransferas. För att verifiera denna förutsägelse testades tre kumarinsubstrat 1, 2 och 3 tillsammans med ett lignanoidsubstrat magnolol NP17 som sockeracceptorer. Värmeinaktiverade enzymer (100 ◦C, 10 min) användes som en negativ kontroll. HPLC-HRESI-MS-analys av reaktioner med användning av NP17 som substrat fann ingen produkt. DäremotCtUGT1visade uppenbara glukosyleringsförmåga mot de testade kumarinsubstraten (1,2,3). Med användning av substrat 1 som ett exempel, som visas i Fig. 2A, producerades en ny topp (1a) med en minskad retentionstid (11,46 min) jämfört med den för substrat 1 (19,75 min) avCtUGT1till en direktavkastning på 37,78 procent . Dess UV-absorptionsspektrum motsvarar 1. HRESI-MS-spektrum visade att topp 1a uppvisade ett [M plus H] plus vid m/z 325,1029 och ett [M plus Na] plus vid m/z 347,0710 (beräknat 347,0737 för C15H16O ) med den förutsagda formeln C15H16O8, som var 162 amu större än den för 1 och överensstämmer med den teoretiska formeln för en glukosylerad produkt (Fig. 2A). På liknande sätt hittades också den glukosylerade produkten av substrat 2 (14,21 min, fig. 2B) och 3 (21,92 min, fig. 2C) vid retentionstiden på 10,85 min och 13,80 min, med en omvandlingshastighet på 22,03 procent och 68,67 procent , respektive. Molekylmassan för produkterna matchade exakt med den beräknade massan av glukosylerade produkter, vilket bekräftade attCtUGT1kan katalysera glukosyleringen av kumarinföreningar 1–3 (tabell 1).

Därefter, med tanke på att de flesta av de nyligen rapporterade enzymerna uppvisade katalyspromiskuitet in vitro, för att ytterligare utforska substratspektrumet förCtUGT1, utfördes expansiva enzymanalyser mot olika föreningar som tillhör olika typer av naturprodukter, inklusive flavonoider, fenolföreningar, kumariner, stilben, antrakinoner, bensofenon, naftalen och iridoid (fig. S1-S2), med användning av UDPG som sockergivaren. Det visade sig att bensofenonsubstratet 4,4'-dihydroxibensofenon (4), isoflavonsubstratet genistein (5) och antrakinonsubstratet aloe-emodin (6) också kunde katalyseras avCtUGT1för att bilda den motsvarande glukosylerade produkten 4a, 5a, 6a med högre polaritet (fig. 3). HRESI-MS-analys visade att jontopparna för produkterna alla var 162 amu större än substratens, vilket tyder på attCtUGT1kan katalysera glukosyleringen av dessa föreningar för att bilda deras motsvarande monoglukosidprodukt. Omvandlingsfrekvenserna för 4, 5 och 6 var 4,12 procent, 14,14 procent respektive 23,33 procent (tabell 1).

Sockerdonatorselektiviteten avCtUGT1utforskades också. Förutom UDPG testades sex andra donatorer, inklusive UDP-N-acetylgalaktosamin, UDP-galaktos, GDP-mannos, GDP-fukos, UDP-galakturonsyra och UDP-ramnos, med användning av substrat 1–6 som acceptorer. Resultaten visade detCtUGT1exklusivt valt UDPG som sockerdonator. Ingen produkt observerades när andra aktiverade sockerarter testades (data visas inte).

3.4. Biokemiska egenskaper och kinetiska parametrar för CtUGT1

Biokemiska egenskaper hosCtUGT1undersöktes med användning av 3 som sockeracceptor och UDPG som sockerdonator såsom visas i fig. 4. KatalysaktivitetCtUGT1testades i ett temperaturområde på 4–60 ◦C, den optimala aktiviteten upptäcktes vid 37 ◦C (Fig. 4A). Analys av enzymaktiviteten mellan pH 3.0 och 9.0 visade att det optimala pH-värdet observerades vid pH 8.0 (100 mM buffert KH2PO4-K2HPO4, Fig. 4C). Utbytet av glukosyleringsprodukten 3a ökade linjärt inom 1 timme och tillväxthastigheten planade ut efter 5 timmar (Fig. 4B). Det skenbara Km-värdet påCtUGT1för 3 var 218,7 ± 7,176 μM, och Vmax var 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug−1.

3.5. Enzymatisk beredning och strukturell identifiering av glukosylerade produkter

Baserat på enzymanalysresultaten,CtUGT1tenderar att vara ett specifikt glukosyltransferas som kan katalysera glukosyleringen av olika typer av naturliga produkter. HPLC-HR-MS-information för produkterna sammanfattades i tabell 1. Bland dessa uppvisade kumarinsubstrat en avsevärd omvandlingshastighet. Enzymaktiviteten mot kumariner analyserades vidare. Det bör noteras att alla tre testade kumarinsubstrat accepteras avCtUGT1har en hydroxylgrupp i C-7-positionen, medan esculetin (2) har en extra hydroxylgrupp i C-6-positionen. HPLC-profilen för den glukosylerade produkten av esculetin visas i fig. 2. Endast en enda produkt observerades, vilket tyder på att glukosyleringsreaktionen regionspecifikt inträffade vid C-6- eller C-7-positionen. För att bekräfta glykosyleringsstället identifierades produkt 2a genom jämförelse med de autentiska glukosiderna genom HPLC-UV/HRESI-MS-analys. När den autentiska glukosidcikoriinen (glukosylerad på 7-OH-positionen 2) tillsattes i reaktionssystemet, överlappade toppen med 2a, co-HPLC-profilen bekräftade ytterligare att den glykosylerade produkten av 2 katalyserades avCtUGT1är cichoriin [33], vilket bevisade att glukosyldelen specifikt överfördes på C7-OH-position. Produkt 1a identifierades också genom jämförelse med referensstandarden. UV-HPLC-spektra tillsammans med co-HPLC-analys (Fig. 2) avslöjade att den kemiska strukturen av 1a tillskrevs som skumning [34], vilket är den glukosylerade produkten av 1 på C7-OH-position.

Produkt 3a framställdes från en uppskalad reaktion och strukturellt karakteriserad genom HRESI-MS, 1H NMR och 13C NMR-spektroskopi (fig. S13, S14 och not 4). I 1H NMR-signalen, jämfört med substrat 3, försvann en fenolisk hydroxylsignal i positionen C{{10}} och kolsignalen för C-7 skiftade δ 1.{{25} } ppm till det höga fältet, medan C-6- och C-8-signalerna skiftade till det låga fältet i 13C NMR. Dessa fynd bekräftade att glukopyranosylresten var bunden till den fenoliska hydroxylgruppen vid C-7-positionen 3 [35]. Dessutom visade 1H NMR-spektrum anomera protonsignaler vid δH 5. 00 (1H, d, J=7.0 Hz); sockerkomponenten indikerades vara -D-glukopyranos. Detta resultat visadeCtUGT1är ett kumarin O-glukosyltransferas som katalyserade glukosyleringen av hydroxyl kumarin i 7-OH-positionen.

3.6. Homologimodellering, molekylär dockning och platsriktad mutagenes av CtUGT1-protein

Omfattande enzymreaktioner avslöjade detCtUGT1kunde katalysera glukosyleringen av tre kumariner till deras motsvarande glukosylerade produkt, och den glukosylerade positionen hände specifikt vid 7- OH-positionen. För att identifiera nyckelresterna som bestämde katalysaktiviteterna förCtUGT1, homologimodellering, molekylär dockning och platsriktade mutagenesundersökningar av CtUGT1 utfördes. Homolog molekylär modellering för CtUGT1 etablerades med hjälp av SWISS-MODEL [21-25]. Kristallstrukturen för Medicago truncatula glykosyltransferas UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), bestämd vid en upplösning på 2,1 Å, visade den högsta totala poängen med maximal sekvenshomologi och ett lågt E-värde, valdes som mallstruktur [26]. Rationalitetsbedömning av den etablerade modellen visades i Ramachandran-området (Fig. S6), 88,5 procent av resterna i den etablerade modellen är i den mest gynnade regionen. Homologimodellen för CtUGT1 består av två liknande veckmotiv av Rossmann-typ vid N- respektive C-terminalen (Fig. 5A). Den N-terminala domänen har sju-strängade parallella ark runt om med tio helixar. Den C-terminala domänen innehåller sexsträngade ark flankerade av nio helixar (Fig. 5A, S7).

För att ytterligare förtydliga den aktiva fickan avCtUGT1molekylär dockning utfördes. Eftersom UGT85H2 endast har apo-formstrukturen valdes en annan homolog UGT74F2 med både UDP och salicylsyra som två ligander som kontrollmall. UDPG förbereddes som sockerdonator. Två kumarinsubstrat 1 och 2 framställdes som sockeracceptorer. Bindningsställena för glykosyldonator och acceptor beräknades och dockades separat såsom visas i fig. 5. Resultaten visade att båda de två bindningsfickorna är belägna inuti den djupa klyftan i interaktionsområdet för den tätt packade N-terminala domänen och C -terminus domän avCtUGT1och rumsligt nära varandra (fig. 5A). C-änden avCtUGT1är huvudsakligen involverad i kontakt med glykosyldonatorn som beskrivs i andra växters UGT, och de flesta av de omgivande resterna är hydrofila och mycket konserverade. Såsom den typiska PSPG-boxen, kan rest W377 i detta motiv bilda vätebindningar med glukosgruppen i UDPG (Fig. 5B); N378 och S379 i detta motiv kunde bilda vätebindningar med difosfatgruppen i UDPG (Fig. 5B). Dessutom, enligt dockningsresultaten, kan rester av W356 och Q359 interagera med uridingruppen genom vätebindningsinteraktion för att stabilisera donatorn i den aktiva fickan. För att verifiera funktionen av dessa förutsagda nyckelrester valdes totalt 16 ställen ut och utsattes för alaninskanningsmutagenes. Katalysaktiviteterna för dessa mutanter testades med användning av alla sex positiva substrat som nämnts ovan. HPLC-analyser visade att när rester av G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 och D398 muterades till alanin, var proteinets glykosyleringsaktivitet helt förlorad mot alla testade substrat. Dessa resultat antydde att ovanstående 16 rester är nyckelresterna som bestämde bindningen av UDPG-donatorn och glykosyleringsaktiviteten avCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 procent) såsom V14, V132, E153, T212 och I209 (Fig. S8). Det förutspås att dessa hydrofoba rester som omger den aromatiska ringen kan bilda van der Waals-interaktioner med substratet i bindningsfickan.

4. Diskussion

Glykosylering är ett av de viktigaste modifieringsstegen i många sekundära metaboliters biosyntesvägar. Glykosylering kan öka biotillgängligheten av naturliga produkter genom att förbättra deras vattenlöslighet och minska deras toxicitet. Kumarin anses vara den enklaste formen inom en enorm klass av naturligt förekommande fenoliska ämnen konstruerade av en -pyronring smält med en bensenring. Både naturliga och syntetiska kumarinbaserade föreningar har väckt stor uppmärksamhet från läkemedelskemister och läkemedelsdesignforskare som en konsekvens av deras olika farmakologiska och biologiska egenskaper [36]. Ytterligare glykosylerad modifiering av kumariner skulle kunna bidra till att berika den strukturella mångfalden av dessa föreningar och även förbättra deras löslighet och biotillgänglighet. I växter katalyseras en sådan glykosyleringsprocess av UDP-glykosyltransferas. Även om flera UGT har identifierats från olika växter, hittills var de flesta av de rapporterade UGT involverade i den glykosylerade modifieringen av flavonoider. Endast begränsade UGT rapporterades kunna acceptera kumariner som substrat. I denna studie, en ny glykosyltransferas-genCtUGT1klonades från den traditionella kinesiska örtenCistanche tubulosa. Sekvensjustering och fylogenetiska analysresultat visade detCtUGT1är fylogenetiskt avlägsen från de flesta av de rapporterade flavonoid-UGT och mycket nära fenylpropanoid-UGT. Omfattande enzymanalyser avslöjade att CtUGT1 inte kunde katalysera glykosyleringen av fenyletanolföreningar för att bilda PhGs, som är den huvudsakliga kemiska komponenten iCistanche tubulosa. Istället kunde den känna igen kumariner som dess substrat och genomföra glykosyleringsreaktionen. Strukturbelysning av produkterna visade att glykosyleringsstället katalyserades avCtUGT1hände regionspecifikt vid C7-OH-positionen för kumariner. Med hjälp av CtUGT1 har tre kumaringlykosider inklusive skumning (1a), cichoriin (2a) och 4-metylumbelliferylglukosid (3a) framgångsrikt enzymsyntetiserats och identifierats strukturellt. Alla dessa tre föreningar rapporterades som farmaceutiskt aktiva molekyler. Till exempel har 1a ansetts ha olika farmakologiska aktiviteter, inklusive renoprotective aktivitet, antiinflammatoriska, anti-cancer och anti amöba egenskaper [37]. 2a visade hög antibakteriell aktivitet mot vissa grampositiva bakterier som Bacillus cereus och Staphylococcus aureus [38]. 3a kan hjälpa växterna att förbättra sin reaktionsförmåga på kemikalier och toxiner [39].

Förutom kumariner fann omfattande enzymanalyser detCtUGT1visade också observerbar glukosyleringsaktivitet mot bensofenonsubstrat 4, isoflavonsubstrat 5 och antrakinonsubstrat 6, vilket indikerade att CtUGT1 har viss substrattolerans. Ändå,CtUGT1kunde inte katalysera biosyntesen av glykosidekomponenter iCistanche tubulosasåsom fenyletanoidglykosider (PhGs), lignanoidglykosider och iridoidglykosider. Dessutom, enligt tidigare undersökningar, isolerades inga kumaringlykosider frånCistanche tubulosa. Så in vivo-funktionen avCtUGT1behöver fortfarande undersökas ytterligare. Glukosyleringsaktiviteten hos CtUGT1 mot kumarinsubstrat gör detta enzym till ett användbart verktyg för enzymatisk glykosyleringsmodifiering av kumariner och indikerade också att växtens sekundära metaboliska enzymer kunde utföra ovärderliga katalysaktiviteter som ligger långt bortom deras naturliga funktioner.

Förklaring av konkurrerande intresse

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Bekräftelse

Detta arbete fick ekonomiskt stöd av Beijing Natural Science Foundation (anslag nr. 7192112); Sponsorprogram för unga elitforskare av CAST (bidrag nr. CACM− 2018− QNRC1− 02); National Natural Science Foundation of China (anslag nr 81402809); China Scholarship Council State Scholarship Fund (anslag nr. 201906555010) och Science Foundation for Elite Young Scholars vid Beijing University of Chinese Medicine (anslag nr. 2018-JYB-XJQ006).

Bilaga A. Kompletterande uppgifter

Kompletterande data till denna artikel kan hittas online på https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Från: ' Molekylär kloning och biokemisk karakterisering av ett nytt kumaringlykosyltransferasCtUGT1frånCistanche tubulosa' förbiXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Referenser

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Phylogenetic analysis of the UDPglycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glycosidases for oligosaccharide synthesis, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Ovanlig sockerbiosyntes och naturlig produktglydiversifiering, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Advances on the in vivo and in vitro glycosylations of flavonoids, Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molecular cloning and characterization of UDP-glucose: volatile benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase in petunia flowers, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosyntetiska UDP-glykosyltransferaser från växter, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Utforska den funktionella betydelsen av sterolglykosyltransferasenzymer, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Den primära in vivo steroidalkaloiden glukosyltransferas från potatis, fytokemi. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Antioxidant activity of citrus limonoids, flavonoids and coumarins, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Antiviral aktivitet av angelicin mot gammaherpesvirus, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Kumarin-baserade derivat med potent anti-HIV-aktivitet, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Antioxidant activity and hepatoprotective potential of Cedrelopsis grevei on cypermetrin-induced oxidative stress and leverskader in hanmöss, BMC Complement. Altern. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Kumarin: en potentiell kärna för antiinflammatoriska molekyler, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Kumarinderivat som anticancermedel för lungcancerterapi: en översikt, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: en naturlig, privilegierad och mångsidig ställning för bioaktiva föreningar, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10,3390/molekyler23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, kloning och karakterisering av ett glukosyltransferas som reagerar på 7-hydroxylgruppen av flavonol och 3-hydroxylgruppen av kumarin från tobaksceller, Arch. Biochem. Biophys. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosynthesis of kumarin glycosiders by transgenic hairy roots of Polygonum multiflorum, Biosci. Biotechnol. Biochem. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Molecular cloning and characterization of coumarin glucosyltransferase in hairy roots of Pharbitis noll (Ipomoea noll), Plant Tissue Cult. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Molekylär och strukturell karakterisering av ett promiskuöst glykosyltransferas från Trollius Chinensis, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: molekylär evolutionär genetikanalys version 7.0 för större datamängder, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: homologimodellering av proteinstrukturer och komplex, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-Pdb viewer: a historical perspective, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, The SWISS-MODEL repository-new features and functionality, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-distance restriktioner tillämpas på modellkvalitetsuppskattning, bioinformatik. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modellering av protein kvaternär struktur av homo- och hetero-oligomerer bortom binära interaktioner genom homologi, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, kristallstrukturen hos Medicago truncatula UGT85H2-insikter i den strukturella grunden för en multifunktionell (iso)flavonoid glykosyltransferas, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Assessment of protein models with three-dimensional profiles, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: ett program för att kontrollera den stereokemiska kvaliteten hos proteinstrukturer, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: förbättra hastigheten och noggrannheten vid dockning med en ny poängfunktion, effektiv optimering och multithreading, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Differences in salicylic acid glucose conjugations by UGT74F1 and UGT74F2 from Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: karakterisering av en supergenfamilj, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Ändring av sockerdonatorspecificiteter för växtglykosyltransferaser genom en enda punktmutation, Arch. Biochem. Biophys. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glukosylering av fenoliska föreningar genom Pharbitis noll håriga rötter: I. Glukosylering av kumarin och flavonderivat, Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hydrolysis of toxic natural glucosides catalyzed by cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation of hydroxycumarin derivatives by cultured suspension cells of Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Recent advancements of kumarin-based anticancer agents: an up-to-date review, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Effekter av ett kumarinderivat, 4-metylumbelliferon, på frögroning och etablering av plantor i Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Åtta nya sesquiterpenoider av eudesmane- och eremophilane-typ från Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Bestämning och farmakokinetisk studie av skumning med UHPLC-MS/MS i råttplasma, J. Pharm . Biomed. Anal. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.