Flerriktad aktivitet av Bakuchiol mot cellulära mekanismer för ansiktets åldrande - Experimentella bevis för en holistisk behandlingsmetod Del 1

Abstrakt

Mål: Hudens åldrande är en multifaktoriell process som involverar bildning av reaktiva syrearter, konsekutiva inflammationer med minskad epidermal och dermal cellviabilitet och resulterande skada på den extracellulära matrisen. Effektiva dermo-kosmetiska behandlingsmetoder bör helst ta itu med dessa kännetecken i ett holistiskt tillvägagångssätt. Här bestämde vi motsvarande aktivitetsprofil för bakuchiol, en växthärledd meroterpen, i en rad in vitro-, ex vivo- och in vivo-studier och jämförde den med retinol, som för närvarande anses vara guldstandarden inom topikal anti-aging kosmetika.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranets funktion. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en god renande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenerationen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinakosid i Cistanche en betydande förmåga att ta bort DPPH-fria radikaler och kan avlägsna reaktiva syrearter, förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tyminfria radikaler.

Klicka på Antioxidant Cistanche Tubulosa

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Metoder: Den antioxidativa kapaciteten och kraften hos bakuchiol och retinol analyserades genom att mäta 2,2'-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-reduktion via dess absorptionssönderfall respektive elektronspinresonansspektroskopi. Effekter på prostaglandin E2 (PGE2), makrofagmigrationshämmande faktor (MIF), fibroblasttillväxtfaktor 7 (FGF7), kollagen typ I och VII (COL1A1, COL7A1), fibronektin (FN) nivåer samt metaboliseringen av vattenlösligt tetrazolium 1 (WST-1) bestämdes i humana dermala fibroblaster. Epidermal regenerering utvärderades med användning av en sårläkningsmodell in vitro. FN-proteinnivåer analyserades ex vivo efter behandling med en formulering innehållande bakuchiol, retinol eller vehikel med användning av en sugblistervätska. Förbättring av hudtillståndet bestämdes in vivo i en jämförelsestudie med delat ansikte efter applicering av bakuchiol eller vehikel.

Resultat: Till skillnad från retinol visade bakuchiol hög antioxidativ effekt. Nivåer av PGE2 och MIF minskade signifikant av både bakuchiol och retinol. Bakuchiol men inte retinol ökade signifikant FGF7-proteinnivåerna. WST-1-metaboliseringsnivåer förhöjdes signifikant av bakuchiol och retinol. Applicering av Bakuchiol och retinol ledde till en signifikant ökning av COL1A1-, COL7A1- och FN-proteinnivåerna. Sår kompletterade med bakuchiol men inte retinol visade en signifikant ökning av epidermisregenerering. Kliniskt visade områden som behandlats med en bakuchiol-innehållande formulering en statistiskt signifikant ökning av FN-proteinvärden efter en 4-vecka applicering jämfört med obehandlade områden och områden som behandlats med vehikel.

Slutsats: Dessa data ger bevis för bakuchiols effekt i flera riktningar mot cellulära kännetecken för hudens åldrande. Dess aktivitetsprofil delar vissa gemensamma drag med retinol men visar flera hittills okända positiva effekter i våra studier, nämligen stimulering av den kritiska extracellulära matriskomponenten FN, och accelererad epidermal regenerering och sårläkning.

NYCKELORD

anti-aging, bakuchiol, påståendebevisning in vivo/ex vivo/in vitro, retinol, hudfysiologi/strukturer

INTRODUKTION

Åldrad hud kännetecknas av rynkor, ojämn pigmentering, grov hud och slapphet. Dessa kliniska tecken är resultatet av strukturella och metabola förändringar orsakade av processer av inre och yttre åldrande. Inneboende åldrande har tillskrivits faktorer inklusive telomerförkortning, kronisk inflammation, enstaka mutationer i mitokondriella DNA och fria radikaler [1]. Åldrad hud innefattar vidare en minskning av dess antioxidativa system[2]. Dessutom minskar cellproliferationshastigheten på grund av den biologiska åldrandeprocessen som leder till förlust av hudstruktur och funktion. Extrinsiskt åldrande utlöses främst av UV-strålning och miljöpåverkan. Dessa förolämpningar resulterar i hudskador som förstärker den kronologiska nedgången och påskyndar hudens åldrande. Människohud förlorar vidare förmågan att klara av inflammatoriska tillstånd under hela åldrandet, vilket resulterar i ett kroniskt proinflammatoriskt tillstånd.

Den topiska appliceringen av retinoider som retinsyra, retinal eller retinol anses vara den kliniska guldstandarden för effektiv anti-aging behandling [3, 4]. De molekylära mekanismerna hos retinoider har beskrivits utförligt [5-10]. Aktuella retinoider minskar effektivt synliga tecken på åldrande som rynkor, slapphet eller strävhet [4, 11] och minskar depigmentering av fotoskadad hud inklusive livedo reticularis och aktiniska lentiginer [12]. Lokal behandling med retinoider kan dock leda till koncentrationsberoende torr hud och irritation [13]. Eftersom applicering av retinol orsakar mindre biverkningar jämfört med andra retinoider som retinolsyra [6, 14], är det en allmänt använd aktiv substans i kosmetisk behandling av ansiktets åldrande.

Till skillnad från retinol som har applicerats i hudvårdsprodukter sedan 1984 [15] har bakuchiol först nyligen fått uppmärksamhet som en aktuell anti-aging förening. Bakuchiol är en meroterpen (Figur 1) som kommer från Psoralea corylifolia-frön. Det har använts i traditionell indisk och kinesisk medicin i århundraden [16, 17] och tolereras väl [18]. Bakuchiol föreslogs uppvisa retinolliknande funktioner, som i en hudersättningsmodell visar båda substanserna liknande genuttrycksmönster in vitro [19] och en förbättring av kutan fotoskada in vivo [20]. Därför har det också hänvisats till som en växthärledd funktionell retinoidanalog [21]. Ytterligare studier visade antioxidant [19, 22–24], antiinflammatoriska [19, 25–27], antibakteriella [28] samt antiproliferativa och antitumöreffekter [29, 30] av bakuchiol.

För att effektivt förbättra och fördröja de multifaktoriella hudåldringsprocesserna måste olika cellulära mekanismer hanteras i ett integrerat tillvägagångssätt. Bakuchiol modulerar samtidigt olika mål vilket gör det till en lovande förening i detta avseende. Eftersom oxidativa och inflammatoriska påfrestningar är nära relaterade till hudens åldrande, kan deras förebyggande av bakuchiol främja det övergripande hudtillståndet. Kvaliteten på de aktuella vetenskapliga bevisen har dock nyligen bedömts kritiskt [31]. I detta sammanhang bestämde vi den (i) antioxidativa och (ii) antiinflammatoriska kapaciteten hos bakuchiol och retinol och undersökte deras förmåga att förbättra den cellulära metabolismen och syntesen av tillväxtfaktor 7 sammanfattad som (iii) cellaktivitet. Vi analyserade vidare om bakuchiol och retinol påverkar uttrycket av vissa (iv) ECM-komponenter och förbättrar (v) epidermal regenerering och återepitelisering. Slutligen genomfördes en in vivo-studie för att verifiera bakuchiols kliniska anti-aging-kapacitet i mänsklig hud.

MATERIAL OCH METODER

Testmaterial

Bakuchiol erhölls från Sytheon Ltd (Boonton, New Jersey, USA). Retinol köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). För cellodlingsexperiment späddes båda testsubstanserna nyspädda i DMSO (Merck, Darmstadt, Tyskland). För DMSO-stamlösningarna var den applicerade koncentrationen av testsubstanser 1000-faldigt över den högsta koncentrationen som applicerades i cellkultur, vilket gav 0,1 procent DMSO i media eller buffert. Ytterligare utspädningar utfördes med användning av media eller buffert med 0,1 procent DMSO. Följaktligen utfördes alla cellodlingsexperiment i närvaro av 0,1 procent DMSO. För in vivo-studierna formulerades topikal retinol i samma vehikel som bakuchiol.

In vitro studier

Bestämning av den antioxidativa kapaciteten

Bakuchiol, retinol (båda applicerade i en slutlig koncentration av 100 μM), eller högstandard trolox (Merck, slutlig koncentration av 25 μM) späddes i DMSO. Kortfattat sattes 30 μL av dessa föreningar (10-faldigt högre koncentration än den slutliga analyskoncentrationen) till en 96-brunnsplatta med platt botten. Därefter tillsattes snabbt 270 μL 39 ug/mL DPPH (Merck, utspädd i en 1:1 vatten/etanol-blandning) till varje brunn, vilket gav en slutlig koncentration på 10 procent DMSO. Som en kontroll inkuberades DPPH-lösningen med DMSO som saknade testsubstanser. Vidare utfördes blankkontroller genom att inkubera bakuchiol eller retinol med vatten/etanol (1:1) eller endast vatten/etanol-blandningen (1:1) innehållande 10 procent DMSO i frånvaro av DPPH. Efter 10, 30 och 60 minuter mättes absorbansen vid 524 nm med användning av en Spark multimode mikroplattläsare (Tecan, Männedorf, Schweiz). Signaler från tomma kontroller subtraherades.

Bestämning av den antioxidativa kraften

HDF såddes i {{0}}brunnsplattor med 150 000 celler/brunn i ett 2 ml medium innehållande 10 procent kalvserum och inkuberades i 24 timmar. Därefter kasserades det gamla mediet och cellerna behandlades med ett medium innehållande 2 procent kalvserum och bakuchiol eller retinol i en slutlig koncentration av 10 μM. Kontroll HDF kompletterades med 0,1 procent DMSO som saknade bakuchiol eller retinol. Blanka kontroller utfördes genom att inkubera ett medium utan celler. Efter 24 timmar överfördes det konditionerade mediet till Vivaspin-proteinkoncentrator-spinkolonner (5000 MWCO; Sartorius, Göttingen, Tyskland) och koncentrerades ungefär 10-faldigt. Volymer av alla mediumsupernatanter utjämnades genom återtillsättning av genomflödet. FGF7-proteinnivåer i det koncentrerade konditionerade mediet analyserades med användning av ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner (Bio-Techne GmbH). Mätningar utfördes med en Spark multimode mikroplattläsare (Tecan). Signaler erhållna från blankkontroller subtraherades och FGF7-proteinnivåer normaliserades till det totala cellantalet som bestämdes med användning av en cellräknare (Scepter, Merck).

Bestämning av WST-1-metabolisering

HDF såddes i {{0}}brunnsplattor med 3000 celler/brunn i 100 μL medium innehållande 10 procent kalvserum och inkuberades i 24 timmar. Det utarmade mediet kasserades och cellerna behandlades med 100 μL medium innehållande retinol eller bakuchiol i en slutlig koncentration av 1 μM respektive 10 μM. Kontroll HDF kompletterades med 0,1 procent DMSO som saknade bakuchiol eller retinol. Som en ytterligare kontroll behandlades celler med 10 procent triton-X (Merck). Blanka kontroller utfördes genom att inkubera ett medium utan celler. Efter 72 timmar färgades cellerna med det kommersiellt tillgängliga cellproliferationsreagenset WST-1 enligt tillverkarens instruktioner (Merck). Absorbansen mättes vid 450 och 620 nm med användning av en Tecan infinity M200 mikroplattläsare (Tecan). Skillnaden i dessa mätningar användes för analys. Signaler från tomma kontroller subtraherades.

Bestämning av COL1A1 och COL7A1 proteinnivåer

HDF såddes i {{0}}brunnsplattor med 10  000 celler/brunn i 100 μL medium innehållande 10 procent kalvserum och inkuberades i 24 timmar. Bakuchiol eller retinol späddes i 100 μL medium utan kalvserum och kompletterades med det aktuella mediet i en slutkoncentration på 1 μM respektive 10 μM. Kontrollen kompletterades med 100 μL serumfritt medium vilket gav en koncentration på 0,1 procent DMSO motsvarande retinol- och bakuchiolbehandlingen. Som en hög standard applicerades 10 ng/ml transformerande tillväxtfaktor- (TGF-) och 11 ug/ml natriumaskorbat (båda Merck). Blanka kontroller utfördes genom att inkubera ett medium utan celler. Efter 4 timmar analyserades COL1A1- och COL7A1-proteinnivåerna i det konditionerade mediet med användning av kommersiellt tillgängliga ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA). Mätningar utfördes med en Spark multimode mikroplattläsare (Tecan). Signaler från tomma kontroller subtraherades. COL1A1- och COL7A1-proteinnivåerna normaliserades till den totala cellysatproteinmängden som bestämdes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt bicinchoninsyra-analyskit (Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens instruktioner. En förutsättning för användningen av resultaten var den positiva reaktionen av celler på TGF- och natriumaskorbat av hög standard.

För analys av COL7A1-proteinnivåer efter en förlängd inkubationstid såddes HDFs i 96-brunnsplattor med 3000 celler/brunn i 100μL medium innehållande 10 procent kalvserum. Alla behandlingar, kontroller och analysen utfördes enligt beskrivningen ovan med undantaget att bakuchiol och retinol endast användes i en slutkoncentration på 10 μM. Celler skördades när subkonfluens nåddes, i synnerhet efter 72 eller 96 timmar.

Bestämning av FN-proteinnivåer

HDF såddes i {{0}}brunnsplattor med 10 000 celler/brunn i 100 μL medium innehållande 10 procent kalvserum och inkuberades i 24 timmar. Det gamla mediet ersattes av ett medium innehållande 2 procent kalvserum och bakuchiol eller retinol i en slutlig koncentration av 10 μM. Kontrollen kompletterades med 0,1 procent DMSO som saknade bakuchiol eller retinol. Blanka kontroller utfördes genom att inkubera ett medium utan celler. Efter 24 timmar analyserades FN-proteinnivåerna i det konditionerade mediet med användning av ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Mätningar utfördes med en Spark multimode mikroplattläsare (Tecan). Signaler från tomma kontroller subtraherades. FN-proteinnivåer normaliserades till den totala cellysatproteinmängden som bestämdes enligt ovan.

Bestämning av epidermal regenerering i en in vitro sårläkningsmodell

Experimenten utfördes som beskrivits tidigare [34]. För behandling av sårläkningsmodeller späddes bakuchiol eller retinol i DPBS och tillsattes i en slutlig koncentration av 100 μM till sårregionen (5 μL per sår). Referenssåren kompletterades med samma mängd DPBS innehållande 0,1 procent DMSO utan bakuchiol eller retinol. Ytterligare sår lämnades obehandlade som en ytterligare kontroll. Sårläkningsmodeller inkuberades i 43 timmar vid 95 procent luftfuktighet, 5 procent CO2 och 37 grader. Därefter snabbfrystes proverna i isopentan förkylt med flytande kväve och lagrades vid -80 grader. Återepitelisering utvärderades i hematoxylin- och eosinfärgade kryostatsnitt genom att mäta längden på den regenererade epidermis med ett Leica DMLS-mikroskop (10×), en Leica MC 170 HD CCD-kamera och Leica LAS V4.9-mjukvaran (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Kvantifiering utfördes på ett förblindat sätt.

In vivo studier I och II

För båda in vivo-studierna observerades rekommendationerna i den nuvarande versionen av Helsingforsdeklarationen och riktlinjerna från den internationella konferensen om harmonisering av god klinisk praxis som tillämpliga på en kosmetisk studie. Studieprotokollet I godkändes av den oberoende etiska kommittén Freiburg (fekikod 08/2610). I båda studierna gav alla frivilliga skriftligt, informerat samtycke. Försökspersonerna hade frisk hud, tillhörde Fitzpatrick hudtyp I till III och början eller byte av hormonell medicinering var ett uteslutningskriterium.

Under en 10-dagars förkonditioneringsperiod och under hela studieperioden krävdes försökspersonerna att avstå från UV-exponering i testområdena. Svettfrämjande aktiviteter var förbjudna 24 timmar före schemalagda bedömningar.

En utredare visade korrekt applicering av formuleringar med användning av en mängd som motsvarade den vanliga hudvårdsregimen för försökspersoner.

Studie I: Ex vivo-bestämning av FN-proteinnivåer

Av 52 kvinnliga försökspersoner, som var inskrivna i denna fordonskontrollerade studie, fullbordade 33 försökspersoner studien och data från 31 försökspersoner (30–64 år, medelålder: 50,9 år) inkluderades i dataanalysen. Avhopp inträffade på grund av SARS-CoV-2-pandemin och personliga skäl (13 försökspersoner) samt på grund av inkompatibilitetsreaktioner (fem försökspersoner, orsakade av retinolbehandling). Retinolmedierade inkompatibilitetsreaktioner såväl som provtagningsproblem orsakade olika antal försökspersoner som testades för varje tillstånd (se resultat för detaljer).

Sju dagar före planerade bedömningar förbjöds användning av hudvårdsprodukter, rengöringsmedel och tvålar på underarmarna. På den första studiedagen etablerades fyra testområden på de inre underarmarna. På två testområden applicerades två verumformuleringar för att innehålla {{0}},5 procent bakuchiol respektive 0,15 procent retinol. I ett yttrande publicerat av den vetenskapliga kommittén för konsumentsäkerhet 2016 ansågs den applicerade retinolkoncentrationen vara en kosmetisk behandling [35]. I de andra två testområdena användes motsvarande vehikel, eller så lämnades området obehandlat. Placeringen av behandlingsställen var permuterad. Efter 4 veckors applicering två gånger dagligen av testformuleringar återvände frivilliga till testinstitutet. I varje testområde genererades tre sugblåsor (7 mm i diameter) som tidigare beskrivits [36, 37]. Kortfattat sattes skräddarsydda sugblister på testområdena och ett vakuum på 550–850 mbar applicerades. Efter cirka 90–150 minuter, när sugblåsor hade bildats, släpptes vakuumet och vätskan aspirerades från blistern med en 24-mätarnål. Vätskor frystes omedelbart vid -80 grader på torris tills analys. FN-proteinnivåer kvantifierades i sugblistervätskeprover med användning av ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit (R&D Systems). Mätningar utfördes med en Spark multimode mikroplattläsare (Tecan). FN-nivåer normaliserades till totala proteinnivåer av sugblistervätskeprover som bestämdes enligt ovan.

Studie II: In vivo bestämning av förbättring av hudtillståndet

Totalt inkluderades 43 kvinnliga frivilliga i denna fordonskontrollerade jämförelsestudie med delat ansikte. Enligt medicinska bedömningar visade försökspersonerna blandade hudtyper (torr, normal, fet och kombinerad hud). 34 försökspersoner (39–66 år, medelålder: 56,2 år) fullföljde studien och ingick i analysen. Avhoppen orsakades av tekniska problem och bristande efterlevnad (åtta försökspersoner), samt inkompatibilitetsreaktioner (ett ämne, orsakat av fordons- och bakuchiolbehandling).

Två veckor före studiens början och under hela studieperioden krävdes frivilliga att avstå från att använda självbruningsprodukter eller intensiva kosmetiska ansiktsbehandlingar (t.ex. borttagning av ytliga hudlager). Under 10-dagens förkonditioneringsperiod och under hela studien ombads försökspersonerna att avstå från att utföra permanent makeup, ögonfrans- och ögonbrynsbehandlingar, ögonmasker och plåster. Tre dagar före den första bedömningen ombads försökspersonerna att avstå från att använda ansiktsvårdsprodukter. Kvällen före den schemalagda betygsättningen krävdes försökspersonerna att sluta använda dekorativa kosmetika.

Under de första 7 dagarna av 10-dagens förkonditioneringsfas fick försökspersonerna en krämburk innehållande studiebärarkrämen (saknade någon information om innehållet) och applicerade den två gånger dagligen i hela ansiktet. Vid baslinjen utförde frivilliga en självgradering. I synnerhet bedömde de visuellt det övergripande utseendet på deras ansiktshud genom att observera dess fräschör och lyster samt eventuella tecken på hudens åldrande. Därigenom applicerades en visuell analog skala från 1 (mycket trött, åldrad) till 10 (mycket fräsch, inga tecken på åldrad hud). Sedan fick försökspersonerna två förblindade krämburkar innehållande verum (fordon som innehöll 0,5 procent bakuchiol) respektive vehikeln, utan någon specifikation på innehållet. Under studieperioden på 12 veckor behandlades en ansiktssida två gånger dagligen med verum medan den andra ansiktssidan behandlades två gånger dagligen med vehikeln. Tilldelningen av behandlingar till testplatserna permuterades. Efter 12 veckors regelbunden användning utförde frivilliga återigen självgraderingen enligt ovan.

Statistisk analys

Statistiska analyser utfördes med hjälp av Microsoft Excel för Office 365 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA), SAS Software Package för Windows V9.4 (SAS Institute GmbH, Heidelberg, Tyskland) och GraphPad Prism V8 (GraphPad Software, San Diego , Kalifornien, USA).

Den normala fördelningen av data bedömdes med hjälp av ett Shapiro–Wilks test. Om normalfördelningen bekräftades utfördes en variansanalys med upprepad mätning (RM-ANOVA) med post hoc parvis jämförelse. Om normalitetshypotesen förkastades, utvärderades Blom-transformerade rangordningar av originaldata med hjälp av en RM-ANOVA med post-hoc parvis jämförelse, eller så bedömdes originaldata med hjälp av ett Wilcoxon teckenrankningstest. Alla statistiska tester var dubbelsidiga med en signifikansnivå på alfa=0.05.

RESULTAT

In vitro studier

Bestämning av antioxidativa effekter

För att analysera (i) antioxidativa effekter av bakuchiol och retinol utförde vi två olika analyser med DPPH som detektormolekyl.

Antioxidativ förmåga

Den antioxidativa kapaciteten bestämdes genom att mäta minskningen av DPPH via dess absorptionssönderfall. Högstandard Trolox visade en signifikant förhöjd antioxidativ kapacitet i förhållande till kontrollen (p=0.0000 för alla angivna tidpunkter) vilket verifierade korrekt mätning (Figur 2a). När det gäller kontrollen var absorbansen i bakuchiolbehandlade prover också signifikant reducerad vid alla undersökta tidpunkter (10 min: p=0.0003, 30 och 60 min: p=0.0000 ) som visar en ökad antioxidativ kapacitet. Däremot visade Retinol ingen signifikant antioxidativ kapacitet jämfört med kontrollen.

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】