DEL 1 Antioxidanter och antikoagulerande effekter av fenylpropanoidglykosider isolerade från kvastrapor (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria och P. Ramosa)
Mar 06, 2022
Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,
Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*
a University of Ło´d´z, Institutionen för allmän biokemi, fakulteten för biologi och miljöskydd, 90-236 Ł´od´z, Polen
b Institutionen för biokemi och växtkvalitet, Institutet för markvetenskap och växtodling, State Research Institute, 24-100 Puławy, Polen
Center for Research and Conservation of Biodiversity, Department of Environmental Biology, Institute of Biology, Jan Kochanowski University, 25-406 Kielce, Polen
Abstrakt
Holoparasitiska växter av Orobanchaceae, inklusiveCistanche, Orobanche och Phelipanche spp, är kända för sin rikedom av fenylpropanoidglykosider (PPG). Många PPG-föreningar har visat sig ha ett brett spektrum av aktiviteter, såsom antimikrobiella, antiinflammatoriska, antioxidanter och minneshöjande. För att bättre utforska bioaktivitetspotentialen hos europeiska kvastrapor (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) och tio enstaka isolerade fenylpropanoidbeståndsdelar, undersökte vi deras antiradikala verkan, skyddande effekt mot oxidation i plasma in vitro-system och påverkan på koagulationsparametrar. De testade extrakten visade en rensningsaktivitet på 50–70 procent av Trolox effekt. OC-extraktet, rikt påakteosid, hade över 20 procent bättre antiradikal potential än PR-extrakt som var det enda som innehöll PPG som saknade en B-ring katekoldel i acylenheten. Dessutom fann man att endast åtta testade PPG:er visade antioxidantpotential i human plasma behandlad med H2O2/Fe; emellertid hade de tre testade PPG:erna antikoagulerande potential förutom antioxidantegenskaper. Det verkar som om strukturen hos PPG, särskilt närvaron av acyl- och katekoldelar, huvudsakligen är relaterad till deras antioxidantegenskaper. Den antikoagulerande potentialen hos dessa föreningar är också relaterad till deras kemiska struktur. Utvalda PPGs uppvisar potentialen för behandling av hjärt-kärlsjukdomar associerade med oxidativ stress.
För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com
Cistanchetubulosa har många effekter
1. Introduktion
Oxidativ stress är allmänt känt för sin negativa inverkan på hälsan hos levande organismer, inklusive accelererat åldrande och vissa cancerformer. Förekomsten av oxidativ stress är associerad med en störd balans mellan de oxidativa och antioxidativa mekanismerna (inklusive enzymatiskt (katalas, glutationperoxidas) och icke-enzymatiskt (glutation) försvar) i kroppens celler [1]. Överproduktionen av reaktiva syrearter (ROS), inklusive oxiderande radikaler och slutna skalarter, är en av huvudmekanismerna bakom bildandet av oxidativ stress. Den biologiska effekten som orsakas av ROS beror dock till stor del på koncentrationen, exponeringstidpunkten och platsen. Under normala förhållanden (låg koncentration) kan syre/kväve-radikaler spela rollen som sekundära budbärare, men på högre nivå kan de börja reagera med biologiska strukturer, som cellmembran [2]. Bland alla ROS-arter orsakar en hydroxylradikal (HO.) en av de största skadorna på biomakromolekyler: proteiner, lipider och DNA. Oxidativ stress är känt för att spela en viktig roll i en rad sjukdomar, inklusive kardiovaskulära. Störningar i blodsystemet har korrelerats och/eller föregåtts av förändringar i olika parametrar för hemostas och plasmabiomarkörer [1,3].
Å andra sidan har många naturliga ämnen, såsom polyfenoler och fleromättade fettsyror, identifierats som potenta antioxidanter som kan förhindra bildning och/eller minska reaktiva syreämnen. Föreningar med sådana egenskaper finns i många livsmedelsprodukter och farmaceutiska preparat av vegetabiliskt ursprung. En kost berikad med färska grönsaker och frukter, och antioxidativa terapier baserade på naturliga antioxidanter, rekommenderas därför allmänt eftersom de kan minska nivån av oxidativ stress och förhindra olika patofysiologiska processer [4,5]. Växtpolyfenoler är en mångfaldig grupp av sekundära metaboliter, bland vilka fenolsyror intar en viktig plats, eftersom de är vitt spridda och uppvisar en mängd olika biologiska effekter, såsom antimikrobiella, antioxidanter och antiinflammatoriska. Fenylpropanoidglykosider (PPG) är estersläktingar till hydroxikanelsyra och de är den huvudsakliga/enda klassen av sekundära metaboliter som finns i holoparasitiska Orobanchaceae-växter, inklusiveCistanche, Orobanche och Phelipanche spp. Flera arter av denna familj är allvarliga skadedjur av grödor som bönder vill bli av med på fälten (exempel på Phelipanche ramosa), få används inom farmakologi, medan de flesta är av liten betydelse för människor. HerbaCistancheanvänds i stor utsträckning inom traditionell asiatisk medicin vid behandling av njurbrist och som ett immunitets- och minnesförstärkande, anti-aging och antitrötthetsmedel [6]. Fytokemiska analyser av olika forskargrupper har visat att fenylpropanoidglykosider, såsom acetonid, echinacoside och podiumside, är en av de viktigaste aktiva ingredienserna i Herba Cistanche [7]. En nyligen genomförd studie av flera kvastarter som hittats i Polen av Jedrejek et al. [8] har visat att detta växtmaterial har en liknande kvalitativ sammansättning (dominans av PPG), dessutom är det lika med eller till och med överstigerCistanchespp. när det gäller innehållet av verksamma ämnen [8].
Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer
Den föreliggande studien syftade till att utvärdera antiradikal- och antioxidantpotentialen, såväl som påverkan på hemostasparametrar av de tre rapsextrakten (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA och P. ramosa – PR) rika på olika fenyler. -
prostanoider, såväl som deras enskilda PPG-beståndsdelar. Antiradikalkapaciteten mättes med 2,2'-azinobis-3-etylbenstiazolin-6-sulfonsyra/Troloxekvivalent (ABTS/TE) och 2,2-difenyl-1-picrylhybrazil (DPPH) ) tester. Den oxidativa stressen i plasmatestsystemet inducerades med hjälp av en hydroxylradikal (H2O2/Fe), sedan mättes lipidperoxidation (tiobarbitursyrareaktiva species (TBARS)) och nivån av proteinkarbonyl- och tiolgrupper. Bland de bestämda parametrarna för hemostas var: aktiverad partiell tromboplastintid (APTT), protrombintid (PT) och trombintid (TT).
2. Material och metoder
2.1. Kemikalier
2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylradikal (DPPH), 2,2'-azinobis-3-etylbenstiazolin-6-sulfonsyra (ABTS), kaliumpersulfat, {{9 }}hydroxi-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboxylsyra (Trolox), dimetylsulfoxid (DMSO), tiobarbitursyra (TBA), myrsyra (LC-MS-kvalitet), och H2O2 köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Metanol (HPLC-gradientkvalitet) och acetonitril (LC-MS-kvalitet) förvärvades från Merck (Darmstadt, Tyskland). Tio fenyl-
propanföreningar testade i detta arbete, inklusive 2'-O-acetylakteosid (97 procent), 2'-O-acetylpoliumosid (98 procent), 3-O-metylpoliumosid (96 procent), acetonid (99 procent), arena inuti (97 procent), crenatosid (98 procent), teniposid (99 procent), poliumosid (99 procent), tubulosid A (96 procent) och wiedemanniosid D (96 procent) isolerades tidigare av oss från undergivna växtmaterial [ 8]. Renheten hos föreningar bedömdes med användning av en UHPLC-PDA-MS-analys. Ultrarent vatten framställdes internt med användning av ett Milli-Q vattenreningssystem (Millipore Co.). Andra reagenser var av analytisk kvalitet och tillhandahölls av inhemska kommersiella leverantörer.
2.2. Växtmaterial
Blommande växter av tre rapsarter, inklusive Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel och P. Ramos (L.) Pomel identifierades av prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski University, Kielce, Polen) och insamlad från en naturlig källa i Polen.
Voucherexemplar (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), xerotermisk gräsmark, parasitera Galium boreale, maj 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◗.5N), lo-samussland grassland, 8022◗.5N, p-samussland träda, parasitera Artemisia campestris, juni 2014;
P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), fält, parasitera Solanum Lycopersicum, september 2014) deponeras vid Jan Kochanowski-universitetets herbarium i Kielce (KTC). Växtmaterialet lyofiliserades och finmaldes före extraktion.
2.3. Beredning av kvastextrakt
Pulveriserat växtmaterial (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g och P. ramosa (PR) – 3 g) extraherades med 80 procent MeOH vid 40 ◦C och 1500 psi (lösningsmedelstryck ) med en ASE 200 accelererad
lösningsmedelsextraktor (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Extrakten indunstades och frystorkades (Gamma 2–16 LSC frystork, Christ, Tyskland). Extraktionseffektiviteten för OC, PA och PR var 55 procent, 37 procent respektive 43 viktprocent av växtmaterialet. På grund av det höga innehållet av kolhydrater (data visas inte), renades de råa extrakten ytterligare genom fastfasextraktion (SPE) på Oasis HLB-mikrokolonn (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Sockerarterna avlägsnades med 1 procent MeOH, sedan eluerades föreningar av intresse med 80 procent MeOH. Efter avlägsnande av lösningsmedlet lyofiliserades OC-, PA- och PR-extrakten (Gamma 2–16 LSC frystork), och utbytet av SPE-rening var 53 procent (OC), 67 procent (PA) och 51 procent (PR) .
2.4. Fytokemiska egenskaper hos extrakt av kvastraper
Kvalitativa och kvantitativa analyser av rapsextrakt utfördes med användning av ett ACQUITY UPLC-system (Waters) kopplat till en fotodiod array detektor (PDA) och en tandem kvadrupol masspektrometer (TQD-MS/MS). Frystorkade OC-, PA- och PR-extrakt löstes i 50 procent metanol i en koncentration av 0,50 mg/ml och sedan
kromatograferades på BEH C18-kolonn (100 x 2,1 mm, 1,7 µm, vatten). Kromatografiska förhållanden var följande: ugnstemperatur – 25 ◦C,
linjär gradient 10→25 procent av mobil fas B (0,1 procent myrsyra i acetonitril) i mobil fas A (0,1 procent myrsyra i H2O) över 12 min, flödeshastighet – 0,4 mL/min, injektionsvolym – 2 μL, UV-område – 190–490 nm (3,6 nm upplösning). MS-analysen utfördes i negativt jonläge med elektrosprayjonisering (ESI), med följande inställningar: skanningsområde 100–1200 m/z; kapillärspänning 2,8 kV; konspänning 35 V;
källtemperatur 150 ◦C; upplösningstemperatur 450 ◦C; ödeläggelse
gasflöde 900 L/h, och kongasflöde 100 L/h. Datainsamling och bearbetning utfördes med hjälp av programvaran Waters MassLynx 4.1.
Toppar för fenylpropanoidglykosid (PPG) identifierades genom jämförelse av de erhållna LC-MS-data med de från tidigare isolerade föreningar [8]. Kvantifiering av PPG i kvastextrakt baserades på UPLC-UV-metoden med detektion vid 330 nm och en extern standardkalibrering med hjälp avakteosid(Sigma-Aldrich, 99 procent, HPLC) som
gruppstandard. En linjär kalibreringskurva framställdes i sex koncentrationer inom intervallet 1–200 ug/mL och visade god linjäritet (R2
0.999). Kvantitativa resultat representerar det genomsnittliga SD-värdet för tre injektioner och uttrycktes som milligramakteosidekvivalenter (ekv) per gram extrakt (mgakteosidekv/g).
2.5. Antiradikal aktivitet in vitro
2.5.1. ABTS radical scavenging assay
ABTS antiradikaltestet utfördes med användning av metoden som beskrivs av Kontek et al. [9], med små modifieringar enligt följande: 20 procent MeOH användes för att framställa reagens (7 mM ABTS och 4,9 mM kalium per-
sulfat); Lösningarna av OC-, PA- och PR-extrakt, vid fyra koncentrationsnivåer i intervallet 100–400 ug/mL, och Trolox-lösningar, vid sex koncentrationsnivåer i intervallet 10 250 ug/ml, bereddes med 50 procent MeOH. Andelen prov till ABTS arbetslösning var 1:25 (v/v). Absorbansen vid 734 nm mättes efter 30 min inkubation
i mörker med en UV-vis spektrofotometer (Evolution 260 Bio,
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
Absorbansinhiberingen (procent) beräknades enligt följande: [(Absecon-
trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.
Trolox-ekvivalenterna (TE) för kvastextrakten beräknades
med formeln TE=msample/mstandard, där m är lutningen på raksträckan
linjekurvor (absorbanshämning vs. koncentration). TE-värdet på
provet beskriver dess normaliserade aktivitet mot Trolox (TEstandard =
1.0). IC50-värdena för OC-, PA- och PR-extrakt och Trolox var
nås experimentellt och beräknades sedan från deras räta linje
kurvor (absorbanshämning vs. koncentration) och uttrycks i
ug/ml.
Analysen utfördes i tre exemplar och resultaten presenteras
som medel ± standardavvikelser (SD).
2.5.2. DPPH-radikalavlägsnande analys
DPPH-antiradikaltestet utfördes med användning av metoden beskriven av Jedrejek et al. [8] och Brand-Williams et al. [10], med små modifieringar enligt följande: lösningarna av OC-, PA- och PR-extrakt, vid fyra koncentrationsnivåer i intervallet 50▽ 250 ug/mL, och Trolox-lösningar, vid sex koncentrationsnivåer i intervallet 10▽ 250 ug/ml, framställdes med 50 procent MeOH. Proportionen av prov till DPPH var 1:19 (v/v). Absorbansen vid 517 nm mättes efter 30 minuters inkubation i mörker med en UV-vis spektrofotometer (Evolution 260 Bio). Absorbanshämningen (procent) beräknades enligt följande: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Trolox-ekvivalenten (TE) och IC50-värdena för testprover beräknades på samma sätt som i ABTS-testet (avsnitt 2.5.1). Analysen utfördes i triplikat och resultaten presenteras som medelvärden ± SD.
2.6. Stamlösningar av testade växtföreningar och extrakt för experiment med human plasma
Stamlösningar av de testade föreningarna och växtextrakten framställdes i 50 procent DMSO. Den slutliga koncentrationen av DMSO i de testade proverna var lägre än 0,05 procent och dess effekter bestämdes i alla experiment.
2.7. Mänsklig plasmaisolering
Mänskligt blod, eller plasma, erhölls från sex vanliga givare (icke-rökare män och kvinnor) till en blodbank (Lodz, Polen) och ett medicinskt center (Lodz, Polen). Blod uppsamlades som en CPD-lösning (citrat/fosfat/dextros; 9:1; v/v blod/CPD) eller CPDA-lösning (citrat/fosfat/dextros/adenin; 8,5:1; v/v; blod/CPDA). Givarna hade inte tagit några läkemedel eller beroendeframkallande substanser (inklusive tobak, alkohol och antioxidanttillskott) under minst två veckor före en donation. Vår analys av blodproverna utfördes enligt riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen för humanforskning och godkändes av kommittén för etik av forskning inom mänskliga experiment vid universitetet i Lodz. Plasma framställdes genom centrifugering av färskt humant blod vid 4500 x g under 25 minuter vid rumstemperatur. Proteinkoncentrationen beräknades genom att mäta absorbansen av de testade proverna vid 280 nm, enligt proceduren av Whitaker och Granum [11].
2.8. Markörer för oxidativ stress i mänsklig plasma
2.8.1. Lipidperoxidationsmätning
Plasmalipidperoxidation kvantifierades genom att mäta koncentrationen av tiobarbitursyrareaktiva substanser (TBARS). TBARS-koncentrationen beräknades med användning av den molära extinktionskoefficienten (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Metoden beskrivs mer ingående annars var [12,13]. 2.8.2. Karbonylgruppsmätning Nivån av karbonylgrupper beräknades med hjälp av den molära extinktionskoefficienten (ε=22,000 M 1 cm 1 ) och uttrycktes som nmol karbonylgrupper/mg plasmaprotein, enligt Bartosz [ 13] och Levine et al. [14]. 2.8.3. Tiolgruppsbestämning Tiolgrupphalten i plasmaproteiner mättes spektrofotometriskt med en SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Tyskland) genom absorbans vid 412 nm med 5,5'-ditiol-bis-(2- nitrobensoesyra). Metoden beskrivs närmare på annan plats [15–17].
2.9. Parametrar för hemostas
2.9.1. Mätning av protrombintid (PT)
PT bestämdes koagulometriskt med användning av en optisk koagulering
Bokstäver anger resultaten av Tukeys test (p < 0.05), värden med samma
bokstav inom en rad skiljer sig inte nämnvärt.
2.9.2. Mätning av trombintid (TT)
TT bestämdes koagulometriskt med användning av en optisk koagulationsanalysator (modell K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polen), enligt metoden som beskrivs av Malinowska et al. [18].
2.9.3. Mätningen av aktiverad partiell tromboplastintid (APTT)
APTT bestämdes koagulometriskt med hjälp av en K-3002 Optic Coagulation Analyzer (Kselmed, Grudziadz, Polen) enligt Mali now ska et al. [18].
2.10. Dataanalys Q-Dixon-testet utfördes för att eliminera osäkra data.
Data testades för normalfördelning med Shapiro-Wilk-testet och varianslikhet med Levenes test. Statistiskt signifikanta skillnader identifierades med ANOVA, följt av Tukeys multipla jämförelsetest eller Kruskal-Wallis test. Jämförelser ansågs signifikanta vid p < 0.05.="" värdena="" presenteras="" som="" medelvärden="" ±="">
