Del 1: Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosiders inducerar apoptos av hepatocellulära karcinomceller och förbättrar antitumöreffekten

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1 och Jinyao Li, PhD1

Abstrakt

Cistanche tubulosa är en typ av kinesisk örtmedicin och utövar olika biologiska funktioner. Tidigare studier har visat detCistanche tubulosa fenyletanoidglykosider(CTPG) uppvisar antitumöreffekter på en mängd olika tumörceller. Men antitumöreffekterna av CTPG på HepG2 och BEL-7404 hepatocellulära karcinomceller (HCC) är fortfarande svårfångade. Vår studie visade att CTPG signifikant hämmade tillväxten av HepG2- och BEL-7404-celler genom induktion av cellcykelstopp och apoptos, vilket var associerat med aktiveringen av MAPK-vägar karakteriserade av den uppreglerade fosforyleringen av p38, JNK, och ERK1/2 och mitokondrieberoende väg som kännetecknas av minskningen av mitokondriell membranpotential. Frisättningen av cytokrom c och klyvningen av kaspas-3, -7, -9 och PARP ökades därefter med CTPG-behandling. Dessutom undertryckte CTPG migrationen av HepG2 avsevärt genom att minska nivåerna av matrismetalloproteinas-2 och vaskulära endoteltillväxtfaktorer. Intressant nog ökade CTPG inte bara spridningen av splenocyter utan minskade också apoptosen av splenocyter inducerade av cisplatin. I H22-tumörmusmodellen hämmade CTPG i kombination med cisplatin tillväxten av H22-celler ytterligare och minskade biverkningarna av cisplatin. Sammantaget hämmade CTPG tillväxten av HCC genom direkt antitumöreffekt och indirekt immunförstärkande effekt, och förbättrade antitumöreffekten av cisplatin.

NyckelordCistanche tubulosa fenyletanoidglykosider, apoptos, MAPK-väg, mitokondrieberoende väg, cisplatin, immunförstärkning

Cistanche har antitumöreffekten.

Klicka för att Cistanche produkter och Cistanches

Introduktion

Levercancer förutspåddes vara den sjätte vanligaste cancerformen och den fjärde vanligaste orsaken till cancerdöd i världen 2018, med cirka 841 000 nya fall och 782 000 dödsfall årligen i sydöstra Asien (Mongolien, Kambodja och Vietnam) .1 I Kina var levercancer den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död 2015.2 Mer än 90 procent av primär levercancer är hepatocellulärt karcinom (HCC) över hela världen. För närvarande är hepatektomi, levertransplantation och perkutan ablation de viktigaste metoderna för behandling av HCC. Tyvärr är dessa behandlingar effektiva för 30 procent av patienter som diagnostiserats med tidig levercancer, medan patienter som diagnostiserats med avancerad levercancer (som står för 40 procent) måste förlita sig på palliativ behandling för att förlänga sin överlevnadstid.3,4 Sorafenib i kombination med lever arteriell kemoembolism är en viktig och vanlig palliativ behandling för de flesta patienter med avancerad HCC i Asien-Stillahavsområdet.5 Sorafenib, godkänd av FDA 2006 för behandling av avancerad levercancer, är en multipel kinashämmare som hämmar tumörcellsproliferation och vaskulär produktion och främjar tumörcellapoptos. Sorafenib förlänger patientens överlevnadstid avsevärt med 3 till 5 månader men har allvarliga biverkningar och är nära relaterat till förekomsten av läkemedelsresistens.6 Därför är det angeläget att utveckla nya läkemedel eller strategier för HCC.

Traditionell kinesisk medicin (TCM) ensam eller i kombination med andra strategier har använts för att behandla HCC och har visat kliniska fördelar inklusive förlängd överlevnadstid, förbättrad livskvalitet, minskade biverkningar och så vidare.7,8Cistancheär en TCM som innehåller fenyletanoidglykosider (PhG), iridoider, lignin och polysackarider som har olika biologiska funktioner, såsom antioxidation, anti-inflammation, anti-aging, minnesförbättring och immunförstärkande funktioner.9 PhG har ansetts vara de viktigaste aktiva komponenterna i Cistanche och har flera funktioner inklusive antioxidation, antiinflammation, anti-apoptos, leverskydd och neuroprotection.10-12 Vår grupp hade rapporterat attCistanchetubulosa fenyletanoidglykosider(CTPG) skulle kunna hämma tillväxten av melanom B16-F10-celler, esofaguskarcinom Eca-109-celler och HCC H22-celler genom yttre eller inre signalvägar in vitro eller in vivo; dessutom hade CTPG en immunstimulerande effekt.13-15

I denna studie undersökte vi antitumöreffekten och mekanismen för CTPG på HepG2- och BEL-7404-celler in vitro, analyserade den immunmodulerande funktionen av CTPG in vitro och in vivo, och utvärderade vidare den terapeutiska effekten av CTPG i kombination med kemoterapin läkemedel cisplatin på HCC H22 tumörmöss in vivo. Vi fann att CTPG kunde hämma tillväxten av HepG2- och BEL-7404-celler genom mitokondrieberoende apoptos och MAPK-signalvägen. CTPG hämmade signifikant migrationen av HepG2-celler genom att minska nivåerna av matrismetalloproteinas-2 (MMP-2) ​​och vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF). Dessutom främjade CTPG spridningen och aktiveringen av immunceller och förbättrade immuniteten hos möss. Viktigt är att CTPG i kombination med cisplatin ytterligare kan hämma tillväxten av H22-celler in vivo och minska biverkningarna av cisplatin.

Cistanche ökar immuniteten.

Material och metoder

Djur

Ungefär 6 till 8 veckor gamla BALB/c-hanmöss, Kunming-möss och C57BL/6-möss av honkön köptes från Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina) och inhystes i en djuranläggning vid Xinjiang University med rumstemperatur (RT) på 25±3 grader och en 12/12 timmars ljus-mörker period.

Cellinjer och cellkultur

De murina H22-cellerna köptes från Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Kina) och humana HCC HepG2- och BEL-7404-celler erhölls från Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Kina) och odlat i RPMI 1640 medium (Gibco, USA) eller Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) (Gibco) innehållande 10 procent värmeinaktiverat fetalt bovint serum (MRC, Kina), 1 procent L- glutamin (100 mM), 100 U/mL penicillin och 100 ug/mL streptomycin vid 37 grader i en fuktad atmosfär med 5 procent CO2.

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC)

Huvudföreningarna i CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Kina) kvalificerades och kvantifierades med HPLC som tidigare rapporterats.13 En ZORBAX SB-C18-kolonn (250×4,6 mm; 5μm) användes och den mobila fasen bestod av 0,2 procent myrsyralösning och metanol med en gradient från 23 procent till 31 procent. Totalt 10 μL prov injicerades och detekterades vid 330 nm. Echinakosid- och acteosidstandarderna (Yuanye, Shanghai, Kina) användes för att analysera komponenterna i CTPG.

echinakosid

Analys av cellviabilitet

Antitumöreffekterna av CTPG på HepG2- och BEL-7404-celler utvärderades med MTT (3-(4, 5-dimetyl-2-tiazolyl)-2, {{7 }}difenyl-2-H-tetrazoliumbromid). HepG2- och BEL-7404-celler ströks ut på 96-brunnsplattor (5 × 104 celler/brunn) och behandlades med 0, 200, 400 och 600 ug/mL CTPG under 24 respektive 48 timmar efter 24 timmars inkubation vid 37 grader. Cirka 35 ug/ml cisplatin (Yuanye) användes som en positiv kontroll. Sedan sattes 100 μL MTT (0,5 mg/ml, utspädd med medium utan FBS-medium) till varje brunn och odlades i 3 timmar vid 37 grader och 5 procent CO2. Efter inkubation centrifugerades plattorna vid 1200 rpm under 7 minuter, mediet avlägsnades och 200 ug/ml DMSO sattes till varje brunn för att lösa upp de bildade formazankristallerna. OD490-värdena mättes med en 96-brunnsmikroplattläsare (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). För att utvärdera effekterna av CTPG på splenocyter, isolerades cellerna från C57BL/6-möss och ströks ut i 96-brunnsplattor med en densitet av 1 × 105 celler/brunn. Splenocyter behandlades med 0, 200, 400 och 600 ug/ml under 24, 48 respektive 72 timmar. Cellviabiliteten beräknades enligt följande formel: Cellviabilitet (procent)=(ODbehandlad/ODobehandlad) × 100 procent.

Detektering av Ki-67

Detektion av Ki{{0}} gjordes enligt vår tidigare studie.16 Kortfattat behandlades BEL-7404-celler med olika koncentrationer (0, 200, 400 och 600 ug/mL) av CTPG eller cisplatin (35 ug/ml). Efter 24 timmar skördades cellerna och tvättades med PBS, fixerades sedan och permeabiliserades med Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Intracellulär färgning utfördes med FITC-konjugerad Ki-67-antikropp (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) under 15 minuter vid RT. Proverna analyserades med flödescytometri (BD FACSCalibur, CA, USA).

Analys av cellapoptos och cellcykel

HepG2- och BEL-7404-celler såddes med en densitet av 2,5 x 105 celler/skål och inkuberades vid 37 grader över natten. Celler trypsiniserades och skördades genom centrifugering efter behandling med olika koncentrationer av CTPG eller förbehandlades med kaspasinhibitor (Z-VAD-FMK) eller kaspas-3-hämmare (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kina) i 2 timmar innan CTPG-behandling. Efter 24 timmar detekterades apoptos med flödescytometri. I korthet tvättades de insamlade cellerna med kall PBS (Gibco) och återsuspenderades i annexinbindande buffert med 2,5 μL Annexin V-FITC och 5 μL PI-PE-färgningslösning (Solarbio, Peking, Kina), och sedan inkuberades cellerna vid RT i mörker i 15 minuter. För analys av cellcykelfördelningen skördades cellerna efter CTPG-behandling och fixerades i kall 70 procent etanol vid 4 grader i 30 minuter. Celler färgades med PI (BD Biosciences) i mörker under 30 minuter. Prover analyserades med flödescytometer (BD FACSCalibur). Uttrycksnivåer av cellapoptos och cykelrelaterade proteiner detekterades med Western blot.

Western Blot

Western blot gjordes enligt vår tidigare studie.17HCC behandlades med CTPG i 24 timmar. Efter tvättning med iskall PBS två gånger samlades alla vidhäftande och flytande celler upp och lyserades i RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) i 20 minuter på is. Efter centrifugering vid 12000 rpm 4 grader under 10 minuter, bestämdes proteinkoncentrationen med användning av ett Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Samma koncentration av proteiner separerades med 12 procent SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran. Efter tvättning med PBST-buffert (PBS med 0,05 procent Tween-20) blockerades membranen med 5 procent fettfri mjölk vid 37 grader i 1 timme och inkuberades sedan med de primära antikropparna (Cell Signaling Technology, MA, USA) vid lämpliga utspädningar över natten vid 4 grader. Efter tvättning 3 gånger med PBST inkuberades membranet med motsvarande HRP-konjugerade sekundära antikroppar (eBioscience) i 2 timmar vid 37 grader. Målproteinerna detekterades med användning av ett ECL-analyskit (Beyotime). Gråskaleskanningsdata erhölls av Image J.

Analys av mitokondriell membranpotential (Δψm)

Δψm bestämdes med membranpermeabelt JC-1-färgämne (Beyotime). Kortfattat behandlades HepG2- och BEL-7404-celler med olika koncentrationer av CTPG (0, 200, 400 och 600 ug/ml) under 24 timmar. Alla celler samlades upp och tvättades med JC -1 tvättbuffert. Celler färgades med JC-1 fluorescerande sonden enligt tillverkarens instruktioner i 20 minuter vid RT. Efter tvättning med PBS två gånger analyserades alla prover med flödescytometri (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 Infärgning

Hoechst 33342-färgning gjordes enligt vår tidigare studie.16 De morfologiska förändringarna av kärnor undersöktes med användning av membranpermeabelt DNA-bindande färgämne Hoechst 33342 (Beyotime). I korthet inokulerades cellerna i en 6-brunnsplatta i koncentrationen 1 x 105 celler/brunn i 2 ml medium. När man nådde 70 till 80 procent sammanflöde behandlades cellerna med 200, 400 och 600 ug/ml CTPG eller cisplatin under 24 timmar. Cellerna tvättades med PBS och fixerades med 4 procent iskall paraformaldehyd vid 4 grader i 10 minuter. Efter tvättning med PBS färgades cellerna med Hoechst 33342 vid 4 grader under 10 minuter. Prover observerades med inverterat fluorescensmikroskop (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).

cistancheextrakt

Migrationsanalys

HCC-cellmigrering detekterades genom sårläkningsanalysen. I korthet såddes HepG2-celler (2×104/brunn) i en 24-brunnsplatta. Efter att ha nått 80 procent sammanflöde, repades mitten av varje brunn en gång med en 20 μL pipettspets. Efter tvättning med PBS behandlades cellerna med cisplatin (35 ug/ml) eller olika koncentrationer (0, 200, 400 och 600 ug/mL) av CTPG vid 37 grader. Efter 24 timmar togs bilder av varje prov under ett mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E). De genomsnittliga avstånden för cellmigrering analyserades med bild J. Procentandelen av sårläkning beräknades med ekvationen: sårläkning ( procent )=(1−skraparea vid angiven tidpunkt/skraparea vid 0 timmar)×100 procent . Uttrycksnivåer av cellmigreringsrelaterade proteiner MMP-2 och VEGF detekterades med Western blot.

Spridning och apoptos av splenocyter

För proliferationsanalys isolerades splenocyter från 3 C57BL/6-möss och färgades med CFSE (eBioscience). CFSE-märkta celler inokulerades i 24-brunnsplattor med en täthet av 2 × 106 celler i 1 ml medium per brunn och behandlades med olika koncentrationer av CTPG (200, 400 och 600 ug/mL) eller kombinerades med 35 ug /ml cisplatin i 72 timmar. Flödescytometrianalys utfördes efter färgning med CD3-APC och CD19-PE (BD Biosciences). För apoptosanalys inokulerades splenocyter i 24-brunnsplattor med en täthet av 2 × 106 celler i 1 ml medium per brunn och behandlades med olika koncentrationer av CTPG (200, 400 och 600 ug/mL) eller kombinerades med cisplatin i 24 timmar. Flödescytometrianalys utfördes efter färgning med 2,5 μL Annexin V-FITC och 5 μL PI-PE-lösning.

Säkerhetsutvärdering och immunstimulerande aktiviteter av CTPG in vivo

För att utvärdera de in vivo immunstimulerande aktiviteterna av CTPG, delades Kunming hanmöss på 6 till 8 veckor slumpmässigt in i 7 grupper (5 möss/grupp). Subkutan injektion (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneal injektion (ip, 200, 400 mg/kg) och intragastrisk administrering (ig, 200, 400 mg/kg) applicerades varannan dag i totalt 7 gånger , medan kontrollgruppen inte fick någon behandling. Mössen har vägt varannan dag och mössens status observerades varje dag. Efter CTPG-behandling separerades mössens organ och vägdes. Organindexen beräknades enligt formeln: organindex=organvikt (mg)/kroppsvikt (g). Splenocyterna samlades in, räknades och färgades med anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC eller anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Prover detekterades med flödescytometri (BD FACSCalibur).

Antitumöreffektivitet av CTPG kombinerat med cisplatin i H22-tumörbärande möss Cirka 6 till 8 veckor gamla BALB/c-möss av hankön injicerades subkutant med H22-celler (1,0 × 106 per mus i 100 μL PBS). När tumörvolymerna nådde cirka 60 mm3 delades tumörbärande möss slumpmässigt in i 4 grupper (6 möss/grupp) och behandlades med cisplatin (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatin (4 mg/kg) plus CTPG ( 400mg/kg), eller utan behandling (kontrollgrupp), respektive. Tumörmöss injicerades intraperitonealt med CTPG på den 5:e, 7:e, 9:e, 11:e respektive 13:e dagen. Cisplatin injicerades intravenöst på den 7:e och 11:e dagen. Tumörvolymen och kroppsvikten mättes varannan dag. Tumörvolymen beräknades enligt följande: Tumörvolymen (V)=a × b2/2, där a och b representerar den längsta och kortaste diametern av en tumör uppmätt med nockmått respektive. På den 20:e dagen isolerades och vägdes organ och tumörer. Splenocyterna samlades in, räknades och färgades med anti-CD3-APC och anti-CD19-PE eller anti-CD4-FITC och anti-CD8-APC eller anti-CD11b-PE och anti-Gr-1-APC eller anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC och anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Därefter analyserades frekvenserna och antalet celler med flödescytometri (BD FACSCalibur).

Cistanche förstärker antitumöreffekten och förbättrar immuniteten.

För mer information, klicka på bilden.

Statistisk analys

Alla data uttrycktes som medel ± standardfel av medelvärdet (SEM). Statistisk analys utfördes med användning av en/två-vägs variansanalys (ANOVA) med programvaran Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">

KLICKA HÄR FÖR DEL 2