Nc886, ett icke-kodande RNA, är en ny biomarkör och epigenetisk förmedlare av cellulär senescens i fibroblaster

Abstrakt:

Funktionella studier av organismer och mänskliga modeller har visat att epigenetiska förändringar kan påverka åldrandeprocessen avsevärt. Icke-kodande RNA (ncRNA), en av de epigenetiska regulatorerna, spelar en viktig roll för att modifiera uttrycket av mRNA och deras proteiner. Det kan förmedla fenotypen av celler. Det har rapporterats att nc886 (=vtRNA2-1 eller pre-miR-886), ett långt ncRNA, kan undertrycka tumörbildning och fotoskador av keratinocyter orsakade av UVB. Denna studie syftade till att bestämma rollen för nc886 i den replikativa senescensen av fibroblaster och avgöra om substanser som kan kontrollera nc886-uttryck kunde reglera cellulär senescens. I replikativa senescensfibroblaster minskade nc886-uttrycket medan metylerad nc886 ökades.

Det fanns förändringar i senescensbiomarkörer inklusive SA{0}}gal-aktivitet och uttryck av p16INK4A och p21Waf1/Cip1 i senescerande celler. Dessa fynd indikerar att minskningen av nc886 associerad med åldrande är relaterad till cellulär senescens av fibroblaster och att ökande nc886-uttryck har potential att undertrycka cellulär åldrande. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) ökade nc886-expression och förbättrade cellulär senescens av fibroblaster genom att hämma åldersrelaterade biomarkörer. Dessa resultat indikerar att nc886 har potentialen som ett nytt mål för anti-aging och att ATC kan vara en potent epigenetisk anti-aging ingrediens.

Åldrande är den progressiva processen av funktionell och organisk nedgång som inträffar hos alla individer över tiden. Många faktorer påverkar åldrandet och olika sociala faktorer, ekonomi, sjukdomar, näring, ärftlighet, miljö och mentala tillstånd spelar alla en viss roll. Mekanismen för åldrande är mycket komplex, och de mer representativa åldrandeteorierna inkluderar huvudsakligen cellmutationsteori, DNA-skadeteori, mitokondrieskadeteori, telomerteori, teori om fria radikaler, teori om icke-enzymglykosylering, teori om immunfunktionsförändring och teori om neuroendokrin åldrande. . Vårt land är rikt på traditionell kinesisk medicin, vilket ger en grund för oss att hitta överlägsna tillsatser för att fördröja hudens åldrande.

Till exempel, i forskningen fann man att Cistanche deserticola har anti-aging effekter. Den anti-aging effekten av Cistanche deserticola tillskrivs främst aminosyrorna och polysackariderna i den. Aminosyra är ett viktigt näringsämne för människokroppen, som kan syntetisera protein och bibehålla kroppens normala ämnesomsättning. I Cistanche deserticola är innehållet av aminosyror mycket högt. Dessa aminosyror kan ge energi åt kroppens celler och främja ny ämnesomsättning, vilket är fördelaktigt för reparation och förnyelse av celler.

Klicka cistanche deserticola tilläggsprodukt

Nyckelord:

fibroblaster; replikativ senescens; epigenetisk reglering; nc886; grönt te extrakt.

1. Introduktion

Cellulär åldrande i ett irreversibelt tillstånd efter cellproliferationstopp har dykt upp som en potentiellt viktig bidragande orsak till vävnadsdysfunktion och åldrande av organismer [1]. Åldrande kännetecknas av hög aktivitet av åldringsassocierat beta-galaktosidas (SA- -gal), ökat uttryck av åldringsbiomarkörer såsom p16INK4A och p21Waf1/Cip1 och minskat uttryck av LaminB1 [2]. Det finns två grundläggande typer av cellulär senescens: replikativ senescens och stressinducerad för tidig åldrande. Replikativ senescens definieras som fenomenet när normala celler slutar dela sig efter att ha nått ett begränsat antal delningar. Det är relaterat till kronologiskt åldrande. Kontinuerlig skadeackumulering kan inducera replikativ senescens av fibroblaster, vilket leder till förlorad förmåga att omforma och organisera den extracellulära matrisen (ECM). Huvuddragen hos den åldrade dermis är en minskad mängd kollagenfibrer och ökad produktion av matrismetalloproteinaser (MMP), som bidrar till en tunn och oorganiserad struktur i dermis [3,4].

Epigenetiska regleringsmekanismer är viktiga förmedlare av åldrandeprocessen och anpassar sig till stressfaktorer och åldersrelaterade förändringar i den genomiska och molekylära miljön. Dessa epigenetiska förändringar inträffar på olika nivåer, inklusive massiv kärnhistonreduktion, deformation av histon genom posttranslationell modifiering och DNA-metylering, ersättning av kanoniska histoner med histonvarianter och förändrat uttryck av icke-kodande RNA (ncRNA) under organismal och replikativ senescens [5 ,6]. nc886 är 101 nukleotider långt ncRNA som kan binda till ett målprotein, vilket förmedlar proteinets aktivitet och kontrollerar genuttryck [7]. nc886 har också föreslagits som en tumörsuppressor till stor del härledd av dess uttrycksmönster och dess genomiska placering på human kromosom 5q31, platsen för tumörsuppressorgenen. En egenskap hos nc886-uttryck är den frekventa tystnaden av maligniteter genom CpG-DNA-metylering i promotorregionen [8]. Baserat på tidigare studier har vi funnit att minskningen av nc886-uttryck orsakad av UVB-bestrålning är associerad med ökningar av COX-2 och MMP-9 genom proteinkinas-RNA-aktiverad (PKR)-väg i keratinocyter och att främjande av nc886-uttryck kan vara en användbar strategi för att utveckla UVB-skyddsmaterial [9,10].

Grönt te har studerats som en behandling för en mängd olika dermatologiska tillstånd, såsom akne, rosacea, psoriasis, virala vårtor och till och med hudcancer. Fenoliska föreningar inklusive gallsyra (GC) och epigallokatechingallat (EGCG) är välkända aktiva föreningar i grönt te. (-)-Epigallocatechin-3-(3"-O-methyl) gallate (3" Me-EGCG) är en unik O-metylerad form av EGCG och finns i oolongte och grönt te. I synnerhet Jangwon No. 3 (Amorepacific varianter av grönt te) innehåller mer 3" Me-EGCG än andra sorter av grönt te [11]. 3" Me-EGCG har rapporterats uppvisa antioxidant- och fotoskyddande effekter på keratinocyter [12] . I den här studien undersökte vi rollen av nc886 i den replikativa senescensen av fibroblaster och fastställde om högkoncentrerat grönt te 3" Me-EGCG-preparat (AbsoluTea Concentrate 2.0) som kan öka nc886-uttrycket kan förbättra cellulär åldrande.

2. Resultat

2.1. Kemisk profil för AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC)

Den kemiska profilen för AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) visas i figur 1B. Resultat erhölls med användning av HPLC för ATC framställda enligt beskrivningen i metodavsnittet. ATC innehöll 30 procent eller mer 3" Me-EGCG (Figur 1B). Det är känt att grönt teextrakt inte innehåller 3" Me-EGCG eller visar en koncentration på mindre än 6 procent [13,14]. Både unga och senescenta fibroblaster behandlade med ATC visade mer ökningar i nc886-uttryck än de som behandlades med 70 procent etanolextrakt av grönt te (kompletterande figur S1A). Dessutom minskade uttrycksnivåerna för SA- -gal i åldrande fibroblaster behandlade med ATC mer än i de som behandlades med extrakt av grönt te (kompletterande figur S1B).

2.2. nc886 Reglerar cellulär senescens hos fibroblaster

För att observera rollen av nc886 i den cellulära senescensen av fibroblaster, använde vi en replikativ senescensmodell genom odling och subkultur. Som visas i tilläggsfigur S2 ökade aktiviteten hos SA- -gal och expressionsnivåer av senescenta markörer p16INK4A och p21Waf1/Cip1 och Lamin B1-expression minskade i åldrande fibroblaster jämfört med unga celler. Många tidigare studier har rapporterat att åldrande orsakas av oxidativ stress. För att bekräfta om denna serie av oxidativ stress är involverad i cellulär senescens, mättes ROS-nivåer i unga (p3) och senescenta fibroblaster (p30). Resultaten visade att ROS-nivåerna ökade med åldrandet (kompletterande figur S2D). För att observera den potentiella effekten av nc886 på cellulär senescens i fibroblaster, bestämdes nc886-genexpressionsnivån i varje antal passager. Nivån av nc886-uttryck minskade med ökande passageantal (Figur 2A).

Det har rapporterats att nc886-uttryck minskar med metyleringen av CpG-öar. För att bestämma om nc886-nedreglering i åldrande fibroblaster medierades genom metylering av nc886, utfördes en metyleringsspecifik PCR. Som visas i figur 2A ökade metyleringen av nc886 med ett ökande antal passager (figur 2A). Detta resultat visar att det minskade uttrycket av nc886 i ett högt passageantal av fibroblaster beror på en ökning av nc886-DNA-metylering. För att verifiera rollen av nc886 i fibroblaståldring, bestämdes förändringar i åldrande markörer i nc886-överuttryck och knock-down-modeller. Resultaten visade att gruppen av åldrande fibroblaster med nc886-överuttryck visade minskad SA-beta-gal-aktivitet, minskade uttrycksnivåer av p16INK4A och p21Waf1/Cip1 och ökade nivåer av laminB1. Dessutom minskade ökningen av ROS i senescenta fibroblaster genom nc886-överuttryck (Figur 2B). Omvänt, i gruppen av unga fibroblaster med nc886 knock-down, accelererades cellulär senescens och expressionsnivåer av cellulära senescerande markörer som p16INK4A och p21Waf1/Cip1 ökade (Figur 2C). Dessa resultat tyder på att nc886 kan reglera den cellulära senescensen av fibroblaster genom att reglera uttrycket av senescensmarkörer (Figur 2B, C).

2.3. ATC mildrar cellulär åldrande genom att reglera nc886-uttryck

Resultat som erhållits ovan visade att ökande nc886-uttryck kunde förbättra cellulär åldrande genom att förmedla åldringsmarkörer. För att observera effekten av ATC på nc886-uttryck utvärderades expressionsnivå och metylering av nc886 i åldrande fibroblaster efter behandling med ATC vid en icke-cytotoxisk koncentration (Figur 3A). Såsom visas i figurerna 3B och C ökade ATC signifikant nc886-uttryck och minskade metylering av nc886 på ett koncentrationsberoende sätt. Detta resultat visade att ökningen av nc886-uttryck av ATC medierades genom inhibering av nc886-metylering. Dessutom observerade vi att ATC hämmade SA- -gal-aktivitet och minskade expressionsnivåer av senescenta markörer p16INK4A och p21Waf1/Cip1 i senescenta fibroblaster (Figur 3D, E). Emellertid ökade uttrycket av LaminB1 som är känt för att minska med åldrandet i åldrande fibroblaster behandlade med ATC (Figur 3E). Dessa resultat visar att ATC kan mildra cellulär senescens genom att öka nc886-uttryck.

2.4. ATC reglerar åldersrelaterade förändringar av ECM och SASP

Ett kännetecken för fibroblaståldring är att aktiviteten hos MMP-1, en komponent som bryter ned kollagen, ökar, medan kollagensyntesen minskar [15,16]. Ökningen av MMP -1 och minskningen av kollagen bekräftades i åldrande fibroblaster med höga passagetal (Figur 4A). ATC undertryckte dock uttrycket av MMP-1 och ökade kollagensyntesen i åldrande fibroblaster. Detta resultat indikerar att ATC kan förbättra åldersrelaterad förändring av ECM genom reglering av MMP-1-uttryck och kollagensyntes i senescenta fibroblaster (Figur 4B). En senescensassocierad sekretorisk fenotyp (SASP) där åldrande celler utsöndrar specifika pro-inflammatoriska faktorer, tillväxtfaktorer och proteolytiska enzymer har rapporterats bidra till uppkomsten och progressionen av åldranderelaterade sjukdomar [17-19]. Vi observerade effekten av ATC på SASP, särskilt pro-inflammatoriska cytokiner som IL-1, IL_6 och IL-8. Som visas i figur 4C nedreglerade ATC uttrycksnivåerna för åldringsinducerad IL-1, IL-6 och IL-8. Detta tyder på att ATC kan utöva en anti-aging effekt genom att undertrycka SASP.

3. Diskussion

Åldrande celler genomgår karakteristiska morfologiska förändringar som involverar förstorad och ofta oregelbunden kärn- och kromatinomorganisation. När senescens induceras av DNA-skada, replikationsutarmning eller onkogenexpression, går Lamin B1 i första hand förlorad. Olika interna eller externa stressfaktorer kan utlösa DNA-skaderespons (DDR)-vägen för att aktivera p53- och/eller p16INK4A-vägen. p16INK4A kan inaktivera Cdk4/6, resultera i ackumulering av fosforylerad pRb, störa regleringen av E2F-transkriptionsfaktorn och inducera cellcykelstopp eller senescens [20,21]. Ökad produktion av reaktiva syrearter (ROS) som oftast produceras av dysfunktionella mitokondrier kan leda till cellulär senescens genom DNA-skada och transaktivering av senescenssignalvägar, inklusive p53, p16INK4A och p21Waf1/Cip1 [22].

I denna studie fann vi att nc886-uttryck minskade med ökande passageantal och att uppreglering av nc886-uttryck mildrade cellulär senescens via förmedling av LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 och ROS-produktion. nc886 transkriberas av RNA-polymeras III (Pol III) och tystas av CpG DNA-hypermetylering i många maligniteter [8]. Vi observerade att uttrycket av nc886 minskade med metylering av CpG-öar i åldrande fibroblaster. Detta resultat indikerar att hypermetylering av CpG-öar försämrar funktionaliteten hos nc886 som en suppressor av cellulär senescens.

Specifika genuttrycksvägar som påverkas av nc886 är oklara. De kommer sannolikt att inkludera tidigare rapporterade för andra ncRNA. nc886 kan spela kritiska roller i cellulär senescens genom att direkt eller indirekt förmedla senescenssignaleringsvägen vid nivåer av kromatinstruktur, transkriptionsfaktoraktivitet, post-transkriptionell och posttranslationell genreglering [23]. Till exempel kan nc886 förmedla den åldrande vägen för cellcykelprogression. Det har rapporterats att AK156230 som ett ncRNA är associerat med induktionen av replikativ senescens av fibroblaster genom dess roller i autofagi och cellcykelprogression. Nedreglering av AK156230 inducerade celler för att visa senescenssvar genom att aktivera p53 och p21 samtidigt som cyklinberoende kinas 1 (CDK1) minskade [24]. Åldringsassocierad ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1 och MIAT är kända som negativa regulatorer av cellulär senescens. De minskar i åldrande fibroblaster. Nedreglering av dessa gener kan leda till ökningar av senescensmarkörer som SA-gal, p16, p21 och p53 [25]. Effekten av MALAT1 på cellulär senescens uppnåddes genom nedgången av onkogen transkriptionsfaktor b-Myb/Mybl2.

Även om uttrycket av olika ncRNA påverkas under åldrande, är endast ett fåtal funktionellt involverade i åldrande. Eftersom lokalisering av ncRNA är viktigt för att förstå de mekanismer som är involverade i funktion, diskuteras nukleära och cytoplasmatiska ncRNAs separat när man beskriver de molekylära mekanismer som påverkar åldrande [26]. Det ncRNA som finns i cytoplasman kan fungera som en translationsregulator genom basparning med mål-mRNA [27]. ncRNA kan påverka proteinuttrycksnivåer genom att öka eller minska mRNA-stabiliteten [28].

Till exempel, under RAS-inducerad senescens, bidrar cytoplasmatisk UCA1 till p16 mRNA-stabilisering genom att sekvestrera hnRNPA1 [29]. nc886 innehåller ett proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) bindningsställe. PKR-nc886-bindning kan hämma PKR-aktivitet. PKR, en cytoplasmatisk receptor för dubbelsträngat RNA (dsRNA), regleras av serin/treoninproteinkinas som aktiveras av infektion, cytokiner, oxidativ stress och bestrålning (inklusive UV), vilket leder till efterföljande induktion av inflammation och apoptos [20 ,21] [30,31]. nc886 binder till PKR med en affinitet jämförbar med dsRNA och förhindrar att PKR aktiveras. nc886 knockdown resulterar i fosforylering av eukaryotisk initieringsfaktor 2-subenhet (eIF2) via PKR-vägen, vilket orsakar celldöd och hämmar global cellulär proteinsyntes. Det har rapporterats att produktionen av COX-2, IL-8 och MMPs av TNF- medieras av PKR-vägen i humana kondrocyter [32]. I en tidigare studie har vi också visat att UVB-inducerad inflammation kan regleras genom nc886-PKR-vägen i keratinocyter [10].

Dessutom är PKR relaterat till oxidativ stress-inducerad skada i neonatala hjärtmyocyter. Hämning av PKR skyddar mot H2O2-inducerad skada genom att dämpa apoptos och inflammation [33]. Inflammation och oxidativ stress är viktiga faktorer som inducerar åldrandeprocessen. Således kan PKR-vägen förmedla den cellulära senescensen av fibroblaster inducerad av nc886-utarmning. För att belysa den detaljerade regleringsmekanismen som är involverad i effekten av nc886 på cellulär senescens av fibroblaster, behövs ytterligare studier.

De antiåldrande effekterna av grönt teextrakt har rapporterats allmänt i tidigare studier. Grönt tes antioxidant och antiinflammatoriska aktiviteter är välkända mekanismer som bidrar till dess anti-aging effekt. I ett preliminärt test fann vi att ATC ökade uttrycket av nc886 avsevärt med mer än 70 procent etanolextrakt av grönt te (Supplement Figur S1A). Detta resultat tyder på att koncentrerade katekiner inklusive 3" Me-EGCG kan tillskriva uppregleringen av nc886-uttryck. För att avgöra om det nc886-stimulerande medlet kunde förhindra cellulär åldrande, observerade vi effekten av ATC på åldrande fibroblaster. ATC ökade uttrycket av nc886 med hämmar nivån av metylering av nc886-genen i åldrande fibroblaster (Figur 3B, C). ATC lindrade också cellulär åldrande genom att förmedla åldrande biomarkörer såsom SA- -gal-aktivitet, LaminB1, p16INK4A och p21Waf1/Cip1E (Figure 3EG) ).

Dessutom återställdes ökad MMP-1 och minskad kollagenproduktion inducerad av cellulär senescens av ATC (Figur 4B). SASP-faktorer varierar något beroende på typ av cell och typen av åldrande-inducerad stress, de är allmänt kända som målgener för NF-KB som reglerar pro-inflammatoriska cytokiner som IL-6 och IL{{6} }. I denna studie bekräftade vi att det ökade uttrycket av IL-1, IL_6 och IL-8 i senescentceller undertrycktes av ATC (Figur 4C). Vi kan inte utesluta möjligheten att den förbättrande effekten av grönt te på cellulär senescens uppnås genom flera mekanismer, inklusive nc886-reglering, antioxidation och antiinflammation. Våra resultat tyder dock på att ökad nc886 av ATC spelar en kritisk roll i undertryckandet av cellulär senescens, vilket därefter påverkar ECM-produktionen av fibroblaster.

4. Material och metoder

4.1. Förberedelse av ATC

Torkade gröna teblad (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon nr. 3) som användes för den aktuella studien erhölls från teplantor som odlats i Dolsongi teträdgård (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Sydkorea. Torra teblad (170 g) extraherades med 70 % EtOH (v/v) vid rumstemperatur under 16 timmar. Extraktet pulveriserades sedan med användning av en lyofilisator (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Kina). För att framställa ATC koncentrerades EtOH-extraktet tio gånger med en rotationsindunstare och laddades på en kolonn packad med AB-8-harts (innerdiameter 5 cm, längd 45 cm). Lösningsmedelseluering av kolonnen utfördes med 4 gånger bäddvolymen (BV) av 20 procent, 30 procent och 100 procent EtOH (volym/volym). I denna studie avlägsnades resterande lösningsmedel i kolonnen med en luftkompressor före eluering. 30% EtOH-eluatet koncentrerades tjugofaldigt och applicerades på en polyamidkolonn (innerdiameter 2,5 cm, längd 40 cm). Polyamidkolonnen eluerades 5 gånger BV med 10 procent och 100 procent EtOH. 100 % EtOH-eluatet koncentrerades försiktigt och lyofiliserades.

4.2. Cellodling och cellbehandling med ATC

Humana dermala fibroblaster (HDF) köptes från ATCC (Manassas, VA, USA). Cellodling utfördes under kontrollerade förhållanden vid 37 ◦C med 5 procent CO2 med Dulbeccos modifierade Eagles medium (WELGENE, Daegu, Korea) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) och 1 procent penicillin -streptomycin (WELGENE, Daegu, Korea). Celler såddes i 6-brunnsplattor med en densitet av 2 x 105 celler/platta. Efter att ha nått 60 procent sammanflöde, behandlades de med den angivna koncentrationen av ATC i 72 timmar.

4.3. SA- -Galfärgning och flödescytometrianalys

Celler färgades med en SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japan) enligt tillverkarens instruktioner. Celler analyserades med ett EVOS® FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) och en BD FACS Calibur flödescytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.4. Intracellulär ROS-mätning

Produktionen av intracellulär ROS övervakades med C20,70 -diklordihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA; Molecular Probes), en fluorescerande ROS-indikator. Celler inkuberades med H2DCFDA (5 µM) i 30 minuter vid 37 ◦C. Cellassocierad fluorescens detekterades med en BD FACS Calibur flödescytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.5. Realtids-PCR och metyleringsspecifik PCR

Totalt RNA extraherades med användning av TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kvantitativ mätning av RNA utfördes med användning av en Epoch mikroplatta spektrofotometer (BioTek, Winooski, VT, USA). cDNA syntetiserades med användning av en am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Genomiskt DNA extraherades med hjälp av AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Korea). Bisulfitomvandling utfördes med användning av EZ DNA-metyleringskit (Zymo Research, CA, USA). För att utföra qRT-PCR användes ett AMPIGENE® cDNA Synthesis Kit (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, USA) och ett ABI7500 realtids-PCR-system (Ambion Inc, Austin, TX, USA). Primersekvenser som används i denna studie beskrivs i Tabell 1.

4.6. Laktatdehydrogenasanalys

LDH-analys användes för att bestämma cytotoxiciteten genom att mäta laktatdehydrogenas-aktivitet (LDH) frisatt från skadade celler. Analysen utfördes med användning av ett LDH Cytotoxicity WST Assay-kit (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) enligt tillverkarens instruktioner.

4.7. DNA-transfektion för nc886-överuttryck och siRNA-transfektion för nc886 Knockdown

För att erhålla DNA för överuttryck av nc886 i celler amplifierades DNA med AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Korea) med användning av genomiskt DNA från HDF som mall och följande primrar som beskrivs i Tabell 2.

4.8. Western Blotting

Cellysat framställdes med PRO-PREP™ Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Korea). Totala proteiner separerades med ett NuPAGE-elektroforessystem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) och överfördes till polyvinylidendifluorid (PVDF)-membran. Immunoblotting utfördes med användning av primär antikropp mot p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), MMP1, Col1A2 och -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Skannade densitometriska värden för band analyserades med hjälp av ImageJ, mjukvaruversion 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Enzymkopplad immunosorbentanalys

Efter indikerad inkubation mättes kollagen (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan) och MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) i kultursupernatant med användning av den enzymkopplade immunosorbentanalysen (ELISA) kit enligt tillverkarens instruktioner.

4.10. Statistisk analys

Alla resultat presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Skillnader mellan de två grupperna utvärderades genom t-test eller variansanalys (ANOVA) med GraphPad Prism. Statistisk signifikans indikerades som antingen p < 0.05 eller p < 0,01.

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis kan reglering av nc886-uttryck vara ett potentiellt mål för cellulär senescens i fibroblaster, och ATC kan vara en potent epigenetisk ingrediens mot åldrande.

Författarbidrag:

Konceptualisering, YK, KH och EJ; metodik YK, HJ, N.-HP och K.-SL; datakurering, YK, HJ och EC; undersökning, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP och EJ; projektadministration, WP, DP och EJ; resurser, WP och DP; övervakning, DP och EJ; skrift— originalutkast, YK; skriva – granskning och redigering, N.-HP, KH, WP, DP och EJ Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:

Denna forskning fick ingen extern finansiering.

Uttalande av institutionell granskningsnämnd:

Inte tillämpbar

Informerat samtycke:

Inte tillämpbar.

Datatillgänglighetsförklaring:

Data kommer att göras tillgängliga på begäran.

Intressekonflikt:

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Cellulär åldrande: När dåliga saker händer med bra celler. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Åldrande: Tillvägagångssätt mot dess kontroll. Drug Discov. Idag Ther. Strategi. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Mekanismer för fotoåldrande och kronologisk hudåldrande. Båge. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Kännetecknen för fibroblaståldring. Mech. Aging Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Epigenetik av åldrande och åldrande-relaterad sjukdom. J. Gerontol. En Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Genetik och epigenetik för åldrande och livslängd. Cellcykel 2014, 13, 1063-1077. [CrossRef] 7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, ett nytt icke-kodande RNA som är undertryckt i cancer, associeras med PKR och modulerar dess aktivitet. RNA 2011, 17, 1076-1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Song, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. Epigenetisk reglering av RNA-polymeras III-transkriptioner i tidig brösttumörbildning. Oncogene 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Jag, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, ett icke-kodande RNA, hämmar UVB-inducerat MMP-9- och COX-2-uttryck via PKR-vägen i humana keratinocyter. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Inhibition of UVB-induced inflammation by Laminaria japonica Extract via Regulation of nc886-PKR Pathway. Näringsämnen 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Identifiering av epigallocatechin-3-O-(3-Ometyl)-gallat (EGCG300Me) och aminosyraprofiler i olika tesorter (Camellia sinensis L.). Datakort. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Antioxidant och cytoskyddande effekter av (-)-Epigallocatechin-3-(300-O-methyl) Gallate. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Effekter av grönt teextrakt på överviktiga och feta kvinnor med höga nivåer av lågdensitet-lipoprotein-kolesterol (LDL-C): En randomiserad, dubbelblind och cross-over placebokontrollerad klinisk prövning. BMC komplement. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Orala interaktioner mellan ett grönt te-flavanolextrakt och rödvinsantocyaninextrakt med hjälp av en ny cellbaserad modell: Insikter om effekten av olika orala epitel. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Krizhanovsky, V. ECM-vägen för åldrande i åldrande: Komponenter och modifierare. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Chronic Resveratrol Treatment förbättrar cellvidhäftning och mildrar den inflammatoriska fenotypen i åldrande mänskliga fibroblaster. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Sun, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Senescensassocierade sekretoriska fenotyper avslöjar cellicke-autonoma funktioner hos onkogen RAS och p53-tumörsuppressorn. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Cellulär senescens och den senescenta sekretoriska fenotypen: Terapeutiska möjligheter. J. Clin. Undersök. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Cellulär senescens: Från fysiologi till patologi. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. En väsentlig funktion av histondeacetylas 1 i proliferationskontroll och CDK-hämmarerepression. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Rollen av matrismetalloproteinaser i åldrande: vävnadsremodellering och vidare. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, S.; Passos, JF Detektering av reaktiva syrearter i åldrande celler. Metoder Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs regulatoriska nätverk i cellulär ålderdom. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MIN; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Identifiering av lncRNA, AK156230, som en ny regulator av cellulär senescens i musembryonala fibroblaster. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Wood, WH, 3:a; Becker, KG; et al. Ålderdomsassocierade lncRNA:er: Ålderdomsassocierade långa icke-kodande RNA. Aging Cell 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Framväxande roller av lncRNAs i åldrande. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Långt icke-kodande antisens-RNA kontrollerar Uchl1-translation genom en inbäddad SINEB2-upprepning. Naturen 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Kontroll av somatisk vävnadsdifferentiering genom den långa icke-kodande RNA TINCR. Naturen 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Koordinerad kontroll av senescens av lncRNA och ett nytt T-box3 co-repressorkomplex. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Lamin B1-förlust är en åldringsassocierad biomarkör. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: En kinas att komma ihåg. Främre. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL PKR-aktivering orsakar inflammation och MMP-13-utsöndring i mänskliga degenererade artikulära kondrocyter. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Män, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Hämning av PKR skyddar mot H2O2 -inducerad skada på neonatala hjärtmyocyter genom att dämpa apoptos och inflammation. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 och Eunsun Jung 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com