NGF modulerar kolesterolmetabolism och stimulerar ApoE-sekretion i gliaceller som ger neuroskydd mot oxidativ stress Del 1

Abstrakt:

Kolesterol spelar en avgörande roll i hjärnan, där astrocytisk aktivitet särskilt reglerar ämnesomsättningen. Vuxna neuroner undertrycker faktiskt deras kolesterolbiosyntes och importerar denna sterol genom ApoE-rika partiklar som utsöndras från astrocyter. Nya bevis tyder på att nervtillväxtfaktor (NGF) kan utöva neurotrofisk aktivitet genom att påverka cellmetabolism.

Neuroner är de grundläggande enheterna som utgör den mänskliga hjärnan. Genom kopplingarna mellan neuroner bildar de vår hjärnbark, som bär all vår kunskap och minnen. Därför är neuroner nära besläktade med minnesförmåga.

Neuronernas huvudsakliga funktion är att överföra information. Varje neuron har en synaps, som förbinder dendriterna och axonerna hos andra neuroner. När en neuron tar emot en signal skickar den signalen till neuronerna som den är ansluten till. Denna signalering, som kallas neuronal överföring, är en av nyckelprocesserna vid minnesbildning, lagring och hämtning.

Genom att hålla våra hjärnor friska kan vi främja att våra nervceller fungerar korrekt genom träning. Fysisk träning förbättrar blodcirkulationen och syretillförseln till hjärnan, vilket ökar antalet och kopplingarna av neuroner. Samtidigt kan olika sociala och lärande aktiviteter bilda nya neuroner i nya hjärnområden och öka hjärnans plasticitet.

När vi har fler, mer aktiva neuroner, blir vårt minne starkare. Synkroniseringen mellan neuroner i hjärnbarken blir jämnare, vilket gör det lättare för oss att lagra och hämta information, vilket förbättrar våra kognitiva förmågor. Dessutom kommer ett stort antal neuroner och kopplingar mellan neuroner också att förbättra vår reaktionshastighet och beslutsförmåga.

Därför går bibehållande av friska neuroner och förbättra minnet hand i hand. Vi kan förbättra vårt minne genom att främja friska nervceller genom att fokusera på fysisk träning, en mängd olika sociala och lärande aktiviteter och kostvanor. Låt oss arbeta tillsammans för att stödja vår hjärnhälsa! Det kan ses att vi behöver förbättra vårt minne. Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche deserticola är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial med många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av malet kött kommer från en mängd olika aktiva ingredienser som det innehåller, inklusive karboxylsyra, polysackarider, flavonoider, etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa genom olika kanaler.

Klicka på vet sätt att förbättra hjärnans funktion

Ändå har effekten av NGF på glial kolesterolhomeostas fortfarande inte klarlagts. Detta projekt syftar till att bedöma om NGF kan påverka kolesterolmetabolismen i gliaceller. Den astrocythärledda cellinjen U373 användes som en experimentell modell för att nå detta mål. Immunoblot och ELISA-analys visade att proteiner och enzymer som tillhör kolesterolmetabolismnätverket ökade vid NGF-behandling i gliaceller. Vidare ökade NGF signifikant ApoE-utsöndringen och mängden extracellulärt kolesterol i odlingsmediet.

Samodling och U373-konditionerade mediumexperiment visade att NGF-behandling effektivt motverkade rotenonmedierad cytotoxicitet i N1E-115 neuronala celler. Omvänt undertrycktes neuroskydd förmedlat av NGF-behandling när N1E-115 samodlades med ApoE-tystade U373-celler. Dessa data tyder på att NGF kontrollerar kolesterolhomeostas i gliaceller. Ännu viktigare är att NGF utövar neuroskydd mot oxidativ stress, sannolikt förknippat med induktion av glial ApoE-sekretion.

Nyckelord:

ApoE; astrocyt; kolesterol; differentiering; nervtillväxtfaktor; ämnesomsättning; nervcell; reaktiva syrearter; rotenon.

1. Introduktion

Hjärnan kännetecknas av den högsta mängden kolesterol i hela kroppen [1]. Den exceptionella koncentrationen av denna sterol i det centrala nervsystemet (CNS) motiveras av det faktum att kolesterol är involverat i flera grundläggande biologiska processer. Notera att en betydande mängd kolesterol integreras i plasmamembranen hos astrocyter och neuroner, där det definierar en korrekt cellulär morfologi och korrekt funktion av membranreceptorer och synaptisk neurotransmission [2].
Kolesterol är också viktigt för att bilda nya membran som krävs för neuritutväxt, synaptogenes och frisättning av neurotransmittorer, vilket är avgörande för neuronal differentiering och mognad [3-7].

I huvudsak härrör allt kolesterol i hjärnan från de novo biosyntes in situ. Specifikt förhindrar blod-hjärnbarriären (BBB) ​​kolesterolupptag som härrör från lipoproteiner som transporteras genom den systemiska cirkulationen [8]. Av denna anledning utvecklar nervceller ett föredömligt regulatoriskt nätverk för att självständigt hantera sin egen efterfrågan på denna lipid. En väl accepterad modell slår fast att efter embryogenes, under den postnatala perioden, sjunker kolesterolbiosyntesen dramatiskt i neuroner, med ett försök att spara energin som används för att generera aktionspotentialerna.

Följaktligen uppfyllde astrocyter de oseriösa neuronala kraven för kolesterol, vars syntes blir särskilt uttalad [1,9,10]. Leveransen av kolesterol producerat av astrocyter till neuroner innebär en elegant mekanism för horisontell transport, som involverar kritiska proteiner och partiklar. Närmare bestämt börjar kolesterolexport i astrocyter, där nysyntetiserat kolesterol laddas in i begynnande lipoproteinpartiklar som innehåller apolipoprotein E (ApoE). Ackumulerande bevis tyder på att lipideringen av ApoE-rika partiklar medieras av transportörens ATP-bindande kassett A1 (ABCA1) [11]. Därefter, när det väl släppts ut i det extracellulära utrymmet, tas ApoE-innehållande lipoprotein upp av neuroner genom receptormedierad endocytoslågdensitetslipoproteinreceptor (LDLr) och LDLr-relaterat protein 1 (LRP1) [12].

Enligt den centrala rollen av astrocythärlett kolesterol i neuronal homeostas, visade experimentella fynd att kolesterol som finns i ApoE-rika lipoproteiner signifikant förbättrar dendritdifferentiering och synaptisk funktion [13,14]. Accordinastrocyte-konditionerat medium från astrocyter från Huntingtons sjukdom (HD), som endast utsöndrar en blygsam mängd ApoE-lipoproteinbundet kolesterol, påverkar allvarligt neuritutväxt och synaptisk aktivitet i HD-neuroner [15].

Den neurotrofiska verkan av astrocythärledda ApoE-innehållande partiklar upprätthålls ytterligare av effekten av ApoE-brist, vilket markant hämmar neurogenes hos vuxna i hippocampus [16]. Astrocyt-neuronkolesterolöverhörning är också avgörande för neuroskydd mot oxidativ stress. Till exempel visar vissa rapporter att ApoE hindrar oxidativ skada och apoptos inducerad av väteperoxidexponering [17,18].

Från dessa observationer är upprätthållandet av kolesterolhomeostas i hjärnan nödvändigt för att garantera nervcellernas funktion, och de metaboliska vägarna som ligger till grund för regleringen av denna lipid bör kontrolleras fint för att bevara förekomsten av flera neurofysiologiska processer.

Under de senaste åren har neurotrofiner dykt upp som viktiga aktörer i cellmetabolism [2,19–22]. Neurotrofiner tillhör en liten familj av tillväxtfaktorer som har en obestridlig roll i neuronal utveckling, överlevnad och plasticitet [23]. På senare tid har dessa signalmolekyler också erkänts som avgörande modulatorer av cellmetabolism, inklusive kolesterolmetabolism [2,22].

Experimentella bevis visar att nervtillväxtfaktor (NGF), prototypmedlemmen i neurotrofinfamiljen, stimulerar kolesterolbiosyntes i neuronala celler och hepatocyter [24,25]. Intressant nog involverar dessa händelser, åtminstone delvis, neurotrofinreceptorn p75NTR med låg affinitet, som framkallar aktivering av det bindande proteinet för sterolreglerande element 2 (SREBP-2) och, i sin tur, inducerar transkriptionen av kolesterolrelaterad gener [25]. Aktiviteten av NGF på kolesterolmetabolism är inte begränsad till biosyntes, eftersom det också främjar kolesterolupptag genom att öka LDLr-uttrycket i neuroner [26].

Trots denna information verkar kunskapen om NGFs möjliga bidrag till regleringen av kolesterolhomeostas fortfarande vara särskilt begränsad. Noterbart är det en brist på systematiska studier som bedömer den roll som NGF spelar i regleringen av kolesterolmetabolism i astrocytiska celler. Med tanke på att kolesterol som produceras av astrocyter är avgörande för att garantera neuronal fysiologi, är det viktigt att förstå om det kan påverka kolesterolmetabolismen i gliaceller såväl som intercellulär kolesteroltransport, vars speciella reglering är absolut nödvändig för att säkerställa hjärnans hälsa.

På grundval av detta arbete är syftet att utforska NGFs framtida inblandning i moduleringen av kolesterolmetabolism i gliaceller, såväl som dess inverkan på neuronal differentiering och neuronal överlevnad under oxidativ stresstillstånd.

2. Resultat

2.1. U373 uttrycker både NGF-receptorerna TrkA och p75NTR

NGF identifierades initialt som en tillväxtfaktor med en specifik tropism för neuronala celler. Men ackumulerande bevis visar att detta neurotrofin också inducerar biologiska effekter i flera icke-neuronala celler och vävnader [22]. Aktiviteten av NGF säkerställs genom dess bindning till högaffinitetsreceptorn TrkAd till lågaffinitetsreceptorn p75NTR [2].

Sålunda konstaterade vi initialt om U373-celler uttrycker NGF-receptorer. Noterbart är U373 en astrocytomcellinje som ofta används som en astrocytcellodlingsmodell, eftersom flera rapporter indikerade att de återställer morfologiska, metaboliska och funktionella egenskaper hos astrocyter [27-29]. Enligt publicerade data [30] visade immunfluorescensanalys att U373-celler uttrycker både TrkA och p75NTR på avsevärda nivåer (Figur S1A). Dessa resultat bekräftades också av Western blot-analys, vilket tyder på att U373-celler har potential att vara helt känsliga för NGF.

Eftersom administreringen av NGF kan påverka uttrycksnivåerna för dess receptorer, vilket potentiellt förändrar balansen mellan signalvägar framkallade av TrkA och/eller p75NTR [31-33], kontrollerades uttrycket av båda receptorerna också efter 48 timmars NGF-behandling. Emellertid observerades inga förändringar i proteinmängden av både TrkA och p75NTR efter stimuleringen med neurotrofin (Figur S1B).

2.3. NGF ökar kolesterolutsöndringen med U373 till odlingsmediet

De erhållna resultaten fick oss att studera om effekterna medierade av NGF kunde återspegla moduleringen av kolesterolhalten. Oil Red O-färgning utfördes för att visualisera neutrala lipider, inklusive kolesterylestrar. Storleken och antalet lipiddroppar som hittades i U373-celler liknade de som rapporterats för primära astrocyter [34,35].

Emellertid observerades inga förändringar vid NGF-behandling (figur 2A och S2A, B). På liknande sätt upptäcktes inga förändringar i mängden fritt kolesterol, utvärderat genom filipinfärgning (figur 2B och S2C). Avsaknaden av signifikanta effekter på intracellulära kolesterolnivåer upprätthölls ytterligare av kolesterolenzymatisk analys, som visade att NGF inte förändrade innehållet av totalt kolesterol, fritt kolesterol och kolesterylestrar (Figur 2C).

Omvänt ökade mängden kolesterol (fritt, estrar och totalt) markant i odlingsmediet av U373-behandlad NGF (Figur 2D). När de utvärderas som en helhet indikerar dessa data att NGF främjar kolesterolextrudering genom att förbättra ABCA1--medierat utflöde av ApoE-innehållande partiklar.

Figur 1. NGF modulerar uttrycket av de huvudsakliga proteinerna involverade i kolesterolhomeostas i U373-celler och ökar ApoE-utsöndringen n i U373-odlingsmediet. (A–G) Representativ Western blot och densitometrisk analys av SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 och ApoE i U373-celler behandlade med vehikel (Ctrl) och NGF (100 ng) /ml) i 48 timmar. n=6 olika experiment.

Aktin och vinkulin användes som laddningskontroller. (H) Kvantifiering av ApoE-nivåer (µg/ml) med ELISA-analys i vehikel- och NGF-behandlat U373-odlingsmedium. n=3 olika experiment. Data representerar medelvärden ± SD. Statistisk analys bedömdes med ett enda oparat Studet-testtest. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

2.4. p75NTR är delvis involverad i de NGF-medierade effekterna på kolesterolproteinnätverket

Experimentella fynd visar att NGF påverkar kolesterolmetabolismen i leverceller genom aktivering av dess lågaffinitetsreceptor p75NTR [25]. För att testa om denna signalväg också kan bevaras i astrocytiska celler, behandlade vi U373 med LM11A -31, en liten ligand som fungerar som en specifik p75NTR-modulator. Denna förening aktiverar inte TrkA men, på samma sätt som NGF, framkallar induktionen av p75NTR nedströms signalvägar [36]. LM11A-31 efterliknade den NGF-medierade ökningen av HMGCR (Figur 3A).

Emellertid observerades inga förändringar i de andra proteinerna som är involverade i kolesterolmetabolism (Figur 3B–D), inte heller i mängden extracellulär ApoE (Figur 3E) och kolesterol (totalt, fritt och estrar) som frisätts i odlingsmediet (Figur 3F) ). Sammantaget indikerar dessa resultat att NGF-inducerat uttryck av HMGCR medieras av p75NTR-aktivitet, medan effekterna på NPC1, ABCA1, ApoE-sekretion och kolesterolextrudering sannolikt är beroende av andra transduktionsvägar, möjligen involverande TrkA.

Figur 2. NGF-effekter på neutrala lipider och kolesterolhalt. (A) U373-celler behandlades med vehikel (Ctrl) eller NGF (100 ng/ml) i 48 timmar och färgades sedan med Oil Red O för att visualisera det intracellulära innehållet av neutrala lipider. n=3 olika experiment. (B) Representativ bild av filipinfärgning utförd på U373-celler behandlade med vehikel (Ctrl) och NGF (100 ng/ml) i 48 timmar. n=3 olika experiment. (C) Kvantifiering av intracellulära kolesterolnivåer (totalkolesterol, fritt kolesterol och kolesterylestrar) i vehikel- och NGF-behandlade U373-celler. n=3 olika experiment. (D) Kolesterolkvantifiering (totalkolesterol, fritt kolesterol och kolesterylestrar) i odlingsmediet av U373-celler behandlade med vehikel (Ctrl) och NGF (100 ng/ml) i 48 timmar. n=3 olika experiment. Data representerar medelvärden ± SD. Statistisk analys utfördes genom att sjunga ett oparat Students t-test. ** sid<0.01.

Figur 3. Effekter av p75NTR-modulering med LM11A-31 på kolesterolmetabolism och sekretion. (A–D) Representativ Western blot och densitometrisk analys av HMGCR, ABCA1, NPC1 och ApoE i U373-celler behandlade med vehikel (Ctrl) och LM11A-31 (0.1 µM) i 48 timmar. n=4 olika experiment.

Vinkulin fungerade som ett hushållsprotein för att normalisera proteinbelastningen. (E) Kvantifiering av ApoE-mängd (µg/ml) genom ELISA-analys i odlingsmedium från vehikel- och LM11A-31-behandlade U373-celler. n=3 olika experiment. (F) Kolesterolkvantifiering (totalkolesterol, fritt kolesterol och kolesterylestrar) i odlingsmediet av U373-celler behandlade med vehikel (Ctrl) och LM11A-31 (0.1 µM) i 48 timmar. n=3 olika experiment. Data representerar medelvärden ± SD. Statistisk analys utfördes genom att använda ett enda oparat Studet-testtest. *** p < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com