Olivblad (Olea Europaea L) extrakt laddade lipidnanopartiklar: optimering av bearbetningsparametrar genom Box-Behnken Statistisk design, in vitro karakterisering och utvärdering av antioxidanter och antimikrobiell aktivitet Del 2
Jun 10, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
2.5.6 Stabilitetsutvärdering
Stabiliteten hos optimerad formulering (F9) undersöktes enligt riktlinjerna från International Council for Harmonization (ICH). SLN-dispersion togs i tre separata glasflaskor (10 ml i varje). Bland de tre flaskorna förvarades en i kylskåp (4 grader ±2 grader), den andra vid rumstemperatur (25±2 grader /60±5 RH procent RH), och den sista förvarades i en stabilitetskammare (Thermo) Scientific, Sverige) vid 40±2 grader /75±5 graders procent RH. Vid en specifik tidpunkt, nämligen 1,3,6 månader, togs proverna ut och undersöktes för vissa parametrar som partikelstorlek, infångningseffektivitet, zetapotential & PDI, etc, som bestämdes och jämfördes statistiskt med nolltidsdata (initial) . 2.5.7 Antioxidantaktivitet
En av de mest användbara metoderna för att upptäcka antioxidantpotential är 2,2-Diphenyl-1-Picryl-Hydrazyl-Hydrate free radikals(DPPH)-metoden2. Radikalfångande aktivitet (dvs. att analysera deras förmåga att rensa fria DPPH-radikaler) av OLP-SLN utvärderades spektrofotometriskt vid 517 nm. Antioxidantaktiviteten hos OLP, såväl som OPL-SLNs, bestämdes med hjälp av (DPPH)-metoden. Lösning av DPPH framställdes ({{10}},1 mM) i etanol. OLP-SLNs (motsvarande 0,2 mg/ml OLP) dispergerades i fosfatbuffert och lämnades i 24 timmar för att frigöra läkemedlet. En ekvivalent koncentration av OLP(0,2 mg/ml) och blanka SLN:er framställdes också i samma medium. I denna studie togs askorbinsyra med koncentrationen 0,2 mg/ml som standard och medan DPPH-lösning användes som kontroll.cistanche Australien3300 μL DPPH blandades i varje lösning av OLP-SLN (500 μL), blanka SLN och OLP-lösning (500 μL). Varje reaktionsblandning hölls i ett skakvattenbad vid 37±0,5 grader under 30 minuter under skyddade förhållanden från ljuset. Slutligen bestämdes absorbansen för varje prov med en UV-synlig spektrofotometer (Shimadzu 1800, Japan) vid 517 nm med användning av etanol som en blank. Varje experiment utvärderades tre gånger och värdena presenteras som medel ± SD. Värdet på antioxidantaktivitet i form av procentuell DPPH-fångande aktivitet bestämdes med följande formel (ekvation 2):
2.5.8 Antimikrobiell studie
Den antimikrobiella studien av OLP-laddade SLN (optimerad sats F9) utfördes genom att använda agarbrunnsdiffusionsmetoden. Bakteriestammar som Staphylococcus aureus (grampositiv) och Pseudomonas aeruginoza (gramnegativ) användes för utvärderingen ". Näringsagarplattor preparerades under sterila förhållanden och bakteriesuspension (100 μL, koncentration runt 10 grader FU/ mL） av varje bakterie placerades individuellt på varje steril näringsagarplatta med hjälp av sterila pinnar inkuberade vid 37±0,5 grader i 1 timme.cistanche fördelarFyra brunnar runt 8 mm diameter vardera producerades på varje platta med hjälp av en steril korkborr. Här användes tomma SLN, positiv kontroll (rent extrakt), fysisk blandning (OLP-extrakt plus blank), och SLN och optimerad OLP-SLN-beredning (100 μL) för den antimikrobiella studien och placerades i varje brunn . Plattorna inkuberades vid en temperatur av 37±0,5 grader. Vid förutbestämda tidpunkter (6,12,24 h) drogs plattorna ut och hämningszonerna runt väggarna mättes i mm med hjälp av ett skjutmått.
3. Resultat och diskussion
3.1 Preliminär screening och föroptimering av formlatenta variabler
The highest solubility of OLP was found to be in compri-to 888 ATO as depicted in Fig.1. The descending order of OLP solubility/100 gm in different lipid was compritol 188 ATO(36.93±4.92mg)>Precirol ATO 5(29.37±3.01 mg)>GMS(23.84±2.73mg)>palmitic acid(21.41±2.81 mg)>stearinsyra (16,25±1,65 mg). Compritol 888 ATO hade använts som en lipid för framställning av oralt baserade SLN för preparatet SLN.
Baserat på resultaten från den preliminära screeningstudien valdes tween 80 och compritol 888 ATO ut som ytaktivt medel respektive lipid. Andra parametrar som ett förhållande mellan läkemedel och lipid (1:3-1:6), koncentration av ytaktivt ämne (procent ,1.5-4,5 procent ) och homogeniseringshastighet (rpm, 3000-6000 rpm), homogeniseringstid (2 timmar), ultraljudstid (10 min) bestämdes genom att utföra de preliminära experimenten. Faktorer som ett förhållande mellan läkemedel och lipid (A), koncentration av ytaktivt ämne (B) och homogenisering (C) optimerades återigen genom att använda responsytmetodologi (RSM) i kombination med 3-faktorer och 3-nivåer BBD , och deras inverkan detekterades på beroende faktorer, nämligen partikelstorlek (Y1), infångningseffektivitet (Y2) och PDI(Y3).
3.2 Förberedelse av SLN och optimering av OLP-laddade SLNS
Värdena för föroptimerade parametrar enligt beskrivning
ovan monterades på BBD av expertdesign. Sammansättningen av totalt sjutton formuleringar undersöktes av BBD med 5 mittpunkter. Alla formuleringar utvecklades och värden för beroende parametrar som partikelstorlek, infångningseffektivitet och PDI undersöktes och anpassades vidare till BBD för att få det slutliga resultatet. Polynomekvationer och 3D-grafer genererades som visar påverkan av oberoende faktorer på beroende faktorer. Det positiva tecknet i polynomekvationen utforskade en positiv effekt och det negativa tecknet visade en negativ effekt på beroende variabler. Värdet av faktiska och förutspådda beroende variabler regressionsanalys och analys av variansdata för modeller presenteras i tabellerna 1, 2 respektive 3. Den kvadratiska modellen ansågs vara den bäst anpassade modellen för alla svar eftersom i detta fall det högsta värdet på regressionskoefficienten observerades.
3.3 Effekt av vissa parametrar på partikelstorlek (Y1)
Följande polynomekvation erhölls från BBD som indikerar effekten av olika oberoende faktorer på partikelstorlek (Y1):
Den ovan givna ekvationen visade att compritol 888 ATO visade en positiv effekt på partikelstorleken medan tween 80 och homogenisering uppvisade en negativ inverkan på partikelstorleken.
Här hade variablerna A, B, C, AB, BC och B" en signifikant effekt på partikelstorleken.cistanche kolesterolAt a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05)medan de återstående parametrarna visade sig vara signifikanta (s<0.0001)with adequate="" precision（="">4）（Tabell 3）.Baserat på R²
(0.9996)värde, den kvadratiska modellen ansågs vara den bäst anpassade modellen med adekvat signal (tabell 4).
Partikelstorleken för olika satser visade sig vara i intervallet 112.35-277.46 nm. Om andra variabler hölls konstanta, ökades partikelstorleken vid förbättring av förhållandet mellan läkemedel och lipid (tabell 1, sats F1 237.05 nm och F2 259.57 nm). Detta kan bero på aggregationen av partiklarna på grund av det otillräckliga ytaktiva medlet för att dispergera partiklarna. Å andra sidan uppvisade ytaktivt ämne (1.5-4.5 procent ) en negativ effekt på partikelstorleken (tabell 1, batch F1 237.05 nm och F3 112.35 nm ). Detta kan bero på en minskning av gränsytspänningen mellan vatten- och lipidfasen, vilket förhindrar partikelaggregation). Homogeniseringshastigheten uppvisade en negativ inverkan (tabell 1, sats F5 187.46 nm och F7 134.27 nm) på partikelstorleken på grund av genereringen av hög kraft som bryter partiklarna och därmed minskar partikelstorlek. Ekvation 3 indikerade att effekten av ytaktivt ämne (koefficientvärde -40.87) uppvisade en mer framträdande effekt på partikelstorleken jämfört med homogeniseringshastigheten (koefficientvärde -24.97).cistanche deserticola biverkningarFigur 2 undersökte inverkan av olika oberoende parametrar på partikelstorlek.
Cistanche kan anti-aging
3.4 Effekt av vissa parametrar på infångningseffektivitet(Y2)
Följande polymerekvation erhölls från BBD som visar påverkan av olika oberoende parametrar på infångningseffektiviteten:
Här hade variablerna A, B, C, AB, AC, BC, A och B² en betydande inverkan på infångningseffektiviteten. Vid ett 95-procentigt konfidensintervall var bristen på passform obetydlig (s<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabell 3). Den kvadratiska modellen (R²=0.9991) ansågs vara den bäst anpassade modellen med en adekvat signal (tabell 4).
Från ovanstående ekvation 4 observeras att lipid (compritol 888ATO) uppvisade en positiv effekt medan de återstående två parametrarna uppvisade en negativ inverkan på infångningseffektiviteten. Det ytaktiva ämnet (koefficientvärde -7.23) hade en mer framträdande effekt jämfört med homogeniseringshastigheten (koefficientvärde -5.76). Den positiva effekten av lipid på infångningseffektiviteten (Tabell 1, batch F1 och F2) berodde på tillgången på mer lipid för anpassning av tillgängliga läkemedel. En varierande effekt observerades på infångningseffektiviteten. I det inledande skedet, vid ökning av det ytaktiva medlet, ökades värdet av infångningseffektiviteten, men vid ytterligare ökning av det ytaktiva medlet, minskade det på grund av läckage av läkemedlet i den yttre miljön (tabell 1, sats F1 och F3). Homogeniseringshastigheten uppvisade en negativ effekt på infångningseffektiviteten på grund av mer skjuvkraft som kan vara orsaken till utstötningen av läkemedlet (tabell 1, sats F5 och F7). Figur 3 undersökte effekten av olika oberoende parametrar på
3.5 Inverkan av oberoende parametrar på PDI(Y3)
Följande polynomekvation som visar påverkan av olika parametrar på PDI:
Here,variables like A,B, C,AB,AC,BC,A2,and C°had a significant effect on the PDI. At a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05)medan de återstående parametrarna visade sig vara signifikanta (s<0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabell 3). Den kvadratiska modellen (R=0.9991) ansågs vara den bäst anpassade modellen med en adekvat signal (tabell 4).
Från ekvation 5 anges att alla de tre oberoende parametrarna som ett läkemedelslipidförhållande, ytaktivt ämne och homogeniseringshastighet hade en positiv effekt på PDI. Den dominerande effekten berodde på homogeniseringshastigheten (koefficientvärde 0.048)följt av lipid(koefficientvärde 0.046) och minst var ytaktivt ämne (koefficientvärde 0,014). På grund av homogenisering blev den kinetiska energin i systemet något hög vilket orsakar kollision och aggregering av lipidnanopartiklar (tabell 1, batch F9 och F11). En hög koncentration av ytaktivt ämne producerade fler små partiklar som bildar en brygga med stora partiklar och därmed producerar ojämnhet som förstärker PDI. Ökning av lipidkoncentrationen vid en konstant nivå av ytaktivt ämne orsakade koagulering av partiklar vilket resulterade i en ojämn partikelstorleksfördelning. Figur 4 undersökte påverkan av olika oberoende variabler på PDI). Baserat på tre egenskaper, dvs partikelstorlek, infångningseffektivitet och PDI, ansågs satsen F9 vara en optimerad formulering med värdet av partikelstorlek, infångningseffektivitet och PDI 277,46 nm, 80,48 procent respektive 0,275.
3.6 Karakterisering av OLP-SLN
3.6.1 Utvärdering av partikelstorlek, PDI och zetapotential
Värdet på partikelstorlek, PDI och zetapotential för den optimerade satsen (F9) visade sig vara 277,46 nm, 0.282, (Fig. 5A), respektive -23.18 mV. Det lilla värdet av PDI(<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">cistanche dosering redditunder produktionen av Buspiron-laddade SLN för näsa till hjärnan. Både partikelstorlek och ytladdning är viktiga i fallet med nanopartikelläkemedelsleverans. Partikelstorleken mindre än 500 nm tros fly från fagocytosmekanismen inducerad av makrofager. Zetapotential i form av en negativ ytladdning (cirka -20 mV) är önskvärt för korrekt stabilitet hos nanoformuleringen. Det observerade värdet för zetapotential var -23.18 mV vilket indikerar god fysisk stabilitet
av SLNs spridning. En viktig roll för negativa ytnanopartiklar är deras attraktion till positivt laddade proteiner från skadade vävnader och hjälper till att reglera oxidationsprocessen." Den utvecklade optimerade formuleringen
(F9) uppfyllde både kriterierna för partikelstorlek och ytladdningar.
3.6.2 Morfologisk studie
Den optimerade satsen av utvecklade OLP-SLN(F9) indikerar den ungefärligen sfäriska formen som observerats av TEM-studien (Fig. 5B).
3.6.3 Infångningseffektivitet ( procent )
Infångningseffektiviteten för utvecklade partier av OPL SLN visade sig vara i intervallet 50.17-86.46 procent med 80,48 procent av optimerad formulering (F9) vilket indikerar en god läkemedelsfångningsförmåga hos utvecklade SLN. 3.6.4 Studie av differentiell scanningkalorimetri (DSC) Egenskaper som kristallinitet och termiskt beteende hos de utvecklade OLP-SLN:erna är viktiga egenskaper som säkerställer att de appliceras vid läkemedelstillförsel. DSC-termogrammet för OLP(läkemedel),lipid(compritol 888 ATO) och optimerad formulering(F9) representeras i fig. 6. Det termiska spektrumet för OPL visade en kort och bred endotermisk topp vid 65,23 grader men den gick upp till 100,96 grad . Compritol 88ATO visade en endotermisk topp vid 70,5 grader som liknade sin smältpunkt. Karakteristiktoppen för OLP saknades i termogrammet för optimerad formulering (F9). Här observerades endast en jämförelsevis bred topp runt 67,81 grader, vilket tyder på infångningen av OLP i lipidmatrisen som leder till bildandet av OLP-SLNs4.
3.6.5 Frisättning av läkemedel in vitro
Frisättningen av läkemedel från optimerad OLP-SLN-formulering (F9) visade sig vara 95,29±8,13 procent som visas i Fig. 7. Frisättningen från den optimerade formuleringen uppvisade en bi-
fasiskt mönster dvs. initial snabb frisättning (23,83±4,51 under första 1 timme) på grund av frisättning av ytabsorberat läkemedel och senare fördröjd (95,29±8,13 procent på 24 timmar) på grund av läkemedelsfrisättning från SLNs matris. Frisättningskinetiken för OLP-formoptimerad formulering detekterades genom att sätta de erhållna läkemedelsfrisättningsdata i de olika kinetiska modellerna som visas grafiskt i Fig. 8. Det maximala R²（0.9984）-värdet visade sig vara för den kinetiska modellen av första ordningen. Därför ansågs första ordningens kinetik vara den bäst anpassade modellen. Frigöringsmekanismen visade sig vara den Fickian diffusionstypen med värdet av frisättningsexponent(n)0.441.
3.6.6 Stabilitetsutvärdering
Under lämpliga förvaringsförhållanden förväntas alla utvecklade beredningsformer vara stabila fram till dess användningstid (utgångsdatum). Här lagrades den utvecklade optimerade OLP-SLN-formuleringen (F9) vid vissa lagringsförhållanden enligt specifikationen som tillhandahålls av ICH-riktlinjer. Formuleringen lagrad vid 4±2 grader (kylskåp) och rumsförhållanden (25±2 grader /60±5 procent RH) var inte signifikant (p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">
3.6.7 Antioxidantaktivitet
OLP:s huvudsakliga verkan är att förhindra peroxidation genom att rensa fria radikaler och bidra till att lindra skador orsakade av oxidativ stress. Som visas i fig. 9 uppvisade fri OLP 48,38±5.28 5 procent antioxidant, vilket är signifikant (p)<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">
Studien uppvisade den antimikrobiella potentialen hos utvecklade SLNs formuleringar av OLP(F9) mot bakterier som Staphylococcus aureus (Grams positiv) och Pseudomonas aeruginosa (Grams negativ) som visas i Fig. 10 Resultatet visade att det inte fanns någon hämningszon för blankformulering eftersom den var fri från OLP-extraktet.
Den maximala hämningszonen för positiv kontroll och fysisk blandning (OLP-extrakt plus blanka SLN) observerades inom de första 6 timmarna. Efter denna varaktighet (första 6 timmar), fanns det ingen förändring i zonen för hämning av positiv kontroll och fysisk blandning. Värdet på hämningszonen för positiv kontroll mot Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus var 7,5±1,25 mm respektive 8±1,30 mm. På liknande sätt visade sig värdet för hämningszonen för den fysiska blandningen (OLP-extrakt plus blanka SLN) mot Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus vara 8,25±1,9 mm respektive 8,60±2,1 mm. Å andra sidan uppvisade OLP-laddade SLN: er den antimikrobiella effekten under en längre tid (upp till 24 timmar) jämfört med fri OLP och fysisk blandning. Detta beror på den fördröjda frisättningen av OLP från SLNs formulering. Den antimikrobiella effekten av OLP-laddade SLN mot båda grampositiva
och gramnegativa bakterier observerades i upp till 24 timmar. Den antimikrobiella effekten av OLP-SLN var signifikant (s<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">
4. Slutsats
I denna studie omvandlades olivbladsextraktpulver som var mindre stabilt under normala miljöförhållanden framgångsrikt till en stabil SLNs-formulering. Den optimerade formuleringen uppvisade en lovande partikelstorlek, infångningseffektivitet samt ytladdningar. Den optimerade formuleringen uppvisade ett fördröjt läkemedelsfrisättningsmönster upp till 24 timmar efter den första ordningens läkemedelsfrisättningskinetiska och Fickian diffusionstyp av läkemedelsfrisättningsmekanism. Stabilitetsstudien utfördes och den optimerade formuleringen (F9) var stabil under de angivna lagringsförhållandena. OLP-formulering uppvisade en lovande antioxidantegenskap som motiverades av DPPH-analysmetoden. Den antimikrobiella aktiviteten mot grampositiva (Staphylococcus aureus) och gramnegativa (Pseudomonas aeruginosa) bakterier. Slutligen drogs slutsatsen att SLN kunde vara de lovande transportörerna för leverans av pulver av extrakt av olivblad.
Denna artikel är utdragen från J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)